人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，还涉及重组PCV2病毒及其应用。本发明提供一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，缺失了野生型PCV2 Rep蛋白第6‑8位的三个氨基酸SGR，和/或在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。人工改造的PCV2 Rep蛋白或者重组PCV2病毒在制备预防或治疗PCV2疫苗中的应用。明确Rep蛋白相应氨基酸位点突变对病毒复制的影响，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考，同时这为PCV2的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论基础。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，还涉及重组PCV2病毒，进一步涉及人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒的应用。

背景技术

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）为圆环病毒科，圆环病毒属成员，分为PCV1和PCV2两个血清型。PCV1不引起猪发病；PCV2被证明是导致断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原。PCV2基因组主要包括2个大的阅读框架（ORFs），ORF1基因编码病毒复制酶（Rep/Rep’），ORF2基因编码病毒核衣壳蛋白（Cap）。Cap蛋白能够诱导机体产生免疫应答，产生抗PCV2的中和性抗体，是分子诊断方法的建立及亚单位疫苗制备的理想靶抗原。自然感染PCV2可同时产生Cap与Rep/Rep’抗体。因此，对Rep/Rep’蛋白免疫特性了解及其自然感染与疫苗免疫间鉴别诊断尤为重要。

猪圆环病毒2型主要有与病毒复制相关的Rep蛋白，与免疫原性相关的Cap蛋白及ORF3编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白三种蛋白。其中Rep蛋白是PCV2复制的催化成分，对于Rep蛋白的深入研究，将有助于了解PCV2病毒的复制和致病机理。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。50％以上的蛋白质存在糖基化现象，其中Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。

青岛农业大学, 徐胜男 在2015发表文章“PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制及致病性的影响”，分析PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响，获得三个单点突变和一个未突变的双拷贝PCV2全长感染性克隆，分别命名为2M23、2M256、2M286、2PCV2，接种无污染的PK-15细胞，体外拯救突变体病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果，TCID50测定病毒的感染力，荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示，PCV2 Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力，而286～288aa突变后增强病毒的复制能力。王鹏等在2013年的中国畜牧兽医学会学术年会发表“PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变体感染性克隆的构建”, 对PCV2Rep蛋白上N-糖基化位点23aa-25aa(NPS)、256aa-258aa(NQT)和286aa-288aa(NAT)分别进行单点、双点和三点突变(将N突变为D),成功构建7个突变体感染性克隆。

上述对Rep蛋白的N-糖基化位点的研究，并没有充分挖掘完其价值，因此需要在此领域有更多进一步的研究。

发明内容

为了解决以上现有技术中对Rep蛋白的研究还不够充分的问题，本发明提供了一种人工改造的PCV2 Rep蛋白,具体而言：

第一方面,本发明提供一种人工改造的PCV2 Rep蛋白，其特征在于缺失了野生型PCV2Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR，和/或在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述野生型PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

第二方面,本发明提供一种降低PCV2体外复制能力的方法，其特征在于敲除PCV2Rep蛋白第6-8位的三个氨基酸SGR。

第三方面,本发明提供一种增强PCV2体外复制能力的方法，其特征在于在野生型PCV2 Rep蛋白第293位E和294位E之间插入了氨基酸V。

第四方面,本发明提供一种重组PCV2，其特征在于所述PCV2的Rep蛋白经过突变，缺失了第6-8位的三个氨基酸SGR，和/或在第293位E和294位E之间插入了氨基酸V；所述PCV2 Rep蛋白氨基酸的位置编号参考SEQ ID NO:1确定。

第五方面,本发明还提供所述人工改造的PCV2 Rep蛋白的编码核酸。

第六方面，本发明提供一种单拷贝突变体PCV2-vV、PCV2-dSGR感染性克隆的构建方法包括以下步骤：

（1）设计引物序列如下：

P1：5’-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3’,（SEQ ID NO:2）

P2： 5’-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’, （SEQ ID NO:3）

vV-R：5’-CTGGCCCCCTTCTACCTCCGTGGAT-3’, （SEQ ID NO:4）

vV-F： 5’-ATCCACGGAGGTAGAAGGGGGCCAG-3’, （SEQ ID NO:5）

dSGR-F： 5’-CATGCCCAGCAAGAAGAGCGG ACCCCAACCACATAAAAGG-3’, （SEQ ID NO:6）

dSGR-R：5’-TTGGGGTCCGCT CTTCTTGCTGGGCATGTTGCTGCTGA-3’, （SEQ ID NO:7）

（2）以pEASY-Blunt-PCV2为模板，分别以P1和vV-R及P1和dSGR-R引物扩增上游片段，分别以P2和vV-F及P2和dSGR-F引物扩增下游片段，分别纯化回收，

（3）以上述胶回收得到的dSGR上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得dSGR突变体全长PCR产物；以上述胶回收得到的vV上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得vV突变体全长PCR产物；dSGR突变体全长PCR产物和vV突变体全长PCR产物纯化回收后分别与克隆载体pEASY-Blunt连接，转化至感受态细胞中，分别提取质粒得pEASY-Blunt-vV和pEASY-Blunt-dSGR。

