LncRNA‑TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用

摘要

本发明公开了LncRNA‑TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。本发明首次发现LncRNA‑TUG1在牙周膜干细胞干性维持过程中起了重要的调控作用，当LncRNA‑TUG1下调，PDLSCs的增殖、自我更新、分化、迁移能力均受到抑制，由此确认LncRNA‑TUG1可作为多能干细胞干性维持的潜在靶点，推动开发出新的关于LncRNA‑TUG1相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。

说明书

技术领域

本发明涉及口腔组织再生领域技术领域，具体涉及LncRNA-TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。

背景技术

牙周组织再生是口腔医学研究的重点之一，是牙周病学、颌面外科学、正畸学、修复学等多学科领域研究的共同目标。近年来，关于牙齿干细胞及组织工程技术的研究进展给牙周组织生物学再生带来了新的研究方向。2004年Seo等利用单细胞克隆技术，从人体的牙周膜组织中成功分离并鉴定出一种新的成体干细胞，即牙周膜干细胞，为口腔进行生物功能修复开拓了新思路。

牙周膜干细胞(PDLSCs)是一类在口腔临床工作中较易获得的、间充质来源的成体干细胞；也是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞，含有成纤维细胞、成骨细胞、成牙骨质细胞及未分化前体干细胞等多种细胞成分，具有合成新生牙周组织的潜能，可移行于牙根面并进行迁移、增殖、分化等一系列生物学活动，形成新生的牙周组织结构，建立新附着关系，在牙周再生中发挥极其重要的主导作用。它可表达干细胞标记物并具备干细胞样特性(stem-cell-like ability)，具备自我更新及多向分化能力；能表现出较高的增殖和克隆形成能力，可维持牙周组织的再生修复。在体外通过适当的诱导能够形成骨、软骨、神经、脂肪、血管等多种组织；具备潜在分化为成骨细胞或成牙骨质细胞的能力，并能在体内移植后形成牙骨质-牙周膜-牙槽骨样结构物，为牙齿和牙周组织生物学再生提供了可能；在口腔临床的骨组织维持、骨再生、牙周改建、修复及正畸治疗中，PDLSCs可发挥分化、增殖、自我更新、迁移等作用，为促进牙周组织改建、生物性牙根形成、骨组织愈合及骨再生方面提供了重要的临床应用价值。本申请发明人课题组前期已在国际上率先提出利用牙齿相关干细胞进行生物牙根再生的新理念，并进行了系列相关体内、体外实验，如在小型动物模型上成功再生出可正常行使功能的生物牙根；将自体异体牙周膜干细胞及Vc诱导的牙周膜干细胞膜片用于组织再生，并取得了良好的效果；同时，发现抑制miRNA-21的表达可以促进牙周膜干细胞成骨分化及组织再生。

在人类基因组研究中，学者们发现一种长度超过200bp的非编码RNA(long non coding RNA，lncRNA),这类RNA本身不编码蛋白，由真核生物基因组转录而来，以RNA的形式存在多种层面上，如表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等调控基因的表达水平。研究显示，LncRNA参与众多的生命调节活动：可对蛋白编码基因进行表观遗传学调节；直接调节基因转录及蛋白质降解；参与某些细胞器的生成过程及细胞内分子的亚细胞运输，并常与基因印迹现象有关。

牛磺酸上调基因1(Taurine upregulated gene 1,TUG1)的表达产物是一种长链非编码RNA。最早在小鼠视网膜细胞中发现，在细胞核和细胞质中均表达，敲除TUG1后会引起视网膜发育畸形，导致细胞生长减慢或凋亡。LncRNA-TUG1位于人类染色体22q12.2，长度约为7.1kb，具有数个开放阅读框架但最长的编码不超过100个氨基酸，因此认为它是非编码RNA。它可以与甲基化的polycomb repressive complex 2(PRC2)蛋白结合，从而调控某些生长控制基因的表达。沉默TUG1可以导致细胞生长减慢或凋亡，几种与细胞凋亡有关的基因在沉默TUG1后均表达上调。对于视网膜祖细胞进行TUG1siRNA转染后三天，几种与细胞凋亡通路相关的基因表达上调，细胞死亡增加，TUG1的正常表达可能对于抑制某些细胞凋亡相关基因起到重要作用。TUG1对血管平滑肌细胞中SM22α具有调节作用。敲低TUG1后，细胞生长减慢或凋亡，SM22αmRNA表达上调；它可以与多梳蛋白抑制复合体2(Polycomb repressive complex 2,PRC2)中EZH2蛋白结合，从而调控某些生长控制基因的表达；胞浆中的EZH2具有甲基转移酶活性并且在PDGF诱导的细胞伪足的形成过程中起关键作用，得出TUG1与EZH2、F-actin之间的相互作用机制及其对血管平滑肌细胞骨架的调节作用。研究人员还发现TUG1启动子附近包括一些高度保守的P53绑定位点，能够被P53介导的DNA损伤应答所刺激并表达上调。

