一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法

摘要

本发明涉及一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法。利用超高效反相液相色谱与四级杆‑静电场轨道阱高分辨质谱联用技术(UPLC‑Q‑Exactive Orbitrap MS)，并利用正负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能，准确实现不同植物来源蜂花粉中脂类物质的精确定量，为蜂花粉产地溯源、真实性判别、掺杂打假以及蜂花粉的功能营养学研究提供依据。该技术分辨率高，定性准确，克服了以往技术在成分鉴别中准确度和可靠性低的问题，是一种脂质组学分析的新型高效技术。

说明书

技术领域

本发明属于化学分析领域，具体涉及一种快速分析蜂花粉中脂类 成分的方法。

背景技术

脂类，又称脂质，这是一类不溶于水而易溶于脂肪溶剂(醇、醚、 氯仿、苯)等非极性有机溶剂，由脂肪酸与醇作用脱水缩合生成的酯 及其衍生物统称为脂类，其中包括脂肪、蜡、类固醇、脂溶性维生素 (如维生素A，D，E和K)、单酸甘油酯、二酸甘油酯、磷脂等。它的主要生理功能包括储存能量、构成细胞膜以及膜的讯息传导等。如 今，脂类已经被用于美容和食品工业。脂质根据其双亲性的特质(兼 具亲水性与疏水性)可以概分为八类：脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、 鞘脂(神经脂质)、糖脂质、聚酮类(由酮乙基次单元聚合而成)、固醇脂类，以及孕烯醇酮脂类(由异戊二烯次单元缩合聚合而成)。

蜂花粉是指蜜蜂采蜜时带回的花粉团，在蜂巢内经过储藏和发酵 后形成的不规则扁圆形的团状物。蜂花粉中含有丰富的营养物质和生 物学活性物质，具有保护心血管系统、促进机体免疫力、清除自由基、 调节肠道功能和治疗前列腺疾病等。蜂花粉含有蛋白质、必需氨基酸、 多糖、维生素、不饱和脂肪酸、多酚类和黄酮类等活性物质，越来越 多地被应用于食品和医疗工业。

蜂花粉中的脂类成分在其营养成分中占据重要地位，并且不同种 类的蜂花粉中脂类成分的组成和含量也是不同的。近些年，蜂花粉中 的脂类成分越来越受到国内外研究人员的广泛关注。其中，大多数实 验集中于花粉中脂肪酸的研究。脂肪酸的种类繁多，常见的脂肪酸有 丁酸、己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花 生酸、山嵛酸、二十四酸、油酸、棕榈酸、芥子酸、亚油酸、花生四 稀酸和神经酸等。目前，已在花粉中发现了亚油酸、亚麻酸、花生四 烯酸等多不饱和脂肪酸。除脂肪酸外，不同种类的花粉中所含的脂种 类及含量也是不同的，蜂花粉中除脂肪酸外的其他脂类成分报道并不 充分。

现有蜂花粉中脂质组分的常用检测方法包括薄层层析法，气相色 谱法，气相色谱串联质谱法或反相液相色谱串联质谱技术(利用的是 大气压化学电离源)。但现有方法分辨率和灵敏度低，不可以消除干 扰，无法实现可靠的代谢物结构识别，完成不了大规模脂类组学样品 分析。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种蜂花粉中脂类成分的检 测方法，其利用超高效反相液相色谱与四级杆-静电场轨道阱高分辨 质谱联用技术(UPLC-Q-ExactiveOrbitrap MS)，并利用正负离子监 测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能，准确实现不同植物 来源蜂花粉中脂类物质的精确定量，为蜂花粉产地溯源、真实性判别、 掺杂打假以及蜂花粉的功能营养学研究提供依据。该技术分辨率高， 定性准确，克服了以往技术在成分鉴别中准确度和可靠性低的问题， 是一种脂质组学分析的新型高效技术。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种快速分析蜂花粉中脂类成分的方法，包括如下步骤：