第七方面，本发明提供一种单拷贝突变体pEASY-Blunt-dSGR & vV感染性克隆的构建方法包括以下步骤：

（1）设计引物序列如下：

P1：5’-TGTCCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGTGA-3’,

P2： 5’-GCCCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’,

vV-R：5’-CTGGCCCCCTTCTACCTCCGTGGAT-3’,

vV-F： 5’-ATCCACGGAGGTAGAAGGGGGCCAG-3’,

dSGR-F： 5’-CATGCCCAGCAAGAAGAGCGG ACCCCAACCACATAAAAGG-3’,

dSGR-R：5’-TTGGGGTCCGCT CTTCTTGCTGGGCATGTTGCTGCTGA-3’,

（2）如权利要求7所述方法构建重组质粒pEASY-Blunt-vV，以pEASY-Blunt-vV质粒为模板，以P1和dSGR-F引物扩增下游片段，P2和dSGR-R引物扩增上游片段，分别纯化回收；

（3）以上述胶回收得到的上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得dSGR &vV突变体的全长PCR产物，纯化回收后与克隆载体pEASY-Blunt连接，转化至感受态细胞中，提取质粒得pEASY-Blunt-dSGR & vV。

第八方面，本发明提供一种双拷贝突变体2PCV2-vV、2PCV2-dSGR或2PCV2-dSGR &Vv感染性克隆的构建方法包括以下步骤：

（1）设计引物序列：

q1：5’-GAACCGCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAGT-3’； （SEQ ID NO:8）

q2：5’-GCACTCGAGCCGAAATTTCTGACAAACGTTA-3’；>

q3：5’-GCACCGCGGAAATTTCTGACAAACGTTACA-3’；>

q4：5’-GAAGGATCCCGGGCTGGCTGAACTTTTGAAAG-3’；>

（2）A 片段的构建：分别以权利要求3或4中得到的单拷贝突变体PCV2-vV、PCV2-dSGR和PCV2-dSGR & Vv为模板，引物q1、q2扩增全长，分别得到A-PCV2、A-vV、A-dSGR、A-dSGR&vV；

（3）B片段的构建：分别以权利要求3或4中得到的单拷贝突变体vV、dNGR和dNGR & Vv为模板，引物q3、q4扩增全长，分别得到B-PCV2、B-vV、B-dSGR、B-dSGR&vV；

（4）C载体的构建：将重组质粒PEASY-Blunt-PCV2进行XhoI、SacII限制性内切酶双酶切，跑胶回收大小约为3900bp的片段；

（5）D载体的构建：将XhoI、SacII限制性内切酶双酶切后3900bp的C载体片段与A片段以T_{4>DNA 连接酶进行连接获得D载体；}

（6）双拷贝感染性克隆的构建：用BamHI、SacII双酶切D载体，跑胶回收约5700bp大小的片段，将B片段连入该载体，并转化至Trans1-T1感受态细胞中，获得双拷贝感染性克隆2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV。

第九方面，本发明还提供所述人工改造的PCV2 Rep蛋白、所述重组PCV2病毒在制备预防或治疗PCV2疫苗中的应用。

第十方面，本发明还提供所述核酸、含有所述核酸的构建体、感染性克隆在PCV2病毒拯救中的应用。

本发明的有益效果：

1）2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR&vV突变体病毒毒价低于未突变体病毒 2PCV2及PCV1；2PCV2-vV突变体病毒毒价要高于未突变病毒 2PCV2 及PCV1的毒价，说明PCV2 Rep 蛋白的6-8aa（SGR）位点缺失后降低病毒的体外复制能力而 284aa（V）位点增加后能增强病毒的体外复制能力，开辟了Rep蛋白研究的一个新方向；

2）本项目组在前期进行 PCV2 分离培养过程中经常遇到 PCV2 在 PK-15 细胞培养中污染 PCV1，且发现污染后连续传代 3-5 代PCV1 就会成为优势毒株，影响 PCV2 的复制（JLi et al. Vet Rec.2013）。这一现象在规模化生产中也普遍存在，对目前 PCV2 灭活疫苗的免疫效果造成了一定影响。本研究拟在前期实验室构建好的单拷贝PCV2感染性克隆的基础上，获得三个相应氨基酸突变的双拷贝全长感染性克隆。在体外拯救突变病毒的基础上，进行接种PK-15细胞，研究突变病毒的复制性, 明确Rep蛋白相应氨基酸位点突变对病毒复制的影响，为进一步阐明PCV2的复制及致病机制提供参考，同时这为 PCV2 的致病机理研究及疫苗免疫效果评价等奠定了理论基础。

附图说明

图1为突变体vV上下游片段的扩增图，泳道1：突变体vV的下游扩增产物； 泳道2：突变体vV的上游扩增产物； M：DL-2000 DNA Marker

图2为突变体dSGR上下游片段的扩增图，泳道1：突变体dSGR的下游扩增产物； 泳道2：突变体dSGR的上游扩增产物； M：DL-2000 DNA Marker

图3为vV、dSGR和dSGR & vV突变体全长基因的PCR扩增图, M：DL-5000 DNA Marker 泳道1：突变体dSGR的全长扩增产物；泳道2：突变体dSGR&vV的全长扩增产物；泳道3：突变体vV的全长扩增产物

图4为D 载体及双拷贝感染性克隆双酶切鉴定结果;

