基于全自动在线固相萃取‑超高效液相色谱‑线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法

摘要

本发明公开了一种基于全自动在线固相萃取‑超高效液相色谱‑线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，它通过配制样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液，利用在线固相萃取，实现水中藻类毒素在线富集的目的，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统分析过程中存在的前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、人工预处理的重现性难以保证等问题。同时结合线性离子阱串联质谱法和内标法，保证了水中痕量多种藻类毒素同时分析时的准确定量以及精确定性，提升了藻类毒素的检测能力，为政府行政部门的分析监管提供先进技术支撑。

说明书

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域，具体涉及水中藻类毒素的测定方法，尤其是基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱的方法。

现有技术

现有检测水样中藻类毒素的方法，存在测定种类有限，前处理过程操作繁琐，采用C18、HLB、等固相萃取柱进行离线富集，耗费大量的前处理时间，受人工技术影响大，实验过程中会接触到有毒有害的试剂。

现有技术一般采用液相或液质联用法技术居多，但对于水中痕量藻类毒素测定时，质谱法也会出现峰度比无法完全匹配的现象，导致无法确证。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法。它要解决传统分析技术中，存在的水体中痕量藻类毒素伏击过程的前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、人工预处理的重现性难以保证以及多种藻类毒素同时分析时很难满足均取得很好的定性定量效果的问题。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于包括如下步骤：

1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.5mL 5μg/mL的各藻类毒素储备液至5mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1.0 mL混合液至另一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成50 ng/mL的混合标准品工作溶液，于-18℃下保存备用；

2）同位素内标工作溶液的配制：精密移取0.1 mL 10 μg/mL的内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取0.5 mL定容的容量瓶中内标储备液至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10 ng/mL的内标工作溶液，于-18℃下保存备用；

3）线性溶液的制备：用超纯水稀释藻类毒素浓度在0.02-8.0 ng/mL范围内，内标浓度均为0.5 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；

4）加标回收试验样品溶液的制备：取不含藻类毒素的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为0.005 ng/mL、定量限为0.015 ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为0.02 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入步骤2）同位素内标工作溶液，使制得加标回收试验样品溶液内标浓度均为0.5 ng/mL，过膜后，供色谱测定；

5）用全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液：

a 测定：进样过程：由程序控制使自动进样器实现200 μL连续2次进样，吸取样品溶液、线性溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；

b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算

以线性溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，

式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为 ng/mL；A为目标化合物峰面积比内标化合物峰面积比；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b；

c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份包括定量及定性离子的保留时间与线性溶液中某一藻类毒素的保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该种藻类毒素，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：

C=(A-b)/a

式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积；

a和b由步骤b计算得到；

d结果验证：加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为80-120%，证明该检测方法可行；

e目标物确证：利用线性离子阱功能下，选择增强子离子模式获得标准物质的子离子高增强二级质谱图EPI并编辑谱库，将对应的目标物名称、相对分子量、CAS号以及化学结构图等补充完整，对样品中低浓度藻类毒素进行确证时，可获得样品中藻类毒素的EPI谱图后，进行定性谱库检索，依据两者匹配度进行确证。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于各藻类毒素包括柱孢藻毒素、节球藻毒素、微囊藻毒素MC-LY、 MC-LW、MC-YR、MC-WR、MC-LA、MC-LF、MC-RR、MC-LR。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于步骤2）中的内标为亮氨酸脑啡肽。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于步骤4）中的样品溶液用0.22 μm的滤膜过滤。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于色谱条件如下：