干细胞的干性维持能力，主要体现在高增殖、低分化、自我更新、具备迁移能力及干性相关基因(如Sox2，KLF4，Nanog，c-myc和oct4)的表达(stemness associated genes)，通常被认为可以维持干细胞的干性。最近的研究也表明，这些干细胞相关基因表达主要体现在一些肿瘤中，并调控肿瘤的成瘤和转移，干性相关基因及其信号通路异常可能是肿瘤发生和转移的机制。沉默miR-302-367簇的启动子可以使胚胎干细胞缺乏干细胞的表型和特性，而在人皮肤癌细胞中过表达miR-302-367簇后细胞具有多能性胚胎干细胞特性，表现为干细胞标记Oct3/4,SSEA-3,SSEA-4,Sox2和Nanog的表达。

然而，目前还未有关于LncRNA调控人牙周膜干细胞的干性维持能力的报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供LncRNA-TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供LncRNA-TUG1作为生物标志物在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。

本发明的第二方面，提供LncRNA-TUG1促进剂在制备正性调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。

上述应用中，所述LncRNA-TUG1促进剂是指任何可以提高LncRNA-TUG1的活性、增加LncRNA-TUG1表达量的物质，例如增加LncRNA-TUG1表达量的LncRNA-TUG1的过表达载体。

上述应用中，所述正性调控牙周膜干细胞的干性维持能力包括：促进牙周膜干细胞的增殖能力、促进牙周膜干细胞的多向分化能力、促进牙周膜干细胞的迁移能力和促进细胞干性相关因子表达的能力。

本发明的第三方面，提供LncRNA-TUG1抑制剂在制备负性调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用。

上述应用中，所述LncRNA-TUG1抑制剂包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等。任何可以降低LncRNA-TUG1的活性、减少LncRNA-TUG1表达量的物质均可用于本发明。

作为优选的，所述LncRNA-TUG1抑制剂为抑制LncRNA-TUG1表达的慢病毒载体。

上述应用中，所述负性调控牙周膜干细胞的干性维持能力包括：抑制牙周膜干细胞的增殖能力、抑制牙周膜干细胞的多向分化能力、抑制牙周膜干细胞的迁移能力和抑制细胞干性相关因子表达的能力。

本发明的第四方面，提供一种调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物组合物，所述药物组合物含有有效量的上述LncRNA-TUG1促进剂或LncRNA-TUG1抑制剂。

进一步的，所述药物组合物中还包含：药学上可接受的载体。

所述“药学上可接受的载体”为常规的给药载体，包括各种赋形剂或稀释剂等。

上述技术方案具有如下有益效果：

本发明首次发现LncRNA-TUG1在牙周膜干细胞干性维持过程中起了重要的调控作用，当LncRNA-TUG1下调，PDLSCs的增殖、自我更新、分化、迁移能力均受到抑制，由此确认LncRNA-TUG1可作为多能干细胞干性维持的潜在靶点，推动开发出新的关于LncRNA-TUG1相关药物或因子，并最终将其运用到再生医学领域，达到临床上真正的精准医疗。

附图说明

构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1：牙周膜干细胞的生物学特性研究结果；A为原代培养的PDLSCs(P0)；B为第三代培养的PDLSCs(P3)；C为干细胞表面标志物的鉴定结果；D和E分别为PDLSCs成骨向、脂肪向诱导分化的能力。A、B、D、E中Scale bar：200μm。