图5为突变体感染性克隆的序列分析;

图6为PCV2和突变体病毒PCR鉴定结果, 泳道1-6：2PCV2; 2PCV2-vV; 2PCV2-dSGR ;2PCV2-dSGR& vV; 阴性对照；阳性对照;

图7为PCV1 PCR鉴定结果, 泳道1-3：PCV1; 阳性对照；阴性对照;

图8为拯救病毒 IFA 的检测结果, (a) 2PCV2. (b) 2PCV2-vV. (c) PCV1. (d)2PCV2-dSGR. (e) 2PCV2-dSGR&vV. (f) Empty vector;

图9为Western blotting鉴定PK-15细胞中Rep蛋白的表达, 1: 2PCV2-vV; 2:PCV1;3: 2PCV2-dSGR; 4: 2PCV2;5：2PCV2-dSGR&vV;

图10为亲本病毒与拯救病毒的生长曲线;

图11为细胞中病毒的定量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1：PCV2 Rep蛋白突变体感染性克隆的构建

1.1 菌株

pEASY-Blunt-PCV2菌株由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室制备保存。

1.2 试验试剂

pEASY-Blunt Cloning Kit、Trans1-T1、TransStart^TM>

1.3 单拷贝突变体感染性克隆的构建

1.3.1 重叠PCR引物设计及合成

根据实验室前期获得并测序成功的PCV2的基因序列全长(GenBank number:DQ478947)，利用Primer 5.0软件辅助分别设计能够特异性扩增相应突变体的引物及扩增PCV2全长的引物。经BLAST分析验证引物序列的特异性后送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下表1-1所示：

表1 扩增PCV2突变体及全长的引物

1.3.2 单拷贝突变体PCV2-vV、PCV2-dSGR感染性克隆的构建

1.3.2.1 重叠PCR扩增突变体vV、dSGR的上下游片段

以pEASY-Blunt-PCV2质粒为模板，分别以P1和vV-R及P1和dNGR-R引物扩增vV及dNGR突变体的上游片段，大小分别为454bp和1354bp，P2和vV-F及P2和dSGR-F引物扩增vV及dSGR突变体的下游片段，大小分别为1349bp和440bp。

1.3.2.2 突变体vV、dSGR上下游片段的纯化回收

1) 将扩增得到的单一目的条带从核酸凝胶中切下，放入1.5mL EP管中，称量切取的凝胶重量。

2) 向EP管中加入等体积的溶胶buffer(按照1mg：1μL的比例换算得体积)。50℃水浴溶解10min，期间晃动EP管，使凝胶溶解充分。

3) 将溶解得到的溶液移入到吸附柱内，12000rpm/min，离心1min。重新将收集管的液体加到吸附柱内，二次离心，12000rpm/min，离心1min。

4) 向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm/min，离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新置于收集管内。

5)重复步骤(4)。12000rpm/min，空离2min，彻底除去漂洗液。吸附柱置于室温5min。彻底晾干，防止残余漂洗液影响后续试验。

6)晾干的吸附柱置于新的1.5mL EP管中，向吸附柱内悬空滴加30μL 70℃预热的ddH₂O，12000rpm/min，离心2min收集目的DNA溶液。将目的DNA溶液置于-20℃保存。

1.3.2.3 普通PCR扩增突变体vV、dSGR全长基因

分别以上述胶回收得到的上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物分别扩增获得vV及dSGR突变体的全长PCR产物，分别为1770nt、1758nt。重复1.3.2.2操作步骤，获得vV及dSGR全长基因的纯化产物。

用TransStart^TM>

1.3.2.4 构建突变体vV、dSGR的单拷贝感染性克隆

1) vV、dSGR全长基因与克隆载体pEASY-Blunt连接，连接体系为10μL：pEASY-BluntCloning Vector 1μL，目的基因4μL，Total 5μL。

将以上连接体系加入无菌PCR小管中，充分混匀，瞬时离心后置于连接仪中，28℃连接20min，连接产物置于4℃保存。

2) 连接产物的转化

连接后的产物转化到Trans1-T1感受态细胞中，操作如下：

-80℃冰箱取出感受态细胞Trans1-T1置于冰上缓慢融化。

取预冷的无菌EP管，加入50μL感受态细胞，然后加入5μL连接产物，温和的混匀，冰浴30min。

快速置于42℃水浴中60s，再快速将EP管转移至冰上，冰浴2min。

EP管中加入800μL室温不含抗生素的LB液体培养基，37℃ 200rpm摇床培养1h。

5000rpm/min，离心2min ，弃去适量的上清液，然后混匀沉淀。将菌液涂在带有Amp抗性的LB固体培养基平板上，37℃培养箱中过夜培养。

次日观察菌落生长情况，挑取大小适宜、形状规则的单个菌落进行培养。

3) 质粒的提取与鉴定

在培养良好的LB平板上随机挑取5个单菌落，分别放入含有5mL带有Amp抗性的LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇床上振荡培养12-16h，提取质粒：

