一种分离麦角甾烷型三萜25R‑与25S‑差向异构体的方法

摘要

本发明提供了一种拆分25R‑与25S‑麦角甾烷型三萜差向异构体的方法。异构体混合物样品经一定体积有机溶剂溶解、过滤，分别从滤渣与滤液部分得到纯度较高的单个差向异构体。应用该方法拆分了从牛樟芝提纯的三对差向异构体(相对含量接近1:1)，可以得到相对纯度超过75％的25R‑antcin K与87％的25S‑antcin K，65％的25R‑antcin C与70％的25S‑antcin C，以及相对纯度超过80％的25S‑antcin H。该方法利用差向异构体在特定溶剂中的溶解度差异达到分离目的，分离过程简单快速，不需要复杂的实验设备，便宜无损耗，环境友好，可用于25R‑与25S‑异构体的大量制备。

说明书

技术领域

本发明涉及一种麦角甾烷型三萜25R-与25S-差向异构体的拆分方法。以牛樟芝中三对麦角甾烷型三萜25R/S-antcin K、25R/S-antcin C及25R/S-antcin H为例，所述方法利用差向异构体在特定溶剂中的溶解度差异达到分离，分离过程简单快速，不需要复杂的实验设备且能得到大量较高纯度的25R-与25S-异构体。

背景技术

手性是自然界的一种常见现象，很多天然产物以手性异构体的形式混合存在。随着对手性异构体研究的深入，人们发现很多手性异构体的生物活性、化学性质存在明显差异。然而，由于它们的平面结构相同，仅立体构型存在差异，很多手性异构体的分离纯化非常困难。目前，分离手性异构体的方法主要有直接结晶拆分法、经典成盐拆分法、酶拆分法、色谱拆分法(含毛细管电泳法)和手性膜拆分法等五大类。结晶法是应用最早的手性拆分技术，有多种体系已完成了工业化，但操作繁琐、流程长；成盐拆分法存在收率低、难以选择合适的拆分剂以及拆分化合物的类型受到限制等缺点；酶拆分法需要寻找合适的酶对特定光学异构体进行催化反应，使之生成完全不同的化合物从而得到分离；色谱拆分法和手性膜拆分法对仪器设备的要求较高，且产率较低，不易实现大规模分离。

差向异构体是手性异构体一种，指两个化合物含有多个手性中心，但只有一个手性中心的构型不同，其余构型都相同的非对映体。差向异构体的理化性质比一般的手性异构体更加接近，因此拆分也更加困难。

麦角甾烷型三萜是一类具有24(28)-双键-4α-甲基的29碳甾体骨架的天然化合物。麦角甾烷型三萜是药用真菌牛樟芝的主要活性成分，在牛樟芝子实体中的含量为4.3-10.4％，在皿培牛樟芝中的含量可达8％，主要活性成分有antcin K、antcin C、antcin H，均以25R/S-差向异构体混合物的形式存在，比例接近1:1(Qiao X等,RSC Adv 2015,5,47040-47052)。文献报道麦角甾烷型三萜具有多种药理活性，包括抗肿瘤、抗炎、保肝、抗糖尿病等(Lu MC等,Pharmacol Therapeut 2013,139,124-156)，这些研究大多针对25R/S-差向异构体混合物。有研究表明，樟芝中一对麦角甾烷型三萜化合物25R-和25S-antcin C的细胞毒活性存在明显差异，这一结果提示C-25的立体构型可能影响麦角甾烷型三萜的生物活性(Lin TY等,Nat Prod Commun 2012,7,835-836)。因此，拆分25R/S-差向异构体对于其药物利用具有重要意义。目前分离牛樟芝中25R/S-麦角甾烷型三萜的方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)(Huang Y等,J Nat Prod 2014,77,118-124；Qiao X等,J Chromatogr A 2014,1358,252-260)。公开号为CN104359933A的专利介绍了一种从牛樟芝中分离25R/S-antcin K的方法，该方法将牛樟芝乙酸乙酯萃取物硅胶柱分离所得富含antcin K的流份以ODS高效液相色谱柱(250×10mm，乙腈-水)纯化，于保留时间15分钟左右时可将antcin K立体异构体混合物分离；Du YC等也采用高效液相色谱法，ODS柱分离25R/S-antcin K(Du YC等,J Pharmaceut Biomed 2012,58,182-192)。这些方法均需要使用昂贵的仪器，成本较高。对于最常用的RP-HPLC制备方法，由于麦角甾烷型三萜的溶解性差，样品浓度及进样量均限制了分离纯化的效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简便快速、便宜无损耗、不依赖于仪器的分离方法，分离麦角甾烷型三萜差向异构体。

