基于猪CCR1和CCR5受体高通量细胞筛选模型的构建及其条件优化

摘要

趋化因子受体1(chemokine receptor1，CCR1)和趋化因子受体5(chemokine receptor5，CCR5)属于G-蛋白偶联受体家族成员，可由单核细胞、T细胞、自然杀伤细胞、成纤维细胞等分泌，在心脏、脑、呼吸道、生殖器官等均有表达。研究表明CCR1和CCR5与其配体作用在机体呼吸道系统、免疫系统、生殖系统和生长发育中均发挥着重要作用。CCR1和CCR5的共用配体RANTES为CC型趋化因子，RANTES在病毒感染时表现活跃，某些病原影响RANTES表达的机制也初步被阐明。但是在猪方面，关于RANTES与其受体CCR1和CCR5作用后，细胞内信号激活情况如何以及是否能影响某些病毒病的感染过程尚未见报道。
　　为了探究RANTES与猪CCR1和CCR5作用后细胞内信号激活情况，寻找作用CCR1或CCR5的活性化合物，以及其是否能在猪传染性疾病中起到作用，本研究通过对猪CCR1和猪CCR5进行分子克隆并构建了真核表达载体，在获得pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5后，分别转染HEK293T细胞，通过双荧光素酶报告基因法，使用微孔板多功能荧光素酶检测仪检测RANTES作用后荧光素酶的表达量。根据检测结果选择报告基因与CCR1或CCR5转染CHO-K1细胞，使用G418和潮霉素B加压筛选，通过有限稀释法和单荧光素酶报告系统检测荧光素酶荧光值的变化情况，筛选出稳定表达的CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1单克隆细胞。为了寻找CCR1和CCR5的活性化合物，对能影响高通量筛选过程中CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1荧光素酶表达量的各个条件进行了优化。全文主要成果如下:
　　1、使用PCR技术从猪的肌肉组织中扩增出1062bp的CCR1基因片段和1059bp的CCR5基因片段。将猪CCR1和CCR5基因连接到真核表达载体pcDNA3.1(+)并获得重组质粒pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5。
　　2、将pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重组质粒转染到HEK293T细胞中，通过RT-PCR技术和Western blotting技术鉴定目的基因的转录和翻译，结果显示目的基因顺利表达。
　　3、将pcDNA3.1(+)-myc/CCR1和pcDNA3.1(+)-myc/CCR5重组质粒分别与pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]或pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]和pGL4.74[hRluc/TK]共转染到 HEK293T细胞中，预先加入Forskolin或不加刺激2h后，加入RANTES作用6h收集细胞，检测荧光素酶的表达量，根据荧光素酶表达量变化间接反映出配体作用后对细胞内CRE元件和SRE元件的激活情况，结果发现RANTES作用于CCR5对CRE和SRE均表现激活效应，作用于CCR1对SRE激活，而对CRE表现出抑制效应;
　　4、分别转染pcDNA3.1(+)-myc/CCR1与pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro]，pcDNA3.1(+)-myc/CCR5与pGL4.33[luc2P/SRE/Hygro]重组质粒到CHO-K1细胞中，通过G418和潮霉素B加压筛选，有限稀释法进行单克隆和配体结合试验，获得稳定表达目的基因的细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1;
　　5、对目的基因细胞模型高通量筛选条件进行优化，结果CCR1/CRE-CHO-K1的信号窗1.60×106，信号本地比2.43，Z因子0.59; CCR5/SRE-CHO-K1信号窗4.90×105，信号本底比2.08，Z因子0.60。细胞模型CCR1/CRE-CHO-K1和CCR5/SRE-CHO-K1可以用于活性化合物的筛选，为防治该通路参与的相关猪病奠定基础。

目录

摘要

符号说明

第一章 文献综述

1 趋化因子及其受体

1．1 趋化因子

1．2 趋化因子受体概述

1．3 趋化因子相关疾病概述

1．4 趋化因子拮抗剂的研究

2 RANTES概述

2．1 分子结构

2．2 主要功能

3 CCR1／CCR5受体概述

3．1 分子结构

3．2 生物功能

4 研究目的及意义

第二章 猪CCR1、CCR5真核表达载体的构建及反应元件CRE和SRE的信号分析

1 试验材料

1．1 主要试剂

1．2 试验仪器

1．3 主要溶液的配置

2 试验方法

2．1 引物设计

2．2 克隆猪CCR1，CCR5基因

2．3 pcDNA3．1(+)与CCR5、CCR1的连接

2．4 pcDNA3．1(+)-CCR1和pcDNA3．1(+)-CCR5的转化与小提

2．5 pcDNA3．1(+)-CCR5和pcDNA3．1(+)-CCR1载体的鉴定

2．6 CCR1／5与CRE或SRE间的信号关系

2．7 数据处理

3 结果与分析

3．1 CCR1和CCR5基因的PCR扩增结果

3．2 pcDNA3．1(+)-CCR1和pcDNA3．1(+)-CCR5双酶切的鉴定结果

3．3 基因测序结果

3．4 RT-PCR结果

3．5 Western Blotting鉴定结果

3．6 CCR1／5与CRE或SRE间的信号关系

4 讨论

4．1 猪CCR1和CCR5基因的基因克隆

4．2 基因载体的选择

4．3 基因载体的鉴定

4．4 环磷酸腺苷反应元件(CRE)和血清反应元件(SRE)

5 小结

第三章 建立CCR1和CCR5细胞模型并优化筛选条件

1 材料

1．1 主要仪器

1．2 主要试剂

1．3 主要溶液的配制

1．4 CHO-K1细胞培养

1．5 CHO-K1铺96孔细胞板

1．6 细胞裂解及荧光检测

2 试验过程

2．1 CCR1和CCR5转染CHO-K1

2．2 细胞抗性筛选

2．3 稳定转染细胞的单克隆

2．4 模型的筛选条件优化

2．5 模型评价

3 结果

3．1 CCR1／CRE-CHO-K1的Forskolin优化结果

3．2 药物浓度优化结果

3．3 药物作用时间优化结果

3．4 DMSO浓度优化结果

3．5 模型评价结果

4 讨论

4．1 高通量筛选模型

4．2 以CCR1和CCR5为靶点治疗疾病的可能性

5 小结

全文结论

参考文献

致谢

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