将培养好的菌液移入5mLEP管中，12000rpm/min，离心1min，弃去上清液。

加入250μL Buffer P1(含有RNase A，4℃保存)，吹打悬浮沉淀，移至1.5mL EP管中。

加入250μL Buffer P2裂解液，温和的颠倒6-8次使菌液充分裂解。

加入350μL Buffer P3，温和的颠倒6-10次，充分混匀，使蛋白沉淀。12000rpm/min，离心10min，充分沉淀。

将离心后的上清液约900μL移至经平衡液Buffer BL处理过的吸附柱中，12000rpm/min，离心1min。重新将收集管的液体加到吸附柱内，二次离心，12000rpm/min，离心1min。

向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm/min，离心1min，倒掉废液，将吸附柱重新置于收集管内。

重复上一步骤。12000rpm/min空离2min，彻底除去漂洗液。吸附柱置于室温5min。使乙醇彻底挥发，以免影响后续试验。

晾干的吸附柱置于新的1.5mL EP管中，向吸附膜中间悬空滴加70μL 70℃预热的ddH₂O，12000rpm/min，离心2min，所提取的质粒即存在于管底离心液中。紫外分光光度计测定提取质粒的浓度，置于-20℃保存。

4) 限制性内切酶双酶切鉴定

酶切体系如下：

质粒1 µL，10×FastDigest Buffer 2 µL，SacII 0.5 µL，XhoI 0.5 µL，ddH₂O>

混匀后，37℃水浴酶切3h，1%琼脂糖凝胶电泳检测。出现与载体和目的条带一致的两个条带即为阳性质粒。分别命名为pEASY-Blunt-vV和pEASY-Blunt-dSGR，并送至华大基因有限公司测序分析，将测序结果与pEASY-Blunt-PCV2进行比对分析，确认目的片段无误。

1.3.3 单拷贝突变体PCV2-dSGR & vV感染性克隆的构建

1.3.3.1 重叠PCR扩增突变体dNGR & vV的目的片段

以pEASY-Blunt-vV质粒为模板，分别以P1和dSGR-F引物扩增dSGR & vV突变体的下游片段，P2和dSGR-R引物扩增dSGR & vV突变体的上游片段。

用TransStart^TM>

1.3.3.2 突变体dSGR & vV目的片段的纯化回收

操作步骤同1.3.2.2。

1.3.3.3 普通PCR扩增突变体dSGR & vV全长基因

分别以上述胶回收得到的上、下游目的DNA产物为模板，以P1和P2引物扩增获得dSGR &vV突变体的全长PCR产物，为1761nt。重复1.3.2.2操作步骤，获得dSGR & vV全长基因的纯化产物。

1.3.3.4 构建突变体dSGR & vV的单拷贝感染性克隆

操作步骤同1.3.2.4。

1.4 双拷贝突变体2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV感染性克隆的构建

1.4.1 引物设计

根据实验室前期获得并测序成功的PCV2的基因序列全长(GenBank number:DQ478947)，利用Primer 5.0软件辅助设计能够特异性扩增PCV2全长并带有酶切位点的引物。经BLAST分析验证引物序列的特异性后送至上海生工生物工程技术服务有限公司合成，引物序列如下表1-2所示：

表2 用于扩增带酶切位点突变体基因全长的引物

1.4.2 A 片段的构建

分别以pEASY-Blunt-PCV2及单拷贝突变体PCV2-vV、PCV2-dSGR和PCV2-dSGR & vV为模板，引物q1、q2扩增全长。使用50μL体系：引物(10μM)各2μL；dNTP (2.5μM) 2μL；TransStart^TM>TM>

1.4.2.1 双酶切体系(50μL)

SacII 1μL，XhoI 1μL，1×cutsmart buffer 10μL，DNA1μg，ddH₂O补齐50μL。

1.4.2.2 酶切产物回收

操作步骤同1.3.2.2

1.4.3 B片段的构建

分别以pEASY-Blunt-PCV2及单拷贝突变体vV、dNGR和dNGR & vV为模板，引物q3、q4扩增全长。使用50μL体系：引物(10μM)各2μL；dNTP (2.5μM) 2μL；TransStart^TM>TM>

1.4.4 C载体的构建

将重组质粒PEASY-Blunt-PCV2进行XhoI、SacII限制性内切酶双酶切，跑胶回收大小约为3900bp的片段，操作步骤同上。标记为CPCV2。

1.4.5 D 载体的构建

1.4.5.1 A、C 片段的连接

将实验室构建好的XhoI、SacII双酶切后的3900bp的PEASY-Blunt载体与片段A以T_{4>DNA 连接酶进行连接，连接总体系(10μL），16℃连接过夜。命名为D载体。}

1.4.5.2 连接产物的转化

操作步骤同1.3.2.4中步骤2)。

1.4.5.3 重组质粒的提取与双酶切鉴定

操作步骤同1.3.2.4中步骤3)和4)。

1.4.6 双拷贝感染性克隆

1.4.6.1双拷贝感染性克隆的构建

用BamHI、SacII双酶切D载体，跑胶回收约5700bp大小的片段，将B片段连入该载体，并转化至Trans1-T1感受态细胞中。分别命名为2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV。

