一种诱导SH‑SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法

摘要

本发明提供了一种诱导SH‑SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，采用以下步骤：SH‑SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH‑SY5Y细胞的细胞悬液；将上述细胞悬液铺板于培养皿以诱导培养基培养，获得多巴胺能神经元。本发明诱导SH‑SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用含有aFGF、TPA、毛喉素（Forskolin）、dbcAMP和普拉克索的诱导培养基培养SH‑SY5Y细胞后，可将其诱导为多巴胺能神经元，并可以分泌多巴胺；在优化条件下，多巴胺能神经元分化率约为15%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的5%，分化率高、分化水平高。

说明书

技术领域

本发明涉及神经科学研究领域的细胞转分化技术，特别涉及一种诱导SH-SY5Y细胞（人神经纤维母细胞瘤细胞）分化为多巴胺能神经元的方法。

背景技术

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是一种常发生于中老年人的神经退行性疾病，临床症状主要表现为静止性震颤、运动迟缓、肌强直、姿势步态异常等。其发病率有随着年龄增长而有增加的趋势，给患者的生活和工作带来诸多不便。PD的主要病理改变为中脑黑质多巴胺神经元的变性坏死，科研上使用的小鼠PD模型，常常是用6-OHDA、MPTP等构建的模型，其原理就是造成黑质纹状体的多巴胺能神经元大量死亡，使小鼠表现出PD的典型症状。

多巴胺能神经元主要位于大脑的黑质致密部，也存在于中脑的腹侧被盖区，一些多巴胺能神经元位于弓状核下丘脑。这些神经元使用神经递质多巴胺传送信息给身体。多巴胺控制大脑的许多功能，包括情绪，压力和肌肉控制。缺乏多巴胺能神经元可能引起帕金森氏病。多巴胺能神经元是身体产生多巴胺的主要来源，缺乏多巴胺可能导致不自主的肌肉运动，是帕金森氏病的主要症状。酪氨酸羟化酶（Tyrosine Hydrolase，TH）是多巴胺能神经元中含有的一种酶，多巴胺能神经元可以从细胞外摄取酪氨酸，在胞浆内经TH催化形成左旋多巴，再经芳香族氨基酸脱羧酶催化形成多巴胺。TH蛋白是多巴胺能神经元的重要特异性标记物。多巴胺转运蛋白（Dopamine transporter, DAT）主要存在于纹状体、伏隔核等多巴胺能神经元密集的核团，对突触间隙内的多巴胺能水平起调控作用。DAT对于多巴胺能神经元行使正常的生理功能是必需的，是成熟神经元的重要特异性标志物。

SH-SY5Y细胞系为人神经纤维母细胞瘤细胞株，是目前体外探讨老年痴呆症、PD病等神经退行性疾病发病机制的常用细胞模型，也是体外筛选抗神经退行性疾病药物的细胞模型之一。但SH-SY5Y细胞是未分化状态的细胞，与体内高度分化的神经细胞相比，无论在表观形态学还是在胞内物质代谢、基因表达上都存在差异，必然影响实验结果。也有学者使用维甲酸（RA）分化SH-SY5Y为神经元后，将其作为研究PD等病的细胞模型，相比较SH-SY5Y而言，神经元同多巴胺能神经元更为相似，但是RA作为一种强烈的畸胎剂，可以扰乱分化出的神经元的结构和特性，有可能在结果上与多巴胺能神经元产生分歧。科研上也有使用分化神经干细胞（neural stem cell，NSC）为多巴胺能神经元作为模式细胞，但是NSC一般来源于胚胎的前脑、中脑，往往有伦理学上的应用局限，而且作为细胞模型，又需要有大量而稳定的细胞储备。

发明内容

为了解决当前缺乏合适的研究帕金森病（PD）的细胞模型的问题，本发明提供了一种高效由SH-SY5Y细胞诱导分化为多巴胺能神经元的方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，采用以下步骤：

（1）SH-SY5Y细胞培养：SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养至一定融合度，进行消化，获得SH-SY5Y细胞的细胞悬液；

