一种提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法

摘要

本发明公开了一种提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法，包括将继代培养获得的新疆雪莲愈伤组织接种在含有N‑苯基‑N′‑1，2，3‑噻二唑‑5‑脲和6‑苄氨基腺嘌呤的MS培养基上，然后在低压和挥发性酸熏蒸的环境中进行新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的诱导培养，从而显著提高新疆雪莲愈伤组织多酚的生物合成量，可用于新疆雪莲多酚类化合物生物合成的研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及多酚的生物合成，具体涉及一种提高新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.ex Maxim)愈伤组织多酚生物合成的方法。

背景技术

植物多酚是一类广泛存在于植物体内的植物次生代谢物质，是由1个或多个芳香环和2个以上酚羟基组成的单体分子到高聚合化合物的统称。自然界中的多酚非常丰富，已分离鉴定出多酚类物质有2万多种，植物多酚不但为植物带来五彩缤纷的颜色，也赋予植物苦、涩等多种味道。植物多酚广泛存在于蔬菜、水果、豆类、谷物类等植物中。也存在于茶叶、啤酒、果汁等饮料中，与人类的生活和健康密切相关。近年来发现植物多酚能够抑制动物和人类肿瘤的发展，防治心脑血管疾病以及抗炎、抗癌、抗氧化、抗衰老等作用。而近年来，越来越多的研究证实,植物多酚在植物抗逆境生理生态上也具有重要的作用。引起了人们广泛的关注以及研究利用多酚的极大兴趣。

新疆雪莲属菊目，菊科，风毛菊属，雪莲亚属，是一种多年生的草本植物，主要生长于我国西部海拔2400-3470米的高寒地区，具有通经活血、散寒除湿、止血消肿、排体内毒素等功效，素有“百草之王”的美称。由于生长环境恶劣，它的生长周期很长，在自然条件下五年才能开花，因此数量稀少,是十分珍贵的中药资源。近年来由于滥采滥挖，新疆雪莲已经濒临灭绝。人们希望应用生物技术开发出新产品以代替这种稀缺的天然药材，获得药效物质，满足市场需求。于是新疆雪莲细胞培养物为人们寄予厚望，有望在药用或保健食品领域成为天然雪莲的代替资源。

人们对通过新疆雪莲细胞培养生产黄酮类化合物已经进行了多方面的研究，但是对通过新疆雪莲细胞培养生产多酚类化合物尚未深入的研究。

发明内容

针对现有技术中的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种提高新疆雪莲(Saussurea involucrata Kar.et Kir.ex Maxim)愈伤组织多酚生物合成的方法，可用于新疆雪莲多酚类化合物生物合成的研究。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法，包括将继代培养获得的新疆雪莲愈伤组织接种在含有N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基上，然后在低压和挥发性酸熏蒸的环境中进行新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的诱导培养。

具体的，所述的继代培养获得的新疆雪莲愈伤组织是指继代培养20～30天的新疆雪莲愈伤组织。

具体的，所述的含有N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和6-苄氨基腺嘌呤的MS培养基是指含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基。

最好的，所述的挥发性酸是盐酸或醋酸。

更好的，盐酸的浓度为0.2mol/L，盐酸的熏蒸剂量是50～150μl；醋酸的浓度为0.2mol/L，醋酸的熏蒸剂量是100～300μl。

一种可行的方案，所述的挥发性酸的熏蒸方式是在愈伤组织周围的培养基上进行滴加。

还具体的，所述的低压是指大气压力值为30～50kP。

最好的，进行新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的诱导培养的培养时间为4～10天。

一种可行的方案，所述的继代培养获得的新疆雪莲愈伤组织的获得方法包括：将新疆雪莲外植体诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养20～30天后即得。

还有，所述的新疆雪莲外植体诱导出的新疆雪莲愈伤组织的获得方法包括：取灭菌后的新疆雪莲种子转接到MS培养基萌发培养得到的子叶为新疆雪莲外植体，新疆雪莲外植体切块后接到含a-萘乙酸2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养得到新疆雪莲愈伤组织，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16小时。