1.4.6.2 双拷贝感染性克隆的鉴定

用SacII和BamHI双酶切初步鉴定的阳性双拷贝感染性克隆质粒送上海生物工程技术服务有限公司进行序列测定，测定结果利用DNAStar软件进行比对分析。

将D载体用BamHI、SacII进行双酶切产生1个条带，大小为5700bp（PEASY-Blunt和A片段组成）。2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV经BamHI、SacII双酶切后得到2个条带，大小分别与D载体（5700bp）和B片段（约1767bp）相符（见图4）。

实施例2:PCV2 Rep蛋白突变体病毒体外拯救及鉴定

2.1 细胞和抗体

无猪圆环病毒污染的PK-15细胞、PCV2/Rep单克隆抗体均由山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室制备保存。

2.2 主要试剂与仪器

新生胎牛血清购自贵州百灵生物制品有限公司；LipofectamineTM3000、胰酶、DMEM细胞培养基购自上海英潍捷基（上海）贸易有限公司；D-氨基葡萄糖、FITC标记的羊抗鼠的二抗均购自美国Sigma-Aldrich公司。PTC-2000 型 PCR 仪购自美国 MJResearch 公司；冷冻离心机、移液枪购自德国 Eppendorf 公司；CO2培养箱购自美国 Thermo 公司 ；生物安全柜购自苏净集团安泰公司；凝胶成像仪购自Alpha Innotech 公司；D-37520 型高速冷冻离心机 Kendo Laboratory Products 公司； IX71-A21PH 型倒置显微镜购自日本 OLMPUS公司；PMSF、细胞裂解液、Western一抗稀释液购自碧云天公司；Supersignal West PicoTrial Kit化学发光试剂盒购自Pierce 公司；HRP标记的羊抗鼠抗体购自武汉博士德公司；β-actin抗体购自Santa Cruz公司。

2.3 引物设计

根据 GenBank 上已发表的 PCV2 基因序列，利用 Premier 5.0 软件设计合成能鉴别PCV的引物 L1、L2和L3。

L1：5’-TTACCGGCGCACTTCGGCAG-3’

L2：5’-ACTCCGTTGTCCCTGAGAT-3’

L3：5’-TTCCAAACCTTCCTCTCCGC-3’

2.4 主要溶液的配制

2.4.1 10% 和2% DMEM 营养液

于 DMEM 溶液中各自加入 10% 和 2% 的胎牛血清，混匀后于 4℃保存备用。

2.4.2 D-氨基葡萄糖（300mM）

将 10g D-氨基葡萄糖盐酸盐溶解于 150mL 厄尔平衡盐溶液（EBBS）中，贮存于 4℃。

2.4.3 PBS(0.01M、pH7.4)

称取 8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4 和 0.24g KH2PO4，溶于800mL蒸馏水中，用HCl 调节溶液的 pH 值至7.4，最后加超纯水定容至1L 即可。高压蒸气灭菌（至20min），保存于室温或 4℃冰箱中。

2.5 双拷贝突变体病毒的拯救

2.5.1 细胞的准备

2.5.1.1 细胞复苏

1）从液氮中取出一个装有PK-15细胞的冻存管，于42℃水浴中化冻；

2）将已融化的冻存管放入离心机中，1500 rpm/min离心3min；

3）拿离心好的冻存管放入提前准备好的细胞间超净台中，用10% DMEM培养液沿管壁轻轻冲洗两遍，以除去DMSO；

4）用10% DMEM细胞培养液吹打细胞沉淀并使其悬浮，并将其转移到一个新的细胞培养瓶里；

5）细胞瓶中加入6mL含有10%胎牛血清的DMEM细胞培养液；

6) 置CO2培养箱中，37℃培养。

2.5.1.2 转染细胞的准备

1）待细胞在细胞瓶中铺满细胞瓶底后，弃去细胞培养液；

2）加入含0.25%-EDTA的胰酶1mL,在显微镜下观察细胞回缩并呈圆形，去掉胰酶；

3）加入含胎牛血清10%的DMEM细胞培养液6mL，将细胞吹打成单个细胞；

4）将细胞培养液转移至6孔细胞培养板中，6孔板每孔加入2mL，其密度为0.25×10⁶~1×10⁶；

5）置CO₂培养箱中，37℃培养。

2.5.2 转染

使用LipofectamineTM3000脂质体转染试剂盒（Invitrogen公司），以24孔板为例。

1）在转染前一天，将合适的细胞密度接种于细胞板中，在细胞密度达到70-90%汇合度时进行转染；

2）转染时A溶液：用125µL Opti-MEM稀释7.5µL的Lipofectamine®3000试剂质粒，轻轻混匀；B溶液：将所需的Lipofectamine TM 3000脂质体按DNA：Lipofectamine TM 3000为1:3的比例，用125µL Opti-MEM稀释，加入5µL的P3000™试剂；

3）将溶液A和溶液B混合轻轻混匀，室温孵育5min；

4）将混合液和等体积的细胞培养液混合后加入到每一个培养空中，置CO2培养箱中，37℃培养6-8h后，更换新的细胞培养液，培养48h，按常规方式进行传代培养。

2.5.3 病毒 DNA 的提取

1）取第五代的细胞毒，反复冻融 3 次后，取出 500µL 于 1.5mL 离心管中，分别加入50µL 10%SDS溶液和10µL（50μg/mL）的蛋白酶K，于56℃恒温水浴锅中消化1.5h-2h；