（2）诱导分化：将步骤（1）的细胞悬液铺板于培养皿以诱导培养基培养，获得多巴胺能神经元。

所述基础培养基为含有15 %胎牛血清（FBS）和1 %Antibiotic- Antimycoticmixture的DMEM/ F12培养基；所述融合度为80 %-90 %。

作为优化，步骤（2）操作为将步骤（1）的细胞悬液加入基础培养基，铺板于培养皿，培养24h后更换为诱导培养基，继续培养，获得多巴胺能神经元。

每皿加入细胞终密度为0.5×10⁵->5>个/mL，优选为1×10^{5>个/mL；诱导培养基加入量为3-6 mL/皿，优选为4 mL/皿；培养的时间为4-11天，优选为6-8天。}

所述诱导培养基中含诱导剂aFGF 50-150ng/mL，TPA 50-150nM，毛喉素25μM，dbcAMP 50-150μM，普拉克索10μM。

作为优化，所述诱导培养基成分为DMEM/F12培养基，还含有 B27 1:50、FBS 1%、Antibiotic- Antimycotic mixture 1 %、肝素钠5μg/ml、左旋谷氨酰胺2mM、aFGF 100ng/mL、TPA 100nM、毛喉素25 μM、dbcAMP 100 μM、普拉克索10 μM。

所述培养皿直径为60mm；细胞培养时每48-72h更换全部诱导培养基一次，优选为48h。

所述DMEM/F12培养基是培养细胞的常用公知的培养基，Antibiotic-Antimycotic mixture为培养细胞的常用公知的抗生素，可从商业途径购买得到。

DMEM/F12培养基含有以下成分（g/L）：无水氯化钙 116.6，L-亮氨酸 59.05，亚油酸 0.042，五水硫酸铜 0.0013，L-赖氨酸盐酸盐 91.25，硫辛酸 0.105，九水硝酸铁 0.05，L-蛋氨酸 17.24，酚红 8.1，七水硫酸亚铁 0.417，L-苯丙氨酸 35.48，1,4-丁二胺二盐酸盐 0.081，氯化钾 311.8，L-丝氨酸 26.25，丙酮酸钠 55，氯化镁 28.64，L-苏氨酸 53.45，维生素H 0.0035，无水硫酸镁 48.84，L-丙氨酸 4.45，D-泛酸钙 2.24，氯化钠 6999.5，L-天门冬酰胺 7.5，氯化胆碱 8.98，无水磷酸二氢钠 54.35，L-天门冬氨酸 6.65，叶酸2.65，磷酸氢二钠 71.02，L-半胱氨酸盐酸盐 17.56，i-肌醇 12.6，七水硫酸锌 0.432，L-谷氨酸 7.35，烟酰胺 2.02，L-精氨酸盐酸盐 147.5，L-脯氨酸 17.25，盐酸吡哆醛 2，L-胱氨酸盐酸盐 31.29，L-色氨酸 9.02，盐酸吡哆醇 0.031，L-谷氨酰胺 365，L-酪氨酸 38.4，核黄素 0.219，甘氨酸 18.75，L-缬氨酸 52.85，盐酸硫胺 2.17，L-组氨酸盐酸盐 31.48，D-葡萄糖 3151，胸苷 0.365，L-异亮氨酸 54.47，次黄嘌呤 2，维生素B₁₂>

Antibiotic- Antimycotic mixture含有以下成分：青霉素（碱） 10000 单位/mL、链霉素（碱） 10000 µg/mL和两性霉素B 25 µg/mL。

本发明通过将普拉克索、aFGF、TPA、dbcAMP和毛喉素这些诱导因素进行组合将SH-SY5Y细胞转分化为多巴胺能神经元。这些药物诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元、表达多巴胺转运蛋白的效应可以归因于它们的协同作用。

