一种用于减少奶牛产犊间隔的分子标记及其检测方法

摘要

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于减少奶牛产犊间隔的分子标记及其检测方法。本发明公开了奶牛CXCR1基因816bp处A/C突变作为奶牛产犊间隔的分子标记的应用，并进一步提供了检测该分子标记的两种方法。将本发明公开的分子标记应用于奶牛辅助育种中，可以增加母牛产犊次数，从而减少因淘汰奶牛而购买其他奶牛的所产生的费用，如本发明在全国范围内推广应用，其间接产值可增加近80亿元以上，具有较好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于减少奶牛产犊间隔的分子标记及其检测方法。

背景技术

奶牛产犊间隔是指奶牛相邻2次产犊的时间间隔，是奶牛繁殖能力的综合反映。产犊间隔越短，则繁殖力越高，意味着农场主可以以较少的兽药、饲料等人力物力额投入，降低牧场的生产运营成本。因此，产犊间隔是一个重要的经济指标，它在增加牧场主的收入和保持牛群健康和稳定发展中有重要的作用。奶牛生产表明：奶牛产犊间隔每缩短1天，其饲养成本至少减少50元以上。随着对全球对奶牛产奶量等数量性状的高度选择，奶牛乳房炎、繁殖病症等疾病逐渐增加，因而其产犊间隔呈逐渐延长的趋势。目前国内大多数牛场产犊间隔平均约为400天左右。如果奶牛产犊间隔能缩短10天，按目前饲养成本50元/天计算，每胎可节约饲养成本500元。同时母牛终生产犊次数可增加，从而减少因淘汰奶牛而购买其他奶牛的所产生的费用。缩短产犊间隔可给牧场带来较大的经济效益。因此，急需一种能缩短产犊间隔的分子标记，并结合传统的奶牛育种、人工授精等技术，从而提高奶牛的繁殖性能，从而提高奶牛的终生生产价值和牛场的经济效益。

近年来，国内外围绕缩短奶牛产犊间隔从遗传角度进行了部分研究，发现了部分有价值的结果。周妍^[1]使用基因芯片对450头中英荷斯坦牛进行全基因组关联分析(Genome-wide>[2]等报道Leptin基因外显子2的E2FB区上102bp处的突变对荷斯坦牛的产犊间隔有显著性影响。

CXCR1基因与机体免疫力、产科疾病等疾病有一定程度的关联。但CXCR1基因是否有可能与奶牛产犊间隔紧密相关，尚没有报道。

[1]周妍.荷斯坦奶牛繁殖性状相关的分子标记筛选与鉴定[D].华中农业大学,2013.

[2]李鹏,何举,赵国丽,等.荷斯坦牛Leptin基因外显子2多态性与繁殖力性状的相关性研究[J].中国奶牛,2011(6):4-7.

发明内容

为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种新的奶牛产犊间隔的分子标记及其检测方法，通过该分子标记辅助育种，能有效提高经济价值。

本发明所采用的技术方案是：

本发明公开了奶牛CXCR1基因CXCR1-816位点的A/C突变作为奶牛产犊间隔的分子标记的应用。在CXCR1-816位点，CC型奶牛产犊间隔显著低于AA型奶牛。

本发明还公开了用于上述奶牛产犊间隔分子标记的检测方法，可以采用PCR方法或/和飞行质谱方法进行检测。

所述的PCR方法具体是：以待测奶牛样本的DNA为模板，以SEQ ID No.1和2的序列为引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行测序，测序结果与奶牛CXCR1基因参考序列(登录号：NM_001105038.1)进行比对，并判定CXCR1-816的基因型(图1)。

所述的飞行质谱方法是：以待测奶牛样本的DNA为模板，以SEQ ID No.3、4和5的序列为引物，进行PCR扩增，并利用飞行时间质谱法(MALDI-TOF System)对扩增产物进行检测，对实验结果进行分析，获得分型数据，并判定CXCR1-816的基因型(图2)。

本发明还公开了奶牛CXCR1基因CXCR1-816位点作为奶牛产犊间隔的分子标记在奶牛辅助育种中的应用。具体是：进行分子标记CXCR1-816A/C检测，筛选其中CC型个体公牛，并与母牛进行配种，增加其后代母牛CXCR1-816CC和AC型个体比例。

本发明通过对大样本奶牛群体(966头)CXCR1基因编码区进行测序，结合飞行质谱方法进行SNP分析，发现4个SNP连锁群。同时收集这些奶牛2013到2015年这3年间的产犊间隔等繁殖信息，通过多因素方差分析发现：CXCR1基因816A/C突变显著影响奶牛产犊间隔，CC型奶牛产犊间隔显著低于AA型奶牛，比AA型奶牛缩短15天左右(表1)，如按50元/天饲养成本计算，每胎可节约饲养成本750元。因此，增加本研究发现的分子标记CXCR1-816A/C检测，筛选其中CC型个体公牛，并与母牛进行配种，可增加其后代母牛CXCR1-816CC和AC型个体比例。如按目前中国荷斯坦牛1000万头计算，共可增产75亿元。同时母牛产犊次数可增加，从而减少因淘汰奶牛而购买其他奶牛的所产生的费用。因此，如这一技术能在全国范围内推广应用，其间接产值可增加近80亿元以上，具有较好的应用前景。