2）加入 200 µL Tris 饱和酚，充分混匀，12000 rpm/min 离心 15 min；

3）吸取上清（约 500µL）于一新离心管中，加入 Tris 饱和酚和氯仿各 200µL，充分混匀后，12000 rpm/min 离心 15 min；

4）吸取上清（约 300~400µL）于一新离心管中，加入 200µL 氯仿，充分混匀，12000rpm/min 离心 15 min；

5）吸取上清（约 300µL）于一新离心管中，加入其两倍体积的预冷无水乙醇，于-20℃静置沉淀 20min，12000 rpm/min 离心 15 min，弃上清；

6）加入 1mL 提前预冷的 70%乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，室温晾干；

7）加入 20µL 灭菌超纯水溶解沉淀，-20℃保存备用。

将重组质粒2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV及2PCV2、PCV1盲传5代后的拯救病毒DNA进行测序鉴定。结果显示：双拷贝全基因组按照预先设计的成功顺式串联入载体；序列比对结果显示，盲传5代后的病毒DNA除之前设计的PCV2的ORF1 6aa、7aa、8aa位点(SGR) 被去除，294aa添加（V）之外其它均与PCV2 SD1全基因组序列完全相同，没有出现其他任何变异（见图5）。

2.5.4 普通 PCR 鉴别

体系如下（25µL）：10×PCR Buffer 2.5µL，Mg ²⁺>

按以下条件进行 PCR 反应：95℃预变性 8min，35 个循环（94℃变性 1min，55℃退火 40s，72℃延伸40s），72℃延伸 10min。产物保存于 4℃，反应完毕后取出 5µL 产物于1%琼脂糖凝胶电泳检查结果。

取5µL产物经1% 琼脂糖凝胶电泳检测，可见PCV2和突变体病毒大小约为404bp的目的条带（见图6）和PCV1大小198bp的目的条带（见图7），与预期结果一致。

2.5.5 间接免疫荧光检测

1）将转染细胞盲传至第五代的细胞接种于24孔板，12h后用300 mM D-氨基葡萄糖处理30 min，洗涤后加入含2%胎牛血清的DMEM培养液继续培养48h，弃掉细胞上清液，用等体积预冷的PBS反复冲洗3次，弃掉；

2）每孔加入500µL左右4%多聚甲醛在室温固定45min-1h，PBS洗3次，；

3）每孔加入0.1%-0.2% Triton×100通透细胞10-15min，协助染色，用PBS洗3次；

4）用PCV2/Rep单克隆抗体作为一抗，1:200稀释，每孔加入200µL，室温避光作用1h;

5）PBS洗5次，再加入FITC标记的羊抗鼠荧光二抗，1:800稀释，室温避光作用1h；

6）PBS洗5次，封片在荧光显微镜下观察结果。

将盲传 5 代的转染重组质粒2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV及2PCV2、PCV1及空载体48h 以后进行 IFA 检测。如图所示，所有拯救病毒都能检测到特异性荧光信号，其中2PCV2、2PCV2-vV和PCV1 (见图8中a、b、c)的荧光强度和荧光数量明显高于2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV（见图8中d、e）而转染空载体的 PK-15 细胞则没有特异性荧光染色（见图8中f）。检测结果表明，PCV2 Rep蛋白相关位点突变后病毒均能在 PK-15 细胞内表达，但突变体dSGR、dSGR & vV表达量明显低于亲本病毒；vV突变体表达量高于亲本病毒。

2.6 Western blotting 检测PCV Rep蛋白在PK-15细胞中的表达

2.6.1 样品的处理

1）分别将对照PK-15细胞和接毒的PK-15细胞于37℃、CO2培养箱中培养60h。

2）60h后取出培养板，移液枪弃去营养液，没孔加入1mL预冷的PBS，平放轻轻晃动细胞板洗涤细胞，弃去PBS，重复2次，弃去PBS后，6孔板置于冰上开始裂解处理。