本发明具有以下优点：

本发明诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用含有aFGF、TPA、毛喉素（Forskolin）、dbcAMP和普拉克索的诱导培养基培养SH-SY5Y细胞后，可将其诱导为多巴胺能神经元，并可以分泌多巴胺；在优化条件下，多巴胺能神经元分化率约为15%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的5%，分化率高、分化水平高。

附图说明

图1为诱导剂诱导后分化的SH-SY5Y细胞与自然培养的SH-SY5Y细胞的免疫荧光染色图；

图2为诱导剂诱导后分化的SH-SY5Y细胞与正常培养的SH-SY5Y细胞的DAT表达图；

图3为诱导剂诱导后分化的SH-SY5Y细胞与正常培养的SH-SY5Y细胞的多巴胺释放量图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。

实施例1 培养基制备

基础培养基：DMEM/F12培养基（Gibco），FBS（15%，Gibco），Antibiotic-Antimycoticmixture （1%，Gibco）。

诱导培养基S1：DMEM/F12培养基（Gibco）、B27（1:50，Invitrogen）、FBS（1 %，Gibco）、Antibiotic- Antimycotic mixture 1 %、肝素钠（5 μg/ml，常州千红生化）、左旋谷氨酰胺（2 mM，Invitrogen）、aFGF（100 ng/mL，R&D）、TPA（phorbol 12-myristate 13-acetate，100 nM，sigma）、毛喉素（25μM，sigma）、dbcAMP （100 μM，sigma）、普拉克索（10 μM，sigma）。

诱导培养基S2：DMEM/F12培养基（Gibco）、B27（1:50，Invitrogen）、FBS（1 %，Gibco）、Antibiotic- Antimycotic mixture 1 %、肝素钠（5 μg/ml，常州千红生化）、左旋谷氨酰胺（2 mM，Invitrogen）、aFGF（50 ng/mL，R&D）、TPA（phorbol 12-myristate 13-acetate，50 nM，sigma）、毛喉素（25μM，sigma）、dbcAMP （50 μM，sigma）、普拉克索（10 μM，sigma）。

诱导培养基S3：DMEM/F12培养基（Gibco）、B27（1:50，Invitrogen）、FBS（1 %，Gibco）、Antibiotic- Antimycotic mixture 1 %、肝素钠（5 μg/ml，常州千红生化）、左旋谷氨酰胺（2 mM，Invitrogen）、aFGF（150 ng/mL，R&D）、TPA（phorbol 12-myristate 13-acetate，150 nM，sigma）、毛喉素（25μM，sigma）、dbcAMP （150 μM，sigma）、普拉克索（10 μM，sigma）。

按照上述配方分别配制基础培养基与诱导培养基，配制后滤膜除菌，备用。

实施例2 SH-SY5Y细胞的培养

复苏：取购买的SH-SY5Y细胞（购自南京凯基生物）1×10⁶于10mL基础培养基中，1000rpm离心5min，弃去上清。取8mL>2培养箱中进行培养。

培养：细胞培养每2d进行全量换液。

传代：待细胞贴合度达80%以上时，进行传代。小心吸去培养基，加入10mL PBS（Hyclone）缓冲液冲洗细胞一次，弃去缓冲液。每T25瓶细胞加入1mL Accutase酶（StemCellTECHNOLOGIES），于37℃消化1-2min，至细胞完全脱离培养瓶。4mL基础培养基终止消化。转移消化后细胞悬液于15mL离心管中，1000rpm 离心5min，弃上清，16mL基础培养基重悬细胞，均分到2个T25培养瓶中，37℃，5% CO₂培养箱中进行培养。

实施例3 SH-SY5Y细胞的诱导分化

将实施例2中传代培养的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养，待细胞融合度为80%时，Accutase酶消化细胞。在Φ60mm的培养皿中置入多聚赖氨酸包被的玻片（细胞爬片）4片，每皿加入1×10⁵个SH-SY5Y细胞，基础培养基补充体系至4mL。培养24h待SH-SY5Y细胞贴壁后，弃去全部基础培养基，更换为4mL诱导培养基S1。每隔2d全换液诱导培养基S1一次，培养7d后即得多巴胺能神经元。