1）在线固相萃取液相条件：

富集柱：Oasis HLB Direct Connect HP ，2.1 x 30 mm，20 μm，

流动相：A相：甲醇，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脱，

流速：0.8 mL/min；

2）分离分析液相条件：

色谱柱：Waters Cortecs C18， 2.1x 100 mm， 2.7 μm，

流动相：A相：甲醇，B：5mM乙酸铵，梯度洗脱，

流速：0.4 mL/min，

柱温：35 ℃，

进样量：400 μL；

3）质谱条件：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪，

离子源：电喷雾离子源，

扫描方式：正离子扫描，

检测方式：多反应监测，

喷雾电压：4.5kV，

离子温度：450 ℃，

雾化器压力（GS1）：40PSI，

辅助器压力（GS2）：40PSI，

气帘气压力（CUR）：35PSI。

所述的基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，其特征在于进样分析具体过程如下：在富集泵的作用下，由自动进样器流向在线固相萃取柱，利用在线富集原理，使目标物保留于固相萃取柱上，六通阀在0-3min均保持初始状态，即1号位和2号位相通，基质干扰物等至废液池，实现目标化合物与基质的分离，分析流路5号位与6号位相通，流入检测器的状态；在3-6min阀切换至1号位与6号位相通，将固相萃取柱中的目标化合物反冲进入分析柱，在6min阀切换至初始位置，即1号位和2号位相通，将富集柱切出分析流路，防止富集柱与分析柱串联体系造成的柱前死体积较大，使经过分析柱分离的目标物进入质谱检测器进行分析。

通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

1）本发明是基于全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱测定水中藻类毒素的方法，通过采用全自动在线固相萃取技术进行重复进样，较传统的分析方法增加了进样体积，同时进行在线富集，简化前处理方式，大大提高了检测效率，降低了实验人员的劳动强度，解决了传统分析技术中，多种藻类毒素前处理方法操作繁琐、样品检测周期长、人工预处理重现性难以保证的问题，而超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法则使多种藻类毒素同时分析时准确定性定量得到了保证；

2）本发明通过超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法的检测，建立了一个全新的对水中痕量藻类毒素进行定量定性检测的方法，可有效监测和应对相应多种藻类毒素引起的食品安全突发事件，避免和降低多种藻类毒素带来的食品安全风险。同时，作为一种新的快速检测技术，不仅减少了有毒有害化学试剂的接触，降低了实验的成本，也有利于实验人员的自身健康和安全，达到绿色检测的目的，通过针对多种藻类毒素的超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法的项目研究，能提升藻类毒素的检测能力，为政府行政部门的分析决策提供先进技术支撑。

附图说明

图1为本发明的全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法测定水中藻类毒素的工作原理图；

图2为对照品（0.5 ng/mL）典型色谱图；

图3为对照品（0.5 ng/mL）的EPI谱图

图1中：1-富集泵，2-自动进样器，3-六通阀，4-固相萃取柱，5-分析泵，6-分析柱，7 –质谱检测器。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例：本发明实施例中的水为饮用水

1）混合标准品工作溶液的配制：分别精密移取0.5 mL 5 μg/mL的各藻类毒素储备液至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取1.0 mL混合液至另一10 mL容量瓶中，用甲醇定容，制成50 ng/mL的混合标准品工作溶液，于-18℃下保存备用；

2）同位素内标工作溶液的配制：精密移取0.1 mL 10 μg/mL的内标储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，再精密移取0.5 mL定容的容量瓶中内标储备液至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，制得10 ng/mL的内标工作溶液，于-18℃下保存备用；

3）线性溶液的制备：用超纯水稀释藻类毒素浓度在0.02-8.0ng/mL范围内，内标浓度均为0.5 ng/mL的线性标准溶液，供色谱测定；

4）加标回收试验样品溶液的制备：取不含藻类毒素的样品，置50 mL高速离心管中，精密加入不同量的步骤1）制得的混合标准品工作溶液，获得检出限为0.005 ng/mL、定量限为0.015 ng/mL、低、中、高不同水平浓度分别为0.02 ng/mL、0.1 ng/mL、1.0 ng/mL的加标试验样品，再向该加标试验样品中精密加入步骤2）同位素内标工作溶液，使制得加标回收试验样品溶液内标浓度均为0.5 ng/mL，过膜后，供色谱测定；

5）用全自动在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法测定样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液

a测定：进样过程：由程序控制使自动进样器实现200 μL连续2次进样，吸取样品溶液、线性溶液及加标回收试验样品溶液注入色谱仪中，以在线固相萃取-超高效液相色谱-线性离子阱串联质谱法，测定样品溶液中的目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积；加标回收试验样品溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，标准工作溶液及试样溶液中待测组分的响应值均应在监测器的线性范围之内；

