基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型的构建方法

摘要

本发明涉及一种基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型的构建方法，包括限定藻细胞磷吸收过程的能量代谢包括磷的转运、磷的同化和磷的储存三个环节，综合三个环节的化学反应式，得到藻类磷吸收过程的总反应式，结合线性非平衡热力学函数J＝L·X，磷营养通量J的改变由藻类磷吸收过程总反应的吉布斯自由能变化ΔG推动，未涉及的其他影响因素由线性系数L表征，得到模型表达式。从对藻类磷吸收现象层面的关注转移到细胞能量代谢层面，结合藻类细胞磷转运、同化和储存的重要生理过程，遴选磷在细胞内部的主要物质归宿为三磷酸腺苷(ATP)和聚合磷酸盐(PolyP)，基于热力学函数建立磷营养通量与环境磷浓度的数学关系。

说明书

技术领域

本发明涉及藻类生理学、生物热力学、生态化学计量学等研究领域，特别是涉及一种基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型的构建方法。

背景技术

磷是水体中藻类种群和密度的第一限制性营养元素，根据世界经合组织(ODEC)的研究表明，80％的湖泊富营养化是受磷元素的制约。同时，磷在藻细胞代谢中起着极为重要的作用。藻类磷吸收过程是细胞膜主动运输的过程，环境中磷进入细胞后通过光合作用获得能量并转化为三磷酸腺苷(ATP)，作为藻细胞代谢活动的能量来源；而ATP可在聚合磷酸盐合成酶(PPK)的作用下形成聚合磷(PolyP)，作为藻类细胞的营养物存储。因此，胞内磷通过氧化磷酸化和去磷酸化作用调节着藻细胞的能量代谢过程，能量代谢是认识藻类磷营养限制的核心和本质。生物热力学方法是用于描述细胞中能量吸收、转化和储存的定量工具，可将环境中磷浓度与藻细胞的能量代谢联系起来。

磷营养通量模型的主要构建难点在于：藻类的磷吸收过程并不单纯的受环境中磷浓度的影响，因为藻类会根据细胞营养状态和能量转化来调节细胞膜主动运输的能力，故藻类磷吸收受环境磷浓度与细胞磷含量的共同影响。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种从细胞能量代谢角度定量描述藻类磷营养通量数学关系的构建方法。该方法建立在藻细胞磷转运、同化和储存的能量分析基础上，通过明确细胞能量物质和营养储存物质的关键生理过程，得到藻细胞磷吸收过程的总反应，采用热力学函数建立环境磷浓度与营养通量之间的数学关系式，以定量分析不同营养状态的藻细胞受环境磷浓度约束的能量水平。

该模型构建的目的在于解决以下问题：采用热力学定量的方法对藻类磷吸收过程的总反应式进行有效表达，确保运用该方法构建的数学关系可反映藻细胞对环境磷浓度变化的生理响应。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型的构建方法，限定藻细胞磷吸收过程的能量代谢包括磷的转运、磷的同化和磷的储存三个环节，综合三个环节的化学反应式，得到藻类磷吸收过程的总反应式，结合线性非平衡热力学函数J＝L·X，磷营养通量J的改变由藻类磷吸收过程总反应的吉布斯自由能变化ΔG推动，未涉及的其他影响因素由线性系数L表征，得到磷营养通量模型，利用该模型反映藻细胞对环境磷浓度变化的生理响应。

在本发明的一些实施例中，得到磷营养通量模型表达式为：

J＝L(logK_p[P_e]+nΔpH)(7)；

P_e表示环境中磷浓度，从环境中检测得到，单位nmol/L，J为磷营养通量，L为模型系数，K_p为环境中磷经跨膜转运、胞内转化生成PolyP的平衡常数，ΔpH为H⁺迁移形成的pH梯度，n为迁移的H⁺数目。从物理意义上说，磷营养通量表示藻细胞在单位时间所吸收的磷营养物质的量。单位不唯一，因为藻细胞生物量可用叶绿素a浓度(chla，μg/L)、细胞密度(CellD，个/L)、细胞干重(DW，mg/L)等指标进行表征，本发明的实施例采用叶绿素a浓度来表征藻细胞生物量，故J单位为μmol·(μgchla·h)^–1，根据单位换算，作图时也采用μmol·(mgchla·min)^–1或μmol·(mgchla·h)^–1表示。模型中K_p、nΔpH参数是热力学方法推导的要素，具有其本身的化学意义，但本发明不对其进行细胞分子层面的测定，关键是把握宏观磷营养盐与藻类吸收的关系，故测定指标仅包括胞外磷浓度和藻细胞生物量。J通过具体实验，作图计算得到。