实施例4 诱导SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的效果监测

1. 诱导分化产生的多巴胺能神经元进行β-tubulin III及TH双染荧光染色

将实施例3中细胞爬片取出放入含PBS的6孔板中，每孔一片，共2片。轻轻漂洗一次后，弃PBS。加入4%多聚甲醛固定15-20 min。用0.1%的Tritonx-100透化处理5-10min后，用PBS漂洗3次，每次5 min。用5%驴血清蛋白37℃封闭1 h，然后用PBS漂洗3次，每次5 min。加1抗Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Rabbit (CHEMICON CA)和Anti-β-TUBLIN III Mouse（sigma）至1:400终浓度（用封闭液稀释），37℃孵育1h，用来标记多巴胺能神经元和所有神经元。PBS漂洗3次，每次5 min。然后加2抗Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) RhodamineTRITC (Jackson Immuno-Research)和Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) FluoresceinFITC (Jackson Immuno- Research)至1:200终浓度（用封闭液稀释），37℃避光孵育1h，对相应一抗染上红色和绿色。PBS漂洗3次，每次5min。取干净的载玻片，涂布10μl防荧光猝灭剂，将爬片细胞面向下置于防荧光猝灭剂上，防荧光猝灭剂含DAPI染液，染核10min后，显微镜下观察荧光信号；自然培养的SH-SY5Y细胞为对照，实验操作相同。

诱导后分化的SH-SY5Y细胞与自然培养的SH-SY5Y细胞免疫荧光染色的结果如图1，左图（400X）为诱导分化的SH-SY5Y，右图（400X）为自然培养的SH-SY5Y。灰色标记为普通神经元，白色标记为多巴胺能神经元。观察结果为诱导剂诱导产生的多巴胺能神经元占所有神经元的比例约为15%，自然培养不产生多巴胺能神经元，诱导剂诱导能够显著提高多巴胺能神经元的分化率。

2. 诱导分化产生的多巴胺能神经元进行DAT荧光染色

将实施例3中的细胞爬片取出放入含PBS的6孔板中，每孔一片，共2片。轻轻漂洗一次后，弃PBS。加入4%多聚甲醛固定15-20 min。用0.1%的Tritonx-100透化处理5-10min后，用PBS漂洗3次，每次5 min。用5%驴血清蛋白37℃封闭1 h，然后用PBS漂洗3次，每次5 min。加入1抗Anti- Dopamine transporter (DAT) Rabbit (abcam)和Anti-β-TUBLIN III Mouse（sigma）至1:400终浓度（用封闭液稀释），37℃孵育1h，用来标记多巴胺能神经元。PBS漂洗3次，每次5 min。然后加2抗Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Rhodamine TRITC (JacksonImmuno-Research)和Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Fluorescein FITC (JacksonImmuno-Research)至1:200终浓度（用封闭液稀释），37℃避光孵育1h，对相应一抗染上红色和绿色。PBS漂洗3次，每次5min。取干净的载玻片，涂布10μl防荧光猝灭剂，将爬片细胞面向下置于防荧光猝灭剂上，防荧光猝灭剂含DAPI染液，染核10min后，显微镜下观察荧光信号；自然培养的SH-SY5Y细胞为对照，实验操作相同。

诱导后分化的SH-SY5Y细胞与自然培养的SH-SY5Y细胞免疫荧光染色的结果如图2所示。左图（400X）为诱导剂诱导分化的SH-SY5Y，右图（400X）为自然培养的SH-SY5Y。左图中细胞核的周围有“沙粒”状的DAT标记出现。观察结果为诱导产生的DAT阳性细胞占总细胞数的比例为5%，表明诱导出的多巴胺能神经元具有更多的多巴胺能神经元标记，具有较高的分化水平。

