一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体是一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，其特征是：将烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织和不定芽在超净工作台内与正常组织分离开来，转移至空置的无菌组培瓶中，盖上瓶盖，置于光照培养箱（与正常组培条件一致）中进行饥饿处理1‑7天。待玻璃化组织恢复正常状态后，转移至分化培养基（愈伤组织）或伸长培养基（不定芽）中继续培养。应用本技术可以使烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，再经继代培养可以形成正常的再生植株。本发明的优点在于：采用了无培养基的空瓶饥饿培养方法，无需增加任何培养成分，也不需要增加其他专用设备，操作简便，效果显著。

说明书

技术领域

本发明涉及一种烟草玻璃化愈伤组织和/或不定芽（两个对象都是适用）的去玻璃化方法，属于生物技术领域。应用该方法可以使烟草组织培养过程中产生的玻璃化愈伤组织或不定芽去玻璃化，并继续正常分化或伸长，最终形成完整植株。

背景技术

烟草属于管状花科目，茄科一年生或有限多年生草本植物，目前已经发现的烟属有66个种。传统上烟草是一种重要的经济作物，在国民经济中具有重要的作用，同时也是植物学科中重要的模式物种。自第一株转基因烟草问世以来，凭借较强的细胞再生能力以及组织培养和遗传转化的易操作性，烟草成为生物技术研究领域的最为活跃的研究材料之一。在医药工程领域，利用烟草作为生物反应器，已经被广泛用于生产烟草基因工程药物、烟草药用蛋白、烟草抗体和烟草疫苗等等。目前已经有很多关于烟草组织培养以及转基因的报道，但玻璃化是外植体在组织培养过程中常见的现象，属于植物组织培养三大难题之一。烟草组织培养过程中玻璃化问题也十分严峻，亟待解决。

玻璃化现象是植物组织培养过程中特有的一种生理性病变，指在植物组织培养过程中，部分试管苗出现生长异常，组织呈现透明或半透明的水渍状，芽苗矮小肿胀失绿，叶片皱缩成纵向卷伸，脆弱易碎，又称过度水化现象。玻璃化组织常表现出分化能力低，难以增殖成芽，也难以生根成苗。目前玻璃化形成机理研究主要集中在水势过高的影响、生长调节剂平衡问题和矿质元素平衡供应问题三个方面，普遍认为是培养环境中各方面因子的共同作用导致植物组织新陈代谢紊乱，从而造成玻璃化现象的出现。现有解决办法主要有降低6-BA浓度和增加培养固化剂（琼脂或植物凝胶）的浓度，但这些办法都不能完全杜绝玻璃化现象的发生，也不能挽救玻璃化组织。

发明内容

本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种促使玻璃化的烟草愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法。该方法简单易行，操作方便，能够有效促使玻璃化的烟草愈伤组织和不定芽去玻璃化，效果显著。原玻璃化的烟草愈伤组织或不定芽经过该方法处理后，可以继续正常分化或伸长，最终形成完整植株。不需要增加额外成本就可促使玻璃化烟草愈伤组织和不定芽逆转成为正常组织。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一种烟草玻璃化愈伤组织和不定芽去玻璃化的方法，包括以下步骤：

(1) 烟草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：当正常培养的分化培养基上出现玻璃化的烟草愈伤组织或不定芽时，在超净台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，如果玻璃化愈伤组织体积较大，应用无菌镊子分成适宜大小，并从培养基上取出，转移至灭菌的空置的干燥组培瓶内，密封瓶口。置于正常光照培养箱中1-7天，直至玻璃化组织恢复正常状态，期间若组培瓶内水分过多，可以更换组培瓶；

（2）处理后的愈伤组织及不定芽培养：将步骤（1）处理后恢复正常状态的烟草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养，5-8天后，原玻璃化烟草愈伤组织或不定芽即可正常分化或伸长；

（3）如果经过步骤（2）培养处理的去玻璃化烟草愈伤组织和不定芽在继代培养过程再次出现玻璃化迹象，重复步骤（1）和（2）。

在本发明中，所述正常光照培养箱的条件为：相对湿度60%，光照16 h/28 ℃，黑暗8 h/25℃，光强4 Lx。

所述分化培养基成分：4.4g/L MS无机盐（Sigma的MS基础培养基），30g/L蔗糖，1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，2.5 g/L 植物凝胶，余量为水，pH 5.8-5.9。

所述伸长培养基成分：4.4g/L MS无机盐（Sigma的MS基础培养基），30g/L蔗糖，0.1 μg/mL 6-BA，2.5 g/L 植物凝胶，余量为水，pH 5.8-5.9。

本发明具有如下优点和效果：采用无培养基的空瓶饥饿培养方法，无需增加任何培养成分，也不需要增加其他专用设备，操作简便，效果显著。经过空瓶饥饿处理的烟草玻璃化愈伤组织和不定芽可以有效去玻璃化恢复成正常状态，并在原本的培养基中继续分化或伸长，最终形成完整植株。本发明方法对于烟草组织培养和烟草转基因具有重要的实际意义和广泛的应用前景，可以大大提高组织培养的成苗率，因此提高工作效率。