(1)样品预处理

称取蜂花粉，研磨粉碎后加入花粉脂质提取液，涡旋、静置后离 心，静置，分层后取下层有机相；向有机相加入去离子水，萃取涡旋， 静置，抽提后离心，取下层有机相，氮气吹干，得到透明薄膜，重溶 于花粉脂质提取液，待测；

(2)利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术对样品进行定性和 定量分析；

(3)利用软件Lipidsearch 4.0(Thermo Fisher,CA)进行数据分 析，基于一级母离子(MS1)和二级碎片离子(MS2)信息进行数据 库检索，自动匹配保留时间，准确质量数(MS1mass error of<5ppm， MS2mass error of<8ppm)，鉴定样品中的脂质成分；再根据标准溶 液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。

步骤(1)中，所述花粉脂质提取液为氯仿与甲醇按体积比2:1的 混合溶液；并按料液比1:4-8加入。

步骤(2)中，所述超高效反相液相色谱为Agilent 1290UPLC超 高效液相色谱仪。所述检测条件为：

流动相包括：A组分乙腈和水(60:40，按体积百分比计，含10mM 乙酸胺)，B组分异丙醇和乙腈(90:10，按体积百分比计，含10mM 乙酸胺)；

洗脱方式：梯度洗脱；所述梯度洗脱方式为：0-20min，A组分 由63％降至2％，B组分由37％增至98％(按体积百分比计)；20-28min， 2％A，98％B(按体积百分比计)；28-28.1min，A组分由2％降升至63％， B组分由98％降至37％(按体积百分比计)；28.1-35min，63％A，37％ B(按体积百分比计)。所述洗脱速度为150-300μL/min。

质谱条件：采集模式：正、负离子采集模式；

离子源：电喷雾离子源(ESI)；所述离子源温度：200-350℃； 毛细管温度：200-350℃；喷雾电压：2-3.0kV；鞘气流速：30-35Arb； 辅助气流速：0-10Arb。

扫描方式：数据依赖型二级扫描；

采集范围：正离子模式下240-2,000m/z，负离子模式下 200-2,000m/z；

碰撞能量：10-50eV。

色谱柱：反相色谱柱。

进样量：1-2μL。

本发明所述分析方法中涉及的脂类成分包括：神经酰胺、溶血性 卵磷脂、甘油三酯、甘油二酯、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 甘油、磷脂酰丝氨酸、脂肪酸。

采用本发明所述分析方法得到的9类脂类成分的检出限(LOD)， 定量限(LOQ)，线性范围和回归方程如表1所示。

表1 9类脂质标品的检出限(LOD)，定量限(LOQ)，线性范围和回归方程

本发明的分析方法分辨率和灵敏度高，可以消除干扰，首次实现 蜂花粉中脂质成分的组学分析。

附图说明

图1为茶花蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负 离子模式)。

图2为荷花蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负 离子模式)。

图3为油菜蜂花粉的总离子流(TIC)图(a为正离子模式，b为负 离子模式)。

具体实施方式

以下实施例中样品前处理过程所用耗材均为玻璃材质，以防产生 塑料污染。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规 手段，所用原料均为市售商品。

实施例1：

茶花蜂花粉中脂质组分的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS检测方 法，其方法如下：

(1)样品前处理：

①称取5-10g茶花蜂花粉，研磨粉碎后加入一定量的花粉脂质提 取液，涡旋、静置后离心，重复三次，最后一次离心静置，待溶液分 层后取下层有机相置于新管中；

②加入去离子水，对花粉有机层进行二次萃取涡旋，静置，重复 三次，充分抽提后，离心，取出下层有机相于新管中，在氮气的保护 下吹干有机溶剂至透明薄膜状，吹干后重溶于花粉脂质提取液，待测；