图2：慢病毒载体转染PDLSCs用以降低TUG1的表达.A.免疫荧光染色(scale bar：200um)；B.qRT-PCR。

图3：TUG1对牙周膜干细胞增殖能力，细胞周期和凋亡能力的影响；图中，A.EdU显示sh-NC和sh-TUG1-2#组的增殖能力；B.CCK-8法显示sh-NC和sh-TUG1-2#组的增殖能力；C.MTT法显示sh-NC和sh-TUG1-2#组的增殖能力；D.克隆形成实验显示sh-NC和sh-TUG1-2#组的细胞增殖和自我更新能力；E、F.TUG1对牙周膜干细胞细胞周期和凋亡能力的影响。(以p<0.05有统计学意义；*p<0.05、**p<0.01)，A、D中Scale bar：200μm。

图4：TUG1对人牙周膜干细胞多向分化能力的影响；图中，A、B.ALP染色(7d)和ALP活性；C、D.茜素红染色(21d)和钙离子浓度；E.成骨向相关因子(ALP、Runx2、OCN)的表达情况；F、G、H.油红O染色和成脂肪相关因子的表达情况。A、C、F中Scale bar：200μm。

结果显示sh-TUG1-2#组较空载体组呈下降趋势。(以*p<0.05有统计学意义)。

图5：TUG1对人牙周膜干细胞迁移能力的影响；图中，A为Transwell实验；B为划痕实验；结果显示sh-TUG1-2#组较空载体组(sh-NC)的迁移能力呈减弱趋势，Scale bar：200μm。(以*p<0.05有统计学意义)。

图6：TUG1对人牙周膜干细胞干性相关因子的影响；图中，A.干性相关因子mRNA水平的变化；B.干性相关因子蛋白水平的变化。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，目前还未有关于LncRNA调控人牙周膜干细胞的干性维持能力的报道。基于此，本发明通过LncRNA-TUG1调控PDLSCs干性维持能力的体外实验，并对其相关机制进行分子水平研究，提出了LncRNA-TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的新用途。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1：牙周膜干细胞的生物学特性研究

1.人牙周膜干细胞的分离和培养

麻醉下无菌拔除人阻生第三磨牙，轻轻剥离其周围的牙周组织，取中段的牙周组织，用PBS反复清洗，剪碎，置于含Ⅰ型胶原酶(3g/L)和DispaseⅡ酶(4g/L)的消化液，37℃下消化40分钟，过70um细胞筛收集细胞，1000转/分钟，离心5分钟，去除上层的液体，用新鲜的培养液重新悬浮成单细胞悬液。将细胞接种于25cm²细胞培养瓶中，在α-MEM培养基(含15％胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中37℃、5％CO₂培养，每隔2-3天换液1次，在倒置相差显微镜下观察细胞生长状况。当细胞生长至80％汇合状态时，用0.25％胰蛋白酶按1：2或1：3消化传代。

结果见图1A和图1B。

2.自我更新能力检测和牙周膜干细胞标志物的表达情况

应用流式细胞术，观察牙周膜干细胞STRO-1，CD146，CD45，CD31等间充质干细胞标志物的表达情况。

结果见图1C。

3.多向分化能力检测

将牙周膜干细胞分别在成骨向诱导培养基和脂肪向诱导培养基中培养3周，然后分别通过茜素红染色、油红O染色以及RT-PCR技术检测其多向分化潜能。

结果见图1D和图1E。

由上述结果可以看出，分离培养的PDLSCs通过鉴定和诱导，可分化为成骨细胞、脂肪细胞等，具备干细胞的多向分化潜能。

实施例2：LncRNA-TUG1对牙周膜干细胞干性维持能力的调控影响

1.慢病毒载体的构建：

根据人LncRNA-TUG1序列(ID:55000)设计引物，引物由上海领科生物科技有限公司合成并纯化。退火后连接至线性化的pGenesil-1质粒，构建LncRNA-TUG1(沉默)的表达载体慢病毒，抑制LncRNA-TUG1的表达。