在本发明的一些实施例中，磷的转运过程的化学反应方程式为：

P_i表示胞内磷浓度，单位nmol/L；

磷的同化过程的化学反应方程式为：

磷的储存过程的化学反应方程式为：

综合式(1)、式(2)和式(3)，得到藻类磷吸收过程的总反应式为：

在本发明的一些实施例中，吉布斯自由能变化的热力学函数ΔG＝-RTlnK[S]/[P]，推动力X的表达式为：

R为气体常数，8.314J·mol^–1·K^–1

T为热力学温度，K

X在线性非平衡热力学中的物理意义为“推动力”，能量单位J

分别表示藻细胞内囊体膜内外的质子浓度，不进行测定，仅为公式推导需要。

在本发明的一些实施例中，将式(5)中的ln替换为log，lnN＝2.3logN，变换得到：

式(6)变换得到所述式(7)。

在本发明的一些实施例中，藻类的磷营养通量为零时，(logK_p+nΔpH)＝-log[P_e]_o，得到定态能量下的磷通量模型：

J＝L(log[P_e]-log[P_e]_o)(8)

J为磷营养通量；L为模型系数；[P_e]_o为判断阈值；

通过比较环境中磷营养浓度与阈值[P_e]_o的大小，判别藻细胞是否处于磷营养限制水平。

综上所述，本发明从对藻类磷吸收现象层面的关注转移到细胞能量代谢层面，结合藻类细胞磷转运、同化和储存的重要生理过程，遴选磷在细胞内部的主要物质归宿，具体为三磷酸腺苷(ATP)和聚合磷酸盐(PolyP)，基于热力学函数建立磷营养通量与环境磷浓度的数学关系,反映藻细胞对环境磷浓度变化的生理响应。

附图说明

为了使本发明专利的目的、构建步骤和有益效果更加清楚，本发明专利提供如下附图进行说明：

图1为本发明提供的一种基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型构建流程图。

图2为本发明提供的图1中一种基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型构建流程说明图。

图3为本发明提供的藻类细胞磷营养通量模型的三个能量代谢环节示意图。

图4为本发明实施例中磷营养通量与log[P_e]的线性关系图。

图5为本发明实施例中不同生长速率下磷营养通量与log[P_e]的线性关系图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所阐释的内容清晰地了解本发明的其他优点与功能。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的理念下进行相关修饰或改变。

本发明限定藻细胞磷吸收过程的能量代谢仅包括磷的转运、磷的同化和磷的储存三个环节，图1为基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型构建流程图，图2为本发明提供的图1中一种基于藻类细胞能量代谢的磷营养通量模型构建流程说明图，图3为本发明提供的藻类细胞磷营养通量模型的三个能量代谢环节示意图。首先，环境中磷通过细胞膜转运至细胞内部，然后胞内磷经同化作用与二磷酸腺苷(ADP)转化为ATP，最后ATP合成聚合磷(PolyP)完成磷的储存，具体为：1)环境中磷(P_e)经细胞膜运输至胞内的转运过程[式(1)]，2)胞内磷(P_i)转化为三磷酸腺苷(ATP)的光合磷酸化过程[式(2)]，3)ATP合成聚合磷酸盐(PolyP)分子的磷酸根转移过程[式(3)]，得到的过程总反应式[式(4)]。

过程①，相应的跨膜转运过程的化学反应方程式为：

过程②，相应的光合磷酸化过程的化学反应方程式为：

过程③，相应的磷酸根转移过程的化学反应方程式为：

统一组织上述三个化学反应式后，得到的藻类磷吸收过程的总反应式为：

本发明涉及的磷营养通量(J)的改变，是由上述总反应的吉布斯自由能变化(ΔG)推动，因此该能变是引起磷营养物质迁移的推动力(X)，本发明未涉及的其他影响因素由线性系数(L)表征。结合吉布斯自由能变化的热力学函数ΔG＝-RTlnK[S]/[P]，R为气体常数，8.314J·mol^–1·K^–1；T为热力学温度，单位K；K为平衡常数，推导需要，不进行测定；S为反应物浓度，单位mol/L；P为生成物浓度，单位mol/L。得到推动力X的表达式[式(5)]，再结合线性非平衡热力学函数J＝L·X，得到模型表达式[式(7)]：

将上式ln替换为log，lnN＝2.3logN：

J＝L(logK_p[P_e]+nΔpH)(7)

式中，J为磷营养通量，L为模型系数，K_p为环境中磷经跨膜转运、胞内转化生成PolyP的平衡常数，ΔpH为H⁺迁移形成的pH梯度，n为迁移的H⁺数目。

模型应用

假设条件：对本发明所得的线性磷营养通量模型进行能量的定态假设。该假设下，一定营养状态的藻类细胞处于磷绝对限制状态，此时细胞膜对磷的主动运输能力受吉布斯自由能约束，若要激发吸收行为则需通过提高环境磷浓度来实现。

