一种丽蕾金线兰多糖提取物的制备方法及应用

摘要

本发明涉及一种丽蕾金线兰多糖提取物的制备方法，制备方法包括原料脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的丽蕾金线兰多糖提取物。本发明提取物中丽蕾金线兰多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占丽蕾金线兰提取物重量百分比74％以上。

说明书

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种具有抗疲劳作用的丽蕾金线兰多糖提取物的制备方法及其用途。

背景技术

疲劳是一种常见的生理现象，其过程为过度劳动或运动引起机体生理生化功能改变而导致机体劳动或运动能力的暂时降低，实际上疲劳是防止机体发生机能衰竭而产生的一种保护性反应。疲劳可以导致精神不振、注意力不集中、抵抗力下降等一系列后果，严重影响工作效率或运动成绩，故研究延缓或消除疲劳的措施具有十分重要的意义。目前市场上用于抗疲劳的化学药物在延缓疲劳和消除疲劳方面具有一定的效果，但是长期服用，具有一定的成瘾性和依赖性，因此限制了其临床应用。因此，从天然植物资源中提取安全、有效、不含对人体有害成分的抗疲劳成分已成为近年来抗疲劳药物的研究热点。

丽蕾金线兰为兰科开唇兰属植物丽蕾金线兰Anoectochilus>Rolfe exDownie 的新鲜或干燥全草。现有关于丽蕾金线兰的研究较少，未见其具有抗疲劳作用的相关报道。

发明内容

本发明目的之一是提供一种具有确切的抗疲劳活性， 无毒副作用的丽蕾金线兰多糖提取物的制备方法。

本发明的目的之二是将上述丽蕾金线兰多糖提取物制成各种抗疲劳药物制剂或制备其他抗疲劳药物的原料药。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种丽蕾金线兰多糖提取物的制备方法，丽蕾金线兰原料药材脱脂后，再经过水提取、醇沉淀得到粗多糖，粗多糖经过透析、离子交换层析脱去蛋白、色素，除去小分子化学成分，制成较高纯度的丽蕾金线兰多糖提取物。

其包括以下具体步骤：

（1）将丽蕾金线兰药材用高浓度乙醇回流除去脂溶性杂质；

（2）残渣加水加热提取，滤液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得沉淀；

（3）沉淀依次用无水乙醇、丙酮分别洗涤；

（4）洗涤后的沉淀用蒸馏水溶解后透析；

（5）透析液浓缩至一定体积，采用阳离子交换树脂法脱去多糖中的色素和蛋白质；

（6）将除去色素和蛋白质的洗脱液浓缩，加入乙醇醇沉，离心得多糖沉淀；

（7）多糖沉淀依次用无水乙醇、丙酮分别洗涤，干燥，即得丽蕾金线兰多糖提取物。

为了达到更好的提取效果，优选的，

步骤（1）中将丽蕾金线兰用10～14倍重量的80～95％乙醇回流脱脂2～3 次，每次回流1.5～3h；

步骤（2）中将残渣加 10～16倍重量的蒸馏水加热提取2～3次，每次提取2～3h，合并提取液，将提取液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为1～3：1，加入95％乙醇醇沉至含醇量为80％，静置12h，离心得收集沉淀；

步骤(3)、(7)中将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤；

步骤(4)中的沉淀以10～50倍重量的蒸馏水复溶，用截留相对分子量3500以上的透析袋透析24～72h。

步骤(5)中将多糖透析液通过JK008型、732 型阳离子交换树脂，收集过柱液，然后用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，流速为2 BV/h。

步骤（6）将洗脱液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为1～3：1，加入95％乙醇醇沉至含醇量为80％，静置12h，离心得沉淀。

沉淀依次用无水乙醇，丙酮分别洗涤，干燥，得脱蛋白和色素的丽蕾金线兰多糖提取物。

本发明丽蕾金线兰多糖提取物中单糖组成摩尔比为甘露糖：半乳糖醛酸：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖=0.15:0.06:0.78:0.38:0.10，多糖的含量以葡萄糖计，所述丽蕾金线兰多糖提取物中总多糖的含量占提取物重量百分比的74％以上。

本发明的优点在于：

本纯化的丽蕾金线兰多糖提取物经药效学实验表明能显著延长小鼠负重游泳时间，降低小鼠游泳后血清尿素氮、血清乳酸含量，提高小鼠在应激状态下的抗氧化能力，提高肝糖原和肌糖原含量，具有明显的抗疲劳作用。