3）按1 mL裂解液加10 µL PMSF（100 mM）的比例配制裂解液，摇匀置冰上。

4）6孔板每个孔需加120 µL含PMSF的裂解液，冰上裂解30 min，经常晃动6孔板，保证裂解充分。

5）待细胞裂解完成后，用细胞刮迅速将细胞刮于孔的一侧，用移液枪将细胞碎片裂解液移至冰上预冷的1.5 mL EP管中。

6）混合液4 ℃ 12000 rpm离心5 min。

7）将上清液移至另一个无菌的EP管中，加入SDS-PAGE上样缓冲液吹打混匀后100℃煮沸10分钟。-80 ℃保存备用。

2.6.2 SDS-PAGE电泳

（1）配胶：参照蛋白电泳仪说明书，安装好玻璃板，确保不漏水。按下列比例配制10 mL12%的分离胶：

体系混合均匀后，尽快将混合溶液注入玻璃板之间。后加满ddH₂O封闭，使分离胶水平。30>

最后加入TEMED之前，先弃去分离胶上的ddH₂O，并用滤纸条吸干残留水分，后加入2>

（2）上样：待凝胶彻底凝固后，小心垂直拔去梳子，装入电泳仪。往电泳槽内加入l×蛋白电泳缓冲液，将一定量的蛋白样品和预染Marker按设计的顺序加入胶孔，并记录。

（3）电泳：90 V电压开始蛋白电泳，待溴酚蓝带进入分离胶后将电压调至120 V，当溴酚蓝带到达分离胶的最底端刻度时，关闭电源，停止电泳。

2.6.3 Western blotting

（1）转印 按照待转印的凝胶的大小，剪取1张PVDF膜和两张厚滤纸，剪去PVDF膜上一个角，来标注正反面和样品顺序，PVDF膜需事先用甲醇浸泡10 s， PVDF膜和滤纸需在 l×蛋白电转印缓冲液中充分浸泡。按从下往上依次是厚滤纸、PVDF膜、凝胶、厚滤纸的顺序叠放整齐，操作中应注意用玻璃棒清除PVDF膜或滤纸与凝胶之间的气泡，将上述 “凝胶三明治”平放入半干式电转印槽内，注意电极顺序，PVDF膜靠近阳极端，蛋白凝胶胶靠近阴极端。接通电源，15 V电转印15-30 min。

（2）封闭：转印结束后，用含5％脱脂乳的TBST封闭PVDF膜，置摇床上4 ℃封闭过夜。

（3）用TBST洗涤PVDF膜，5次，5 min /次。

（4）一抗孵育：弃净TBST后，用碧云天的Western及IP一抗稀释液稀释PCV2/Rep抗体和β-actin抗体，稀释比例分别为1:800和1：2000，加入PVDF膜，置摇床上室温轻摇2 h或者4 ℃孵育过夜。

（5）用TBST洗涤PVDF膜，5次，5 min /次。

（6）二抗孵育：用含5％脱脂乳的TBST稀释HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，比例为1：8000，摇床上室温轻摇1 h。

（7）用TBST洗涤PVDF膜，5次，5 min /次。

（8）用ECL超敏化学发光显色试剂盒进行显色，在ChemiDoc MP全能型凝胶成像系统上曝光观察。

将PK-15细胞接种于6孔板中，按照1:5的比例将第5代病毒加入到细胞液中， 12小时后，用300 mM D-氨基葡萄糖处理30min，继续培养48h后按照1.6.1的方法裂解细胞进行Western blotting检测。结果如图9，Rep蛋白分子量大小约37 kDa，对照组PK-15细胞中无Rep蛋白的表达，本研究中的拯救病毒在PK-15细胞中成功表达。

实施例3 :PCV2 Rep蛋白突变体病毒感染 PK-15 细胞复制能力的测定

3.1 细胞

无猪圆环污染的 PK-15 细胞由畜禽疫病防治与繁育重点实验室保存和提供。

3.2 主要试剂与仪器

SYBR Premix Ex Taq TM 试剂购自大连宝生物工程有限公司；LipofectamineTM3000、胰酶、DMEM 细胞培养基购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；普通质粒小提试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细胞瓶、96 孔细胞培养板购自康宁公司；新生胎牛血清购自贵州百灵生物制品有限公司；PCV2/Rep 单克隆抗体由山东省畜禽疫病防治及繁育重点实验室制备保存；D-氨基葡萄糖、FITC 标记的羊抗鼠的二抗均购自美国Sigma-Aldrich 公司。超微量分光光度计为美国生产的 NanoDrop-2000 型产品； Roche480II 荧光定量PCR 仪购自德国罗氏公司；生物安全柜购自苏净集团安泰公司；MDF-04086S 型冰箱购自 SANYO公司；移液枪购自 Eppendorf 公司；IX71-A21PH 型倒置显微镜购自日本OLMPUS 公司；Thermo Class100 Steri-Cylce CO₂；LightCycle®480>

3.3 拯救病毒第5代 TCID 50 测定生长曲线

1)将成功复苏的PK-15细胞，用0.25%-EDTA胰酶常规消化后，分别加入96孔板，每孔100μL，取拯救病毒2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV和2PCV2、PCV1第5代的细胞培养物分别以10^-1~10^-8的稀释度接种到96孔细胞板，放置37℃，5%>

2)12h后，每孔加10µL 300mM D-氨基葡萄糖处理15min，后用2% DMEM培养液洗一遍，洗完后每孔加2% DMEM培养液200µL，继续培养；

3)分别在处理后12h、24h、36h、48h、60h后，将维持液弃去，PBS 100µL每孔清洗3次，洗涤过后加4%多聚甲醛在室温固定45min-1h；

4）吸除固定液，PBS洗3次，用PCV2/Rep单克隆抗体作为一抗，1:200稀释，每孔加入100µL，室温避光作用1h；

5）PBS洗3次，再加入FITC标记的羊抗鼠荧光二抗，1:800稀释，室温避光作用1h

6）PBS洗3次后显微镜下观察；

7）按照Reed-Muench法计算其TCID 50。

对上述拯救的病毒以毒价基本稳定的第五代按照1:5 的比例感染 PK-15 细胞进行传代培养，结果表明，2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV突变体病毒毒价低于未突变体病毒2PCV2及PCV1；2PCV2-vV突变体病毒毒价要高于未突变病毒 2PCV2 及PCV1的毒价。并且各病毒的生长曲线一致，均在处理后48h，即病毒生长60h时病毒量达到最大。（见图10）。