模型结构：在上述假设条件下，环境磷浓度处于绝对限制水平且藻类磷营养通量为零。将限制性磷浓度记为[P_e]_o，代入模型中得到(logK_p+nΔpH)项等于-log[P_e]_o，得到定态能量下的磷通量模型。

J＝L(log[P_e]-log[P_e]_o)(8)

判别形式：以J为y轴，log[P_e]为x轴进行作图，可得到一条直线，x轴的截距即为磷限制浓度。(1)P_e＞[P_e]_o，当环境中磷浓度超过渗透阈值时，藻细胞即启动吸收系统，使磷快速地积聚在细胞膜边界并完成胞外至胞内的转运过程，进而以聚合磷酸盐的形式储存；(2)P_e≤[P_e]_o，当环境中磷浓度低于阈值水平时，环境与藻细胞之间不存在磷营养物质的迁移。

实验实施：本实验以蓝藻为研究对象，蓝藻是一藻属，本实验具体采用微囊藻Microcystis flos-aquae(FACHB-1028)，来源于中国科学院武汉水生生物研究所淡水藻种库，详见http://algae.ihb.ac.cn/，用BG-11液体培养基对微囊藻进行间歇培养，以磷酸盐作为培养液中藻类吸收实验的唯一磷营养物来源。藻种的培养在光照培养箱中进行，培养温度为25±1℃，光照强度为25μmol·m^–2·s^–1，光暗比为12h:12h。配置磷浓度梯度为0.02、0.2、1.0、5.0mg/L(K₂HPO₄)的培养液，加入500μL藻液(0.1μgchla/mL)进行培养，一段时间后测量磷营养通量。

具体培养方法如下：在实验开始前，对藻细胞进行饥饿处理，将藻细胞离心收集，用无磷的BG-11培养基(K₂HPO₄由等摩尔的KCl代替)洗涤以去除吸附的磷，重复洗涤，离心3次后转入无磷BG-11培养基中，饥饿培养7d以消耗细胞内储存的磷，将饥饿培养的藻种接入实验设置的不同磷浓度培养液中进行间歇培养，接种浓度为1×10⁷cell/L，3组平行。分别在接种1、2、3h后取样，用GF/C滤膜过滤后测定样品中磷酸盐的含量。根据已知的磷酸盐投入量和培养基中磷酸盐的剩余量求得细胞对磷的吸收量。藻类的生物量由叶绿素a(chla)计算，具体采用热乙醇萃取分光光度法。

将实验结果按判别形式所述的作图法进行绘制，log[P_e]与磷营养通量J的线性关系如图4所示，可得到x轴截距为–1.71＝log0.0195，即阈值为0.0195μmol/L，换算单位后，得到磷营养限制阈值为19.5nmol/L。而实验直接测得培养液中磷浓度为19±2nmol/L，与上述数学方法结果近似。

进一步地，将同一批次的藻种进行连续培养，控制稀释速率在0.055h^–1、0.085h^–1、0.125h^–1，分别记作A、B和C组，用相同方法对实验数据进行处理，如图5所示为不同生长速率下磷营养通量与log[P_e]的线性关系，纵坐标表示磷营养通量J，横坐标表示log[P_e]，得到x轴截距为–2.5＝log0.00316，即阈值为0.00316μmol/L，换算单位后，得到磷营养限制阈值为3.16nmol/L。实验直接测得A、B和C的阈值分别为3.2、3.3和4.0nmol/L，与本方法结果近似。在本实验中，同一批次实验藻种的控制条件为生长速率，故其胞内营养状态相同，所体现的磷浓度阈值相同；同时，直线斜率所代表的生理含义即为藻类细胞的生长速率。

上述实验中，直接检测培养液中磷浓度的方法为磷酸盐测定方法，具体参照《水和废水监测分析方法》(第四版)进行，参考文献：国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会.水和废水监测分析方法:第4版.北京:中国环境科学出版社,2002.

叶绿素a的浓度测定参照：章宗涉,黄祥飞.淡水浮游生物研究方法.北京:科学出版社,1991.

综上所述，本发明采用热力学函数对藻类细胞磷吸收过程的总反应进行数学描述，从对藻类磷吸收现象层面的关注转移到细胞能量代谢层面，结合藻类细胞磷转运、同化和储存的重要生理过程，遴选磷在细胞内部的主要物质归宿为三磷酸腺苷(ATP)和聚合磷酸盐(PolyP)，基于热力学函数建立磷营养通量与环境磷浓度的数学关系，通过应用实施例证明该模型的可靠性高，实现定量分析不同营养状态的藻细胞受环境磷浓度约束的能量水平。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明专利的模型应用而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。