附图说明

图1本发明的玻璃化烟草愈伤组织和不定芽的处理过程状态显示图，其中：

A：玻璃化烟草愈伤组织和不定芽，

B：玻璃化烟草愈伤组织和不定芽经过空瓶饥饿处理24 h，

C：玻璃化烟草愈伤组织和不定芽经过空瓶饥饿处理48 h，

D：空瓶饥饿处理后恢复正常状态的组织移入分化培养基中培养，

E： 原玻璃化烟草愈伤组织于分化培养基中培养20 d，

F：原玻璃化烟草愈伤组织经继代培养形成完整植株。

具体实施方式：

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

1. 无菌苗的培养：取30-50μl 体积的K326种子在1.5ml 的EP管中，用75%的酒精在含有种子的EP管外喷洒消毒后，放入超净工作台（预先紫外照射15-30min）。在EP管中加入850μl的无菌水，再加入150μl的次氯酸钠溶液（活性氯>6.0%），消毒15min，期间不停摇晃，使所有种子能够充分消毒。用1ml的无菌水冲洗5-6次，晾干，用灭过菌的牙签点接到MS培养基（组培瓶）中，暗培养两天，然后转到28℃，16h/8h光照条件下培养30 d左右。

2. 外植体的切分：取长势良好的无菌苗，切取幼嫩饱满的叶片成0.5-1cm²的正方形叶片。切叶片时，用大的平板，加入少许无菌水，以免叶片干枯；刀片要锋利，切片时，要将叶片边缘和叶脉切掉；切片时要迅速，防止撕扯、挤压，尽量避免叶片损伤。

3. 愈伤组织和不定芽的诱导：将切分的叶片移入分化培养基中，置入28 ℃，RH=60%的光照培养间中。7-10天为一个周期，更换新鲜的培养基（至少两次）。10天左右会长出植物愈伤组织，并分化出不定芽，从愈伤组织上切取不定芽，接种于伸长培养基中，待不定芽长到合适大小后移入生根培养基中。其中，分化培养基成分：4.4g/L MS无机盐（Sigma的MS基础培养基），30g/L蔗糖，1.0 mg/L 6-BA，0.1 mg/L NAA，2.5 g/L 植物凝胶，余量为水，pH 5.8-5.9；伸长培养基成分：4.4g/L MS无机盐（Sigma的MS基础培养基），30g/L蔗糖，0.1 μg/mL 6-BA，2.5 g/L 植物凝胶，余量为水，pH 5.8-5.9；生根培养基成分：4.4g/L MS无机盐（Sigma的MS基础培养基），30g/L蔗糖，0.02 mg/L NAA，2.5 g/L 植物凝胶，余量为水，pH 5.8-5.9。

4. 经过步骤3培养的外植体会形成愈伤组织，进而分化出不定芽，但其中一部分愈伤组织和不定芽是玻璃化状的，后期难以再生为正常植株。在合适的时间内，对这些玻璃化的愈伤组织和不定芽采取空瓶饥饿处理，玻璃化组织可以逆转成为正常组织，继续正常分化或伸长并形成完整植株。

5. 烟草玻璃化愈伤组织和不定芽处理：将玻璃化的烟草愈伤组织或不定芽在超净台内将玻璃化部分与正常组织分离开来，如果玻璃化愈伤组织体积较大，应用无菌镊子分开成适宜大小，并从培养基上取出，转移至空置的无菌干燥组培瓶内，密封瓶口。置于正常光照培养箱（相对湿度60%，光照16 h/28 ℃，黑暗8 h/25℃， 光强4 Lx）中1-7天，直至玻璃化组织恢复正常状态，即可结束饥饿处理。期间若组培瓶内水分过多，可以更换组培瓶。

6. 处理后的愈伤组织及不定芽培养：将5处理后恢复正常状态的烟草愈伤组织或不定芽在超净台内转移至分化培养基或伸长培养基上继代培养。一周左右会发现原玻璃化烟草愈伤组织或不定芽正常分化或伸长。如果经过步骤5培养处理的去玻璃化烟草愈伤组织和不定芽在继代培养过程再次出现玻璃化迹象，重复步骤5和6，原玻璃化愈伤组织和不定芽可以正常分化和伸长。

7. 不定芽生根：将伸长后的不定芽转入生根培养基中，待根系比较发达后，移入土中盆栽。

8. 组培苗入土盆栽：组培苗入土之前，需要将组培瓶打开盖炼苗2-3天，然后将组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗根部粘附的琼脂后，移栽入充满基质的塑料小盆内。先在弱光下培养2-3天后，置于培养间生长。

实验证明，本发明将玻璃化的烟草愈伤组织和不定芽在干燥无菌的空瓶中饥饿处理1-7天后，逆转为正常组织，并经过正常培养后可以形成完整植株。