如图1所示，其进样分析具体过程如下：在富集泵1的作用下，由自动进样器2连续吸取两次200μL样品溶液、线性溶液、空白溶液及加标回收试验样品溶液向固相萃取柱4进样，利用在线固相萃取技术，使目标物被保留在色谱柱内，此时六通阀3位置处于1-2，在0-3min保持该状态，此时基质干扰物等流至废液池，实现目标化合物与基质的分离；在3-6min六通阀3阀切换至1号位与6号位相通，将固相萃取柱4中的目标化合物反冲进入分析柱6，在6min后六通阀3切换至初始位置，即1号位和2号位相通，将固相萃取柱4切出分析流路，防止富集柱与分析柱串联体系造成的柱前死体积较大，使经过分析柱6分离的目标物进入质谱检测器7进行分析，其色谱条件如下：

a1在线固相萃取液相条件：

富集柱：Oasis HLB Direct Connect HP ，2.1 x 30 mm，20 μm，

流动相：A相：甲醇，B：0.1%甲酸-水，梯度洗脱；

表1 富集过程表

时间（min）流速（mL/min）A相（%）B相（%）00.8100030.810003.10.810906.00.810906.10.81000200.81000

a2分离分析液相条件：

色谱柱：Waters Cortecs C18， 2.1x 100 mm， 2.7 μm，

流动相：A相：甲醇，B：5mM乙酸铵，梯度洗脱；

表2 梯度洗脱过程表

时间（min）流速（mL/min）A相（%）B相（%）00.4208030.4208040.4455560.4455580.4554511.50.45545140.47525160.42080200.42080

柱温：35 ℃，

进样量：400 μL；

a3 六通阀位置切换表

表3 左切换阀、右切换阀切换过程表

时间阀切换06-131-266-1206-1

a4质谱条件：

质谱仪：三重四级杆串联质谱仪，

离子源：电喷雾离子源，

扫描方式：正离子扫描，

检测方式：多反应监测，

喷雾电压：4.5kV，

离子温度：450 ℃，

雾化器压力（GS1）：40PSI，

辅助器压力（GS2）：40PSI，

气帘气压力（CUR）：35PSI。

表4各磺胺类药物的定性定量离子对及碰撞能量表

获得标准品的总离子流图以及典型色谱图见图2。

b 曲线方程斜率、曲线方程截距的计算

以线性溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积定量，得到曲线方程A=aC+b，

式中C为溶液中目标化合物残留量，单位为 ng/mL；A为目标化合物峰面积比内标化合物峰面积比；a为曲线方程斜率；b为曲线方程截距，根据线性溶液的浓度、测出的线性溶液中目标化合物峰面积、内标化合物峰面积，采用拟合法，计算得出a和b，本发明用亮氨酸脑啡肽作为同位素内标；

c 结果分析：样品溶液中未知组份的保留时间分别与线性溶液中的目标化合物在同一色谱柱上的保留时间相比较，样品中某组份（包括定量及定性离子）的保留时间与线性溶液中某一藻类毒素的保留时间的绝对值在0.05min内，认定为该磺胺类药物，样品溶液中的目标化合物残留量浓度C，其单位为ng/mL，计算公式如下：

C=(A-b)/a

式中：A为样品溶液中的目标化合物峰面积比内标化合物峰面积；

a和b由步骤b计算得到；

d结果验证： 加标回收试验样品溶液按步骤c计算出实际的目标化合物残留量浓度C，与其理论的目标化合物残留量浓度C相比较，计算其平均回收率，平均回收率为80-120%，证明该检测方法可行，平均回收率计算时，一共测了12组平行试验，精密度计算时，一共测了6组平行试验，其验证数据结果如表5所示。

表5 各加标回收试验水中藻类毒素验证数据结果所示

从表5可以得出，其平均回收率在89.2-95.4%之间，精密度在1.1-2.3%之间，证明该检测方法可行。

e目标物确证：利用线性离子阱功能下，选择增强子离子模式获得标准物质的子离子高增强二级质谱图(EPI)并编辑谱库，见图3将对应的目标物名称、相对分子量、CAS号以及化学结构图等补充完整，对样品中低浓度藻类毒素进行确证时，可获得样品中藻类毒素的EPI谱图后，进行定性谱库检索，依据两者匹配度进行确证。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。