附图说明

图1是根据本发明的一个实施方式的丽蕾金线兰多糖提取物的单糖衍生物的高效液相色谱（HPLC）图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的， 并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例 1

取丽蕾金线兰药材2kg，用12倍重量80%的乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，将滤渣晾干，残渣加12倍重量的蒸馏水加热提取3次，每次2 h，过滤，合并提取液，将提取液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为2：1，加入95%的乙醇至含醇量为80％，静置12 h，离心，收集沉淀，将沉淀用4倍量无水乙醇、丙酮分别洗涤，再将沉淀物干燥，即得丽蕾金线兰粗多糖提取物。将丽蕾金线兰粗多糖加水溶解，上清液用截留相对分子量为3500以上的透析袋透析48h，然后将透析液通过JK008型阳离子交换树脂，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，流速为2BV/h。收集水洗脱液，将洗脱液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为2：1，加入95%的乙醇至含醇量为80%，静置12 h，离心，收集沉淀，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮分别洗涤，干燥，得脱蛋白和色素的丽蕾金线兰多糖提取物。本发明丽蕾金线兰多糖提取物中多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占丽蕾金线兰多糖提取物重量百分比为78.38％。

实施例2

取丽蕾金线兰药材2kg，用10倍量95%的乙醇加热回流提取3次，每次2h，过滤，将滤渣晾干，残渣加10倍量的蒸馏水加热提取3次，每次2 h，过滤，合并提取液，将提取液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为1：1，加入95%的乙醇至含醇量为80％，静置12 h，离心，收集沉淀，将沉淀用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，再将沉淀物干燥，即得丽蕾金线兰粗多糖提取物。将丽蕾金线兰粗多糖加水溶解，上清液用截留相对分子量为3500以上的透析袋透析48h，然后将透析液通过732型阳离子交换树脂，用3倍柱体积的蒸馏水洗脱，流速为2 BV/h。收集水洗脱液，将洗脱液浓缩，浓缩液与原药材的体积质量比为1：1，加入95%的乙醇至含醇量为80%，静置12 h，离心，收集沉淀，沉淀依次用4倍量无水乙醇、丙酮洗涤，干燥，得脱蛋白和色素的丽蕾金线兰多糖提取物。本发明丽蕾金线兰多糖提取物中多糖的含量以葡萄糖计，所述多糖的含量占丽蕾金线兰多糖提取物重量百分为74.42％。

实施例3丽蕾金线兰多糖提取物（实施例1中提取物）的抗疲劳实验

取雄性ICR小鼠，体重18-22g，随机分为空白对照组、红景天提取物组（阳性药物组）、组丽蕾金线兰多糖提取物低剂量组、丽蕾金线兰多糖提取物中剂量组、丽蕾金线兰多糖提取物组，每组8只小鼠。连续给药14 d，末次给药1h后，各组小鼠分别进行负重游泳力竭实验。在小鼠尾根部各负荷其体重10％的铅丝作为重物，放入玻璃缸内，水深35cm，水温(25±0.5)℃，保证小鼠在水中不能用尾巴接触箱底。当小鼠头部沉入水中，10s内不能浮出水面的时间，此时间即为小鼠力竭游泳时间。在停止游泳休息20 min后采血，按照试剂盒说明书测定小鼠血清尿素氮（BUN）、乳酸（BLA）含量；取小鼠肝脏和腓肠肌，按试剂盒说明书测定肝脏超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、肝糖原和腓肠肌肌糖原的含量。实验结果见表 1、表2。

表1 丽蕾金线兰多糖提取物对小鼠力竭游泳时间、血清BUN和LDH的影响（n=8，）

注：*p<0.05，**p<0.01，与空白对照组比较

表2丽蕾金线兰多糖提取物对小鼠肝脏SOD、MDA、肝糖原和肌糖原的影响（n=8，）

注：*p<0.05，**p<0.01，与空白对照组比较

实验结果：由表1、表2可知，丽蕾金线兰多糖提取物低剂量和高剂量能显著延长小鼠负重游泳时间，降低小鼠血清中的BUN和LDH含量，提高肝组织中SOD含量，降低肝组织中MDA水平，增加肝糖原和肌糖原含量，由此表明，本发明中丽蕾金线兰多糖提取物具有明显的抗疲劳作用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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