本发明之25R/S-麦角甾烷型三萜差向异构体的分离方法，其特征在于，取25R/S-麦角甾烷型三萜差向异构体混合物样品，加入一定体积有机溶剂，搅拌均匀，静置，减压抽滤，取滤渣，如此处理1-5次，所得固体粉末即为纯度较高的一种差向异构体；取第一次滤液或合并前几次滤液，减压浓缩至干，得到纯度较高的另一种差向异构体。

本发明所述之有机溶剂包括甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等常用有机溶剂中的一种或几种的混合溶剂。

本发明之25R/S-麦角甾烷型三萜差向异构体混合物样品，其特征在于，牛樟芝经提取、色谱柱等方法纯化，得到主要含有一对25R/S-麦角甾烷型三萜差向异构体的流份，总含量不低于70％，而且25R-与25S-异构体的相对含量界于1:2与2:1之间。

本发明从牛樟芝的25R/S-antcin K差向异构体混合物当中分别制备得到相对纯度最高可达85％的25R-antcin K与90％的25S-antcin K；从牛樟芝的25R/S-antcin C差向异构体混合物当中分别制备得到相对纯度超过70％的25R-antcin C与70％的25S-antcinC；从牛樟芝25R/S-antcin H差向异构体混合物当中制备得到相对纯度超过80％的25S-antcin H。

本发明之25R/S-antcin K的分离方法，其特征在于，取25R/S-antcin K差向异构体混合物，加入10-40倍体积90-100％乙醇(体积分数)，搅拌均匀，静置，减压抽滤取滤渣，如此处理1-5次，得到25S-antcin K，纯度最高可达90％，产率为70％以上。第一次滤液，浓缩至干得固体粉末，得到25R-antcin K，纯度最高可达85％，产率为60％以上。

本发明之25R/S-antcin C的分离方法，其特征在于，取25R/S-antcin C差向异构体混合物，加入30-60倍体积乙腈，搅拌均匀，静置，减压抽滤取滤渣，如此处理1-5次，得到25S-antcin C，纯度最高可达70％，产率为30％以上。第一次滤液，浓缩至干得固体粉末，得到25R-antcin C，纯度最高可达70％，产率为60％以上。

本发明之25R/S-antcin H的分离方法，其特征在于，取25R/S-antcin H差向异构体混合物，加入5-20倍体积丙酮，搅拌均匀，静置，减压抽滤取滤渣，如此处理1-5次，得到25S-antcin H，纯度最高可达80％，产率为13％。

附图说明

图1为25R/S-antcin K差向异构体混合物、25R-antcin K对照品及25S-antcin K对照品的HPLC色谱图。

图2为不同有机试剂处理后沉淀中25R/S-antcin K差向异构体的相对含量。

图3为不同体积乙醇对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

图4为溶解时间对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

图5为多次乙醇溶解对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

图6为不同温度对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

图7为乙醇溶解法对不同纯度的25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

图8为本方法分离得到的25R-antcin K与25S-antcin K的HPLC图谱。

图9为本方法分离得到的25R-antcin C与25S-antcin C的HPLC图谱。

图10为本方法分离得到的25S-antcin H的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明，应理解，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下所提及的相对含量、总含量定义：