与现有技术相比，本发明的优点为：

本发明的提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法，通过将新疆雪莲愈伤组织在含有N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和6-苄氨基腺嘌呤的培养基上，并同时采用低压诱导和挥发性酸的熏蒸，使得新疆雪莲愈伤组织中的多酚生物合成量明显增多。该方法可用于新疆雪莲多酚类化合物生物合成的研究。

具体实施方式

本发明的提高新疆雪莲愈伤组织多酚生物合成的方法，按以下步骤进行：

步骤一，新疆雪莲愈伤组织的获得：

取新疆雪莲种子，用质量分数为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm²大小，然后接到含a-萘乙酸：2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织；

步骤二，新疆雪莲愈伤组织的继代：

将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养20-30天的愈伤组织可用于低大气压力下诱导多酚的生物合成；

步骤三，新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导：

将继代培养20-30天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸或醋酸，盐酸和醋酸的添加剂量分别是50-150μL和100-300μL。然后将材料转移到30-50kP的容器中培养4-10天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量。

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。

实施例1(对照1)：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

取新疆雪莲种子，用浓度为0.1％的升汞进行表面灭菌，再转接到MS培养基上进行萌发；将萌发后长出的子叶作为外植体，切割成0.3cm²大小，然后接到含a-萘乙酸：2.5mg/L和6-苄氨基腺嘌呤：0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为3000Lux、光周期16小时；培养35天后获得新疆雪莲愈伤组织。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代和总多酚的检测

将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养20-30天后测定其中总多酚的含量，测定数据如下表。

实施例2：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养20天的愈伤组织可用于低大气压力下诱导多酚的生物合成。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸50μL。

然后将材料转移到30kP的容器中培养4天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为2.83mg/g干重。

实施例3：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养25天的愈伤组织可用于低大气压力下诱导多酚的生物合成。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸100μL。

然后将材料转移到40kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为8.26mg/g干重。

实施例4：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸150μL。

然后将材料转移到50kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为6.34mg/g干重。

实施例5：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的醋酸100μL。

然后将材料转移到40kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为8.68mg/g干重。

实施例6：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的醋酸150μL。

然后将材料转移到40kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.75mg/g干重。

实施例7：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

将步骤一诱导出的新疆雪莲愈伤组织转接到含有a-萘乙酸2.5mg/L、6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L的MS培养基上进行培养，培养温度25℃±2℃，光照强度为4000Lux，光周期16小时；培养30天的愈伤组织可用于低大气压力下诱导多酚的生物合成。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸100μL。

然后将材料转移到40kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.52mg/g干重。

实施例8：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例7。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的醋酸100μL。

然后将材料转移到40kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.38mg/g干重。

实施例9：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸100μL。

然后将材料转移到30kP的容器中培养6天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.63mg/g干重。

实施例10：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸100μL。

然后将材料转移到30kP的容器中培养8天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.08mg/g干重。

实施例11：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的盐酸100μL。

然后将材料转移到30kP的容器中培养10天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为6.69mg/g干重。

实施例12：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，并在培养基的周围滴上浓度同为0.2mol/L的醋酸100μL。

然后将材料转移到30kP的容器中培养10天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为7.25mg/g干重。

实施例13：

1、新疆雪莲愈伤组织的获得

同实施例1。

2、新疆雪莲愈伤组织的继代

同实施例3。

3、新疆雪莲愈伤组织中多酚生物合成的诱导

将继代培养20天的新疆雪莲愈伤组织转移到含有含0.5mg/L的N-苯基-N′-1，2，3-噻二唑-5-脲和2.5mg/L的6-苄氨基腺嘌呤的MS固体培养基上，然后将材料转移到40kP的容器中培养4天。培养结束后，取出新疆雪莲愈伤组织，采用原儿茶酸进行标定的方法测定多总多酚的含量为5.26mg/g干重。