3.4 荧光定量PCR检测细胞的病毒载量

3.4.1 SYBR Green I 荧光定量PCR的准备

3.4.1.1 引物设计

根据 GenBank 已发表的序列，利用 Premier 5.0 软件设计、合成引物 L1 、 L2和L3，扩增 PCV2 长度是404bp，PCV1长度是198bp。

L1：5’-TTACCGGCGCACTTCGGCAG-3’

L2：5’-ACTCCGTTGTCCCTGAGAT-3’

L3：5’-TTCCAAACCTTCCTCTCCGC-3’

3.4.1.2 病毒 DNA 的提取

1）将盲传至第五代的细胞毒2PCV2-vV、2PCV2-dSGR和2PCV2-dSGR & vV和2PCV2、PCV1反复冻融 3 次后，取出500µL于1.5mL离心管中，其他操作步骤同试验二的1.5.3，将得到的DNA放于-20℃

保存备用。

3.4.1.3 SYBR Green I 荧光定量 PCR 的反应

用实验室之前建好的以 ORF2 为靶基因的 SYBR-Green 实时荧光定量 PCR 方法进行定量检测，研究细胞中病毒核酸的变化规律。反应体系为 25µL：2×SYBR Premix ExTaqTM12.5µL、引物各 1µL、模板 2µL、去离子水 8.5µL。荧光定量 PCR 反应条件为：95℃ 5min，95℃ 20s，55℃ 20s，70℃ 30s 且收集荧光信号，40 个循环。

用 SYBR-Green 实时荧光定量 PCR 方法对突变病毒和亲本病毒的3-5^th进行细胞中病毒载量的定量检测，突变体病毒及亲本病毒各代次之间相比差异显著（P﹤0.05）。检测结果表明，2PCV2-vV、2PCV2-dSGR>

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序 列 表

<110> 山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 人工改造的PCV2 Rep蛋白、重组PCV2病毒及其应用

<130> 无

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 314

<212> PRT

<213> PCV2

<400> 1

Met Pro Ser Lys Lys Ser Gly Arg Ser Gly Pro Gln Pro His Lys Arg

1 5 1015

Trp Val Phe Thr Leu Asn Asn Pro Ser Glu Asp Glu Arg Lys Lys Ile

202530

Arg Glu Leu Pro Ile Ser Leu Phe Asp Tyr Phe Ile Val Gly Glu Glu

354045

Gly Asn Glu Glu Gly Arg Thr Pro His Leu Gln Gly Phe Ala Asn Phe

505560

Val Lys Lys Gln Thr Phe Asn Lys Val Lys Trp Tyr Phe Gly Ala Arg

65707580

Cys His Ile Glu Lys Ala Lys Gly Thr Asp Gln Gln Asn Lys Glu Tyr

859095

Cys Ser Lys Glu Gly Asn Leu Leu Ile Glu Cys Gly Ala Pro Arg Ser

100 105 110

Gln Gly Gln Arg Ser Asp Leu Ser Thr Ala Val Ser Thr Leu Leu Glu

115 120 125

Ser Gly Ser Leu Val Thr Val Ala Glu Gln His Pro Val Thr Phe Val

130 135 140

Arg Asn Phe Arg Gly Leu Ala Glu Leu Leu Lys Val Ser Gly Lys Met

145 150 155 160

Gln Lys Arg Asp Trp Lys Thr Asn Val His Val Ile Val Gly Pro Pro

165 170 175

Gly Cys Gly Lys Ser Lys Trp Ala Ala Asn Phe Ala Asp Pro Glu Thr

180 185 190

Thr Tyr Trp Lys Pro Pro Arg Asn Lys Trp Trp Asp Gly Tyr His Gly

195 200 205

Glu Glu Val Val Val Ile Asp Asp Phe Tyr Gly Trp Leu Pro Trp Asp

210 215 220

Asp Leu Leu Arg Leu Cys Asp Arg Tyr Pro Leu Thr Val Glu Thr Lys

225 230 235 240

Gly Gly Thr Val Pro Phe Leu Ala Arg Ser Ile Leu Ile Thr Ser Asn

245 250 255

Gln Thr Pro Leu Glu Trp Tyr Ser Ser Thr Ala Val Pro Ala Val Glu

260 265 270

Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Leu Val Phe Trp Lys Asn Ala Thr

275 280 285

Glu Gln Ser Thr Glu Glu Gly Gly Gln Phe Val Thr Leu Ser Pro Pro

290 295 300

Cys Pro Glu Phe Pro Tyr Glu Ile Asn Tyr

305 310

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tgtccgcggg ctggctgaac ttttgaaagt ga 32

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcccgcggaa atttctgaca aacgttaca 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctggccccct tctacctccg tggat 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atccacggag gtagaagggg gccag 25

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

catgcccagc aagaagagcg gaccccaacc acataaaagg 40

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttggggtccg ctcttcttgc tgggcatgtt gctgctga 38

<210> 8

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gaaccgcggg ctggctgaac ttttgaaagt 30

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gcactcgagc cgaaatttct gacaaacgtt a 31

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaccgcgga aatttctgac aaacgttaca 30

<210> 11

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gaaggatccc gggctggctg aacttttgaa ag 32