(2)利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术进行定性和定量分 析：

用氯仿:甲醇(2:1，V/V)将样品稀释400倍和100倍分别于正、 负离子模式下进行检测，指定液相色谱条件如下：

液相色谱系统：Agilent 1290UPLC超高效液相色谱仪；色谱柱： 正离子模式下使用CORTECS C18 100×2.1mm 2.7μm色谱柱(Waters)，负离子模式下使用XSelect CSH C18100×2.1mm 2.5 μm色谱柱(Waters)；柱温：45℃；进样量：1μL；流速为：0.25 mL/min；流动相：A相：乙腈和水(60:40V/V,含10mM乙酸胺)；B 相：异丙醇和乙腈(90:10V/V,含10mM乙酸胺)；并按梯度洗脱程 序运行，所述的梯度洗脱方式为：0-20min，A相由63％降至2％，B 相由37％增至98％(按体积百分比计)；20-28min，2％A，98％B(按体 积百分比计)；28-28.1min，A相由2％降升至63％，B相由98％降至 37％(按体积百分比计)；28.1-35min，63％A，37％B(按体积百分比计)。

指定质谱条件如下：

质谱系统：Q-Exactive Orbitrap mass(Thermo Fisher,CA,USA)； 离子源：电喷雾离子源ESI(+)和ESI(-)；离子源温度：300℃；毛 细管温度：320℃；喷雾电压：3.0kV；鞘气流速：35Arb；辅助气流 速：10Arb；荷质比范围：正离子模式下240-2,000m/z，负离子模式下200-2,000m/z；全扫描和碎片扫描分辨率分别为：70,000和17,500。

结果见附图1(图1为茶花蜂花粉的质谱总离子流图，上图为正离 子模式下采集，下图为负离子模式下采集)；

(3)利用软件Lipidsearch 4.0(Thermo Fisher,CA)进行数据分 析。基于一级母离子(MS1)和二级碎片离子(MS2)信息进行数据 库检索，可自动匹配保留时间，准确质量数(MS1 mass error of<5 ppm，MS2 mass error of<8ppm)，鉴定样品中存在的脂质成分。之后 根据标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。

分析结果见表2和表3。

实施例2：

荷花蜂花粉中脂质组分的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS检测方 法，其方法如下：

(1)样品前处理：

①称取5-10g荷花蜂花粉，研磨粉碎后加入一定量的花粉脂质提 取液，涡旋、静置后离心，重复三次，最后一次离心静置，待溶液分 层后取下层有机相置于新管中；

②加入去离子水，对花粉有机层进行二次萃取涡旋，静置，重复 三次，充分抽提后，离心，取出下层有机相于新管中，在氮气的保护 下吹干有机溶剂至透明薄膜状，吹干后重溶于花粉脂质提取液，待测；

(2)利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术进行定性和定量分 析：

用氯仿:甲醇(2:1，V/V)将样品稀释400倍和100倍分别于正、 负离子模式下进行检测，指定液相色谱条件如下：

液相色谱系统：Agilent 1290UPLC超高效液相色谱仪；色谱柱： 正离子模式下使用CORTECS C18 100×2.1mm 2.7μm色谱柱 (Waters)，负离子模式下使用XSelect CSH C18100×2.1mm 2.5μm 色谱柱(Waters)；柱温：45℃；进样量：1μL；流速为：0.25mL/min； 流动相：A相：乙腈和水(60:40V/V,含10mM乙酸胺)；B相：异丙 醇和乙腈(90:10V/V,含10mM乙酸胺)；并按梯度洗脱程序运行， 所述的梯度洗脱方式为：0-20min，A相由63％降至2％，B相由37％ 增至98％(按体积百分比计)；20-28min，2％A，98％B(按体积百分比 计)；28-28.1min，A相由2％降升至63％，B相由98％降至37％(按体积 百分比计)；28.1-35min，63％A，37％B(按体积百分比计)。