相对含量为25R-或25S-异构体占25R/S-差向异构体总含量的比例；

总含量为25R/S-差向异构体占固体粉末的比例。

实施例1、不同有机试剂对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

本方法中提及的所有化学试剂均购自北京化工厂。

25R-antcin K和25S-antcin K标准曲线：分别精密称取25R-antcin K和25S-antcin K对照品，甲醇溶解，配成5.00mg/mL母液，并用甲醇逐级稀释成2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05mg/mL浓度，0.22μm微孔滤膜过滤，10μL进样检测。

antcin K粗提物检测：称取antcin K粗提物粉末1.00mg，溶于1000μL甲醇中，0.22μm微孔滤膜过滤，10μL进样检测。

色谱条件：

仪器：Agilent 1100高效液相色谱仪；

色谱柱：YMC-Pack ODS-A柱(5μm,4.6×250mm)；

洗脱程序：0-25min,30％乙腈-20％甲醇-50％0.1％甲酸水，等度洗脱。

检测波长：254nm。

称取500mg antcin K粗提物固体粉末，加入7.5mL有机试剂，搅拌均匀，静置15min，减压抽滤至干。滤渣用甲醇溶解，进样分析。

二、实验结果。

Antcin K粗提物、25R-antcin K和25S-antcin K对照品色谱图见图1。

以峰面积为纵坐标，浓度(mg/mL)为横坐标，计算得到标准曲线：

25S-antcin K：y＝57561x+540.19，r²＝0.9997；

25R-antcin K：y＝56608x+135.12，r²＝0.9996。

Antcin K粗提物中25R-antcin K和25S-antcin K含量分别为37.4％,37.1％。

不同有机试剂处理后沉淀中25S-antcin K的相对含量见表1和图2，结果表明乙醇处理后沉淀中25S-antcin K的相对含量明显增加，即乙醇对25R/S-antcin K有较好的分离效果。

表1

实施例2、不同体积乙醇对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

称取1g antcin K粗提物固体粉末，分别加入10,15,20,40,60mL乙醇，搅拌均匀，静置15min，减压抽滤至干。滤渣用甲醇溶解，进样分析。

二、实验结果

实验结果见表2和图3。乙醇体积增加，25S-antcin K的相对含量也有所增加，但滤渣质量相对减少，产率下降。15倍体积乙醇对antcin K的分离即有较好效果。

表2

实施例3、不同溶解时间对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

称取10.0mg antcin K纯固体粉末(相对纯度>90％)，分别加入150μL乙醇，涡旋均匀，静置，分别于20s,30s,1min,2min,5min,15min,30min,1h,2h,4h,8h,12h,24h,36h,48h,72h滤膜过滤。滤液以甲醇稀释50倍，进样分析。

二、实验结果

实验结果见表3和图4。乙醇溶液中25R-antcin K的相对含量随时间而逐渐增加，但25R/S-antcin K总溶解质量基本维持不变。溶解15min后溶液中25R-antcin K的相对含量即能达到较高水平。

表3

实施例4、多次乙醇溶解对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

称取1g antcin K粗提物固体粉末，加入15mL乙醇，搅拌均匀，静置15min，减压抽滤至干，得第一次滤渣。所得滤渣加入15倍体积乙醇，搅拌均匀，静置15min，减压抽滤至干，得第二次滤渣。所得滤渣加入15倍体积乙醇，搅拌均匀，静置15min，减压抽滤至干，得第三次滤渣。三次滤渣分别用甲醇溶解，进样分析。

二、实验结果。

实验结果见表4和图5。选用15倍体积溶剂，多次乙醇溶解后，25S-antcin K的相对含量明显增加，产率高于一次性大量乙醇处理的结果。15倍体积乙醇溶解2次，即可同时达到较好的25S-antcin K的相对含量和较高的产率。

表4

实施例5、溶解温度对25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

称取500mg antcin K纯固体粉末(相对纯度>90％)，加入7.5mL乙醇，搅拌均匀，分别于4℃、25℃、50℃静置15min，减压抽滤至干，得滤渣。滤液减压旋蒸至干。滤渣和滤液分别用甲醇溶解至1mg/mL，进样分析。