表1 CXCR1基因816位点不同基因型对产犊间隔和产后首配泌乳天数的平均数与标准差及方差分析结果

注：同列数据后相同字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

附图说明

图1是PCR检测CXCR1-816A/C各基因型测序图。

图2是飞行质谱方法检测CXCR1-816A/C各基因型质谱分析图。

具体实施方式

实施例1：PCR检测方法

(1)、样品采集：从奶牛尾静脉采抗凝血10mL，用常规方法提供其DNA；

(2)、引物设计：根据CXCR1基因编码区序列，设计引物如下：

F：ATGACAATCATCCTGAAAGA(SEQ ID No.1)

R：TCAGAGGGTAGTAGACGTGT(SEQ ID No.2)

(3)PCR与测序：

PCR反应体系如下：

编号组分体积(μl)110×PCR Buffer32dNTP mix(10mM)0.53Forward Primer(10μM)0.54Reverse Primer(10μM)0.55rTaq0.56DNA17加ddH₂O至30

PCR循环参数如下：

对PCR产物，直接用ABI 9700型测序仪进行测序。对测序所得结果，用DNAMAN和Chromas软件，与参考序列(登录号：NM_001105038.1))进行比对，并判定其基因型(图1)。

实施例2：

同时也可采用飞行质谱方法进行快速大批量检测，且平均每个样本检测成本更便宜，低至3-4元/个样品。详细方法如下：

引物设计：

cxcr1-816-F ACGTTGGATGTCATCTTTGCTGTCGTGCTC(SEQ ID No.3)

cxcr1-816-R ACGTTGGATGAGGTCTCAGCAATCACATGG(SEQ ID No.4)

cxcr1-816-U CTACAACCTGGTCCTGAT(SEQ ID No.5)

PCR扩增体系及PCR扩增程序：

其中，所有需要分型的DNA样本都稀释到5ng/μl，取1μl DNA样本，将其与0.95μl水、0.625μl PCR缓冲液(含15mM MgCl₂)、1μl>2、1μl>

采用飞行时间质谱法(MALDI-TOF System)对以上SNP进行检测。飞行时间质谱法检测方法如下：

PCR扩增后，剩余的dNTP将被去磷酸消化掉，反应体系包括1.53μl水、0.17μl SAP缓冲液、0.3单位碱性磷酸酶(Sequenom)。该反应在37℃进行40分钟，然后85℃5分钟使酶失活。碱性磷酸酶处理后，针对SNP的单碱基延伸引物在下列反应体系中进行：0.755μl水、0.2μl 10X iPLEX缓冲液、0.2μl终止混合物、0.041μl iPLEX酶(Sequenom)，0.804μl 10M的延伸引物。

单碱基延伸反应在下列条件下进行：94℃30秒；94℃5秒，52℃5秒，80℃5秒5个循环，共40个循环；最后72℃3分钟。在终止反应物中加入6mg阳离子交换树脂(Sequenom)脱盐，混合后加入25μl水悬浮。使用MassARRAY Nanodispenser(Sequenom)将最终的分型产物点样到一块384孔的spectroCHIP(Sequenom)上，并用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱进行分析。最终结果由MassARRAY RT软件系统(版本号3.0.0.4)实时读取，并由MassARRAYTyper软件系统(版本号3.4)完成基因分型分析(见图2)。图2中，横座标为质谱分子量单位(道尔顿)，纵座标为不同等位基因光强度值。CXCR1-816位点检测范围在5680-5720道尔顿间，其中A基因检测分子量为5708左右，C基因检测分子量为5680左右。如在相应检测分子量处有较高的光强度值，则表示该个体具有该等位基因。如在这2个分子量处有双峰，则该个体为杂合子。图2中分别表示CXCR1-816位点3种不同的基因型(AA、AC和CC)。检测结束后，用仪器自带的分析软件TYPER对实验结果进行分析，获得分型数据。

本发明通过对大样本奶牛群体(966头)CXCR1基因编码区进行测序，结合飞行质谱方法进行SNP分析，发现4个SNP连锁群。同时收集这些奶牛2013到2015年这3年间的产犊间隔等繁殖信息，通过多因素方差分析发现CXCR1基因816A/C突变显著影响奶牛产犊间隔，CC型奶牛产犊间隔显著低于AA型奶牛，比AA型奶牛缩短15天左右。如按50元/天饲养成本计算，每胎可节约饲养成本750元。因此，增加本研究发现的分子标记CXCR1-816A/C检测。

在全国各种公牛站进行常规奶牛育种工作中，增加本研究发现的分子标记CXCR1-816A/C检测，筛选其中CC型个体公牛，并与母牛进行配种，可增加其后代母牛CXCR1-816CC和AC型个体比例。如按目前中国荷斯坦牛1000万头计算，共可增产75亿元。同时母牛产犊次数可增加，从而减少因淘汰奶牛而购买其他奶牛的所产生的费用。因此，如这一技术能在全国范围内推广应用，其间接产值可增加近80亿元以上，具有较好的应用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 扬州大学

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