指定质谱条件如下：

质谱系统：Q-Exactive Orbitrap mass(Thermo Fisher,CA,USA)； 离子源：电喷雾离子源ESI(+)和ESI(-)；离子源温度：300℃；毛 细管温度：320℃；喷雾电压：3.0kV；鞘气流速：35Arb；辅助气流 速：10Arb；荷质比范围：正离子模式下240-2,000m/z，负离子模式下200-2,000m/z；全扫描和碎片扫描分辨率分别为：70,000和17,500。

检测结果见附图2(图2为荷花蜂花粉的质谱总离子流图，上图为 正离子模式下采集，下图为负离子模式下采集)；

(3)利用软件Lipidsearch 4.0(Thermo Fisher,CA)进行数据分析。 基于一级母离子(MS1)和二级碎片离子(MS2)信息进行数据库检 索，可自动匹配保留时间，准确质量数(MS1mass error of<5ppm， MS2mass error of<8ppm)，鉴别样品中存在的脂质成分。之后根据 标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。

分析结果见表2和表3。

实施例3：

油菜蜂花粉中脂质组分的UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS检测方 法，其方法如下：

(1)样品前处理：

①称取5-10g油菜蜂花粉，研磨粉碎后加入一定量的花粉脂质提 取液，涡旋、静置后离心，重复三次，最后一次离心静置，待溶液分 层后取下层有机相置于新管中；

②加入去离子水，对花粉有机层进行二次萃取涡旋，静置，重复 三次，充分抽提后，离心，取出下层有机相于新管中，在氮气的保护 下吹干有机溶剂至透明薄膜状，吹干后重溶于花粉脂质提取液，待测；

(2)利用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术进行定性和定量分 析：

用氯仿:甲醇(2:1，V/V)将样品稀释400倍和100倍分别于正、 负离子模式下进行检测，指定液相色谱条件如下：

液相色谱系统：Agilent 1290UPLC超高效液相色谱仪；色谱柱： 正离子模式下使用CORTECS C18 100×2.1mm 2.7μm色谱柱 (Waters)，负离子模式下使用XSelect CSH C18100×2.1mm 2.5μm 色谱柱(Waters)；柱温：45℃；进样量：1μL；流速为：0.25mL/min； 流动相：A相：乙腈和水(60:40V/V,含10mM乙酸胺)；B相：异丙 醇和乙腈(90:10V/V,含10mM乙酸胺)；并按梯度洗脱程序运行， 所述的梯度洗脱方式为：0-20min，A相由63％降至2％，B相由37％ 增至98％(按体积百分比计)；20-28min，2％A，98％B(按体积百分比 计)；28-28.1min，A相由2％降升至63％，B相由98％降至37％(按体积 百分比计)；28.1-35min，63％A，37％B(按体积百分比计)。

指定质谱条件如下：

质谱系统：Q-Exactive Orbitrap mass(Thermo Fisher,CA,USA)； 离子源：电喷雾离子源ESI(+)和ESI(-)；离子源温度：300℃；毛 细管温度：320℃；喷雾电压：3.0kV；鞘气流速：35Arb；辅助气流 速：10Arb；荷质比范围：正离子模式下240-2,000m/z，负离子模式下200-2,000m/z；全扫描和碎片扫描分辨率分别为：70,000和17,500。

检测结果见附图3(图3为油菜蜂花粉的质谱总离子流图，上图为 正离子模式下采集，下图为负离子模式下采集)；

(3)利用软件Lipidsearch 4.0(Thermo Fisher,CA)进行数据分析。 基于一级母离子(MS1)和二级碎片离子(MS2)信息进行数据库检 索，可自动匹配保留时间，准确质量数(MS1mass error of<5ppm， MS2mass error of<8ppm)，鉴别样品中存在的脂质成分。之后根据 标准溶液浓度曲线定量分析样品中脂质成分的含量。

分析结果见表2和表3。

表2三种蜂花粉的含量

表3基于UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS技术的蜂花粉脂质成分鉴别

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了 详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这 对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神 的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求。