具体如下：

Vector：pLenO-GFP

Lenti-human-NC序列：TTCTCCGAACGTGTCACGT(SEQ ID NO:1)；(Negative Control)。

Lenti-human-sh1 TUG1

GPH-hTUG1-SH1 Forward Sequence

5’-GATCCCTGTTGACCTTGCTGTGAGAACTTCCTGTCAGATTCTCACAGCAAGGTCAACAGTTTTTG-3’(SEQ ID NO:2)；

GPH-hTUG1-SH1 Reverse Sequence

5’-AATTCAAAAACTGTTGACCTTGCTGTGAGAATCTGACAGGAAGTTCTCACAGCAAGGTCAACAGG-3’(SEQ ID NO:3)。

Lenti-human-sh2 TUG1

GPH-hTUG1-SH2 Forward Sequence

5’GATCCGCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTTCTTCCTGTCAGAAAAGGATTCAGAATAGAAGCCAAGCTTTTTG3’(SEQ ID NO:4)；

GPH-hTUG1-SH2 Reverse Sequence

5’-AATTCAAAAAGCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTTTCTGACAGGAAGAAAGGATTCAGAATAGAAGCCAAGCG-3’(SEQ ID NO:5)。

Lenti-human-sh3 TUG1

GPH-hTUG1-SH3 Forward Sequence

5’-GATCCGCTACAACTATCTTCCTTTACCTTCCTGTCAGAGTAAAGGAAGATAGTTGTAGCTTTTTG-3’(SEQ ID NO:6)；

GPH-hTUG1-SH3 Reverse Sequence

5’-AATTCAAAAAGCTACAACTATCTTCCTTTACTCTGACAGGAAGGTAAAGGAAGATAGTTGTAGCG-3’(SEQ ID NO:7)。

Lenti-human-sh4 TUG1

GPH-hTUG1-SH4 Forward Sequence

5’-GATCCGCAAGAGATAACTATGAAAGCCTTCCTGTCAGAGCTTTCATAGTTATCTCTTGCTTTTTG-3’(SEQ ID NO:8)；

GPH-hTUG1-SH4 Reverse Sequence

5’-AATTCAAAAAGCAAGAGATAACTATGAAAGCTCTGACAGGAAGGCTTTCATAGTTATCTCTTGCG-3’(SEQ ID NO:9)。

考察构建的不同慢病毒载体对LncRNA-TUG1的沉默效果，结果见图2。由图2可以看出，sh-TUG1-2#的沉默效果最明显。因此，以sh-TUG1-2#用于后续的试验研究。

2.试验分组：

试验分为三组，分别为：Control组、sh-NC组、sh-TUG1-2#组。

用无血清培养基清洗细胞，将sh-TUG1-2#和sh-NC空载体，按照转染步骤说明书加入到细胞中。8-10h后换用正常的培养基，孵育24h后在荧光显微镜下观察，出现绿色荧光说明转染成功，完成后续干性维持能力的相关验证。

3.细胞增殖实验：

EdU、MTT、CCK-8法和克隆形成实验检测细胞增殖率；细胞周期及凋亡实验检测其对细胞特性的影响，结果见图3。

由图3可以看出，沉默LncRNA-TUG1，细胞的增殖能力减弱，凋亡能力增强。

4.多向分化能力检测：

(1)成骨向分化能力测定：

ALP染色和茜素红染色，并进行ALP活性、钙离子浓度测定，通过实时定量PCR检测成骨关键因子Runx2、ALP和OCN基因的表达变化。

(2)成脂向分化能力测定：

进行油红染色及PPARγ和LPL因子的测定。

多向分化能力检测的结果如图4所示。由图4可以看出，沉默LncRNA-TUG1，细胞的成骨向和成脂肪向能力减弱。

5.迁移能力检测：

采用Transwell和划痕实验对迁移能力进行检测，结果如图5所示。有图5可以看出，沉默LncRNA-TUG1，细胞的迁移能力减弱。

6.干性相关因子的测定：

对干性相关因子的mRNA和蛋白水平进行测定，结果如图6所示。由图6可以看出，沉默LncRNA-TUG1，细胞干性相关因子表达减弱。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> LncRNA-TUG1在制备调控牙周膜干细胞的干性维持能力的药物中的应用

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