二、实验结果。

实验结果见表5和图6。不同温度下滤渣与滤液中25R-和25S-antcin K相对含量无明显差别，即温度对25R/S-antcin K的分离无显著影响。

表5

实施例6、乙醇溶解法对不同纯度25R/S-antcin K差向异构体分离的影响。

一、实验材料和方法。

分别称取1.0g antcin K不同纯度60％、70％、90％粉末，加入15mL乙醇，搅拌均匀，静置15min，抽滤，得第一次滤渣。滤液减压浓缩至干得第一次滤液，为25R-antcin K。第一次滤渣加入15倍体积乙醇，搅拌均匀，静置15min，抽滤，得第二次滤渣，为25S-antcin K。

二、实验结果。

实验结果见表6和图7。对于25R-antcin K，乙醇溶解法对纯度较高的样品分离效果相对较好，对纯度较低的样品会其相对含量及纯度均有所降低；而对于25S-antcin K，乙醇溶解法对不同纯度的样品其相对含量无明显变化，但产率有所降低。简而言之，对于纯度越高的样品，乙醇溶解法的分离效果越好。

表6

实施例8、通过乙醇溶解的方法大量分离25S/R-antcin K。

一、实验材料和方法。

称取3.0g antcin K黄色固体粉末，少量乙醇洗涤除去杂质后，加入45mL乙醇，搅拌均匀，静置15min，抽滤，得第一次滤渣1.7g；滤液减压浓缩至干得第一次滤液1.07g，为25R-antcin K淡黄色固体粉末。第一次滤渣加入25mL乙醇，搅拌均匀，静置15min，抽滤，得第二次滤渣，为910mg 25S-antcin K淡黄色固体粉末。

分离所得25R-antcin K、25S-antcin K各称取1.00mg，分别溶于1000μL甲醇中，用0.22μm微孔滤膜过滤，10μL进样。

二、实验结果。

实验结果见表7和图8。所得第二次滤渣为25S-antcin K淡黄色固体粉末，纯度可达87.2％，产率为73.5％；第一次滤液为25R-antcin K淡黄色固体粉末，纯度可达76.1％，产率为67.2％。

表7

实施例9、通过乙腈溶解的方法分离25S/R-antcin C。

一、实验材料和方法。

同法优化得到25S/R-antcin C的分离方法。

称取1.0g antcin C(90.3％)固体粉末，加入30mL乙腈，搅拌均匀，静置30min，抽滤，得第一次滤渣408mg；滤液减压浓缩至干得第一次滤液501mg，为25R-antcin C淡黄色固体粉末。第一次滤渣加入15mL乙醇，搅拌均匀，静置30min，抽滤，得第二次滤渣，218mg 25S-antcin C淡黄色固体粉末。

分离所得25R-antcin C、25S-antcin C各称取1.00mg，分别溶于1000μL甲醇中，用0.22μm微孔滤膜过滤，10μL进样。

二、实验结果。

实验结果见表8和图9。所得第二次滤渣为25S-antcin C淡黄色固体粉末，相对纯度可达71.6％，产率为34.4％；第一次滤液为25R-antcin C淡黄色固体粉末，相对纯度可达65.8％，产率为66.4％。

表8

实施例10、通过丙酮溶解的方法分离25S/R-antcin H。

一、实验材料和方法。

称取300mg antcin H(95.6％)黄色固体粉末，少量丙酮洗涤除去杂质后，加入3mL丙酮，搅拌均匀，静置30min，抽滤，得第一次滤渣120mg；滤渣加入1.2mL乙醇，搅拌均匀，静置30min，抽滤，得第二次滤渣30mg，为25S-antcin H淡黄色固体粉末。

分离所得25S-antcin H称取1.00mg，溶于1000μL甲醇中，用0.22μm微孔滤膜过滤，10μL进样。

二、实验结果。

实验结果见图10。从25S-相对含量为62.7％的25S/R-antcin H中分离所得的第二次滤渣为25S-antcin H淡黄色固体粉末，相对纯度可达80.7％，产率为12.8％。