3. 诱导分化的多巴胺能神经元用ELISA测定多巴胺的表达。

多巴胺测定使用LDN多巴胺测定试剂盒（货号：BAE-5300），参照试剂盒的说明书进行测定，具体如下，标准品浓度共6个梯度：80ng/mL、20ng/mL、5ng/mL、1.5ng/mL、0.5ng/mL的梯度，质控品共两个：3ng/mL与11ng/mL（质控品反求浓度要求不超过40%）。先在提取板上加样：分别设标准孔、待测样品孔和质控品孔。标准品和质控品加样10µl，待测样品孔中加样500µl，然后使用超纯水将标准品和质控品稀释至500uL。室温吸附60min，弃上清，洗板，然后加入150uL酰化缓冲液和25uL酰化试剂对多巴胺进行酰化20min。弃上清，洗板两次。加入100uL盐酸解吸附多巴胺。吸取此90uL多巴胺盐酸溶液于普通96孔板（Corning）中，加入25uL儿茶酚胺-O-甲基转移酶（包含辅酶及缓冲液）进行聚合，37℃聚合2h。之后取上清液100uL，转移至预包被多巴胺的96孔板中，加入50uL抗多巴胺一抗。低温2-8℃孵育过夜（15-20h）。洗板四次后，每孔加入100uL辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育30min。洗板四次，每孔加入100uL显色剂，室温孵育20min后，加入100uL终止液，于10min内测定450nm下吸光度。

根据测定的OD值，使用非线性回归法拟合标准曲线，计算出诱导组和对照组中神经元释放多巴胺的含量。见图3，混合诱导剂诱导形成的神经元分泌的多巴胺量显著高于普通培养基培养得到的神经元。

综上所述，本发明利用aFGF、TPA、毛喉素、dbcAMP和普拉克索组成的混合诱导剂联合诱导SH-SY5Y细胞后，SH-SY5Y细胞分化为多巴胺能神经元的比例约为15%，且存在DAT标记和多巴胺释放，SH-SY5Y细胞被有效的诱导为多巴胺能神经元。

实施例5SH-SY5Y细胞的诱导分化

将实施例2中传代培养的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养，待细胞融合度为90%时，Accutase酶消化细胞。每皿加入1×10⁵个SH-SY5Y细胞，基础培养基补充体系至4mL。培养24h待SH-SY5Y细胞贴壁后，弃去全部基础培养基，更换为4mL诱导培养基S1。每隔3d全换液诱导培养基S1一次，培养8d后即得多巴胺能神经元。经检测，多巴胺能神经元分化率约为13%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的5%。

实施例6SH-SY5Y细胞的诱导分化

将实施例2中传代培养的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养，待细胞融合度为90%时，Accutase酶消化细胞。每皿加入2×10⁵个SH-SY5Y细胞，诱导培养基S3补充体系至3mL。每隔2d全换液诱导培养基S3一次，培养8d后即得多巴胺能神经元。经检测，多巴胺能神经元分化率约为11%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的3%。

实施例7SH-SY5Y细胞的诱导分化

将实施例2中传代培养的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养，待细胞融合度为80%时，Accutase酶消化细胞。每皿加入0.5×10⁵个SH-SY5Y细胞，基础培养基补充体系至6mL。培养24h待SH-SY5Y细胞贴壁后，弃去全部基础培养基，更换为6mL诱导培养基S1。每隔2d全换液诱导培养基S1一次，培养6d后即得多巴胺能神经元。经检测，多巴胺能神经元分化率约为13%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的4%。

实施例8SH-SY5Y细胞的诱导分化

将实施例2中传代培养的SH-SY5Y细胞在基础培养基中培养，待细胞融合度为80%时，Accutase酶消化细胞。每皿加入1.5×10⁵个SH-SY5Y细胞，基础培养基补充体系至5mL。培养24h待SH-SY5Y细胞贴壁后，弃去全部基础培养基，更换为5mL诱导培养基S2。每隔2d全换液诱导培养基S2一次，培养7d后即得多巴胺能神经元。经检测，多巴胺能神经元分化率约为12%，诱导出的DAT阳性细胞占总细胞数量的3%。