法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-08-20
授权
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2017-11-17
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N27/327 申请日:20170803
实质审查的生效
2017-10-20
公开
公开
技术领域
本发明属于免疫分析和生物传感技术领域,提供了一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法及应用。
背景技术
目前宫颈癌已经成为危害女性健康的重要因素。宫颈癌肿瘤标志物的灵敏检测,在临床上对于肿瘤的早期发现,肿瘤高危人群的筛选、良性和恶性肿瘤的鉴别诊断、肿瘤发展程度的判断,肿瘤的治疗效果的观察和评价及肿瘤复发和预后的预测产生极大的影响,引起人们的广泛关注。
目前电化学免疫传感器已经广泛用于宫颈癌及各种肿瘤标志物的检测,一般可分为有标记和无标记两种,其中无标记型电化学免疫传感器结合了高特异性的免疫分析技术和高灵敏的电化学分析技术,具有灵敏度高、制备简单、检测快速、成本低等优点,在临床检验、环境监测、食品安全控制、生物监测等领域都有重要的应用价值。
本发明成功构建了一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的无标记型免疫传感器,Rh@Pd双金属为纳米枝晶状,具有良好的水溶性和催化性能,具有更多的结合位点,能有效吸附并固载抗体。磺酸功能化的多壁碳纳米管具有优异的导电性,大的比表面积,良好的稳定性和生物相容性。二者通过物理静电吸附作用相互结合,由于二者的协同作用有助于提高材料的电化学性质,能够更好的对测定信号实现放大,提高肿瘤标志物检测的灵敏度。
发明内容
本发明提供了一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法及应用,实现了对宫颈癌标志物的灵敏检测。
本发明的目的之一是提供一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法。
本发明的目的之二是将所制备的基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器应用于宫颈癌癌标志物的高灵敏、特异性检测。
本发明的技术方案,包括以下步骤。
1. 一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为3 ~ 5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6 µL、1.0 ~ 3.0 mg/mL的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、8 ~ 10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4>
(4)继续将4 µL、0.8 ~ 1.2 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(5)滴加6 µL、25 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干,制得一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器。
2.所述Rh@Pd纳米枝晶的制备,步骤如下:
取2 mL、10 ~ 20 mmol/L的Na2PdCl4与0.5>3·3H2O混合,置于50>
3.所述磺化碳纳米管的制备,步骤如下:
称取2 ~3 g多壁碳纳米管,在60 °C下真空炉中干燥24 h;称取1 ~1.5 g烘干后的多壁碳纳米管置于圆底烧瓶中,依次缓慢加入10 mL浓硫酸,30 mL浓硝酸,超声10 min至溶液分散均匀,于120 °C油浴中,搅拌回流10 ~ 30 min,自然冷却至室温,用超纯水洗涤至中性,60 °C下烘干10 ~ 15 h,制得磺化碳纳米管;
4.所述负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液的制备,步骤如下:
称取10 mg上述制备的磺化碳纳米管,分散在10 ~ 20 mL、1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液中,室温下连续搅拌15 h,离心分离,35 °C下真空干燥箱中烘干,制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管;
称取5 ~15mg的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管超声分散至5mLpH7.2的PBS缓冲溶液中制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液;
所述1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液是将10 mg Rh@Pd纳米枝晶分散至10mL超纯水中制得。
5.肿瘤标志物的检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL,含10 mmol/L的铁氰化钾的pH=5.8 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用差分脉冲伏安法对分析物进行检测,初始电位为0 V,终止电位为0.5 V,脉冲振幅为50 mV,脉冲宽度为50 ms,脉冲周期为50 ms,记录电流变化;
(3)记录不同浓度下的肿瘤标志物抗原所对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,得到待测样品中肿瘤标志物抗原的浓度。
上述肿瘤标志物选自下列之一:CEA、CA125、SCCA。
本发明所用原材料均可在化学试剂公司或生物制药公司购买。
本发明的有益成果
(1)采用负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管作为基底材料。Rh@Pd双金属为纳米枝晶状,具有良好的水溶性和催化性能,纳米枝晶状的形貌,使其具有更多的结合位点,能有效吸附并固载抗体。磺酸功能化的多壁碳纳米管具有优异的导电性,大的比表面积,良好的稳定性和生物相容性。二者通过物理静电吸附作用相互结合,由于二者的协同作用有助于提高材料的电化学性质,实现了放大电化学信号的作用,从而提高了传感器的灵敏度,降低了检测限。
(2)一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器对肿瘤标志物的检测,对CEA检测的线性范围25 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为8.3 fg/mL;对CA125其检测的线性范围100 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为33.3 fg/mL;对SCCA检测的线性范围25 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为8.3 fg/mL;表明一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器可以达到准确测定的目的。
具体实施方式
现将本发明通过具体实施方式进一步说明,但不限于此。
实施例1一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为3 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6 µL、1.0 mg/mL的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、8 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4>
(4)继续将4 µL、0.8 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(5)滴加6 µL、25 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干,制得一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器。
实施例2一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为4 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6 µL、2.0 mg/mL的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、9 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4>
(4)继续将4 µL、1.0 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(5)滴加6 µL、25 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干,制得一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器。
实施例3一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器的制备方法,步骤如下:
(1)将直径为5 mm的玻碳电极用Al2O3抛光粉打磨,超纯水清洗干净;
(2)取6 µL、3.0 mg/mL的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液滴涂到电极表面,室温下晾干,超纯水冲洗电极表面,晾干;
(3)继续将6 µL、10 µg/mL的肿瘤标志物捕获抗体Ab1滴加到电极表面,超纯水冲洗,4°C冰箱中干燥;
(4)继续将4 µL、1.2 mg/mL的牛血清白蛋白BSA溶液滴加到电极表面,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干;
(5)滴加6 µL、25 fg/mL ~ 100 ng/mL的一系列不同浓度的肿瘤标志物抗原Ag溶液,超纯水冲洗电极表面,4 °C冰箱中晾干,制得一种基于负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管的免疫传感器。
实施例4 所述Rh@Pd纳米枝晶的制备,步骤如下:
取2 mL、10 mmol/L的Na2PdCl4与0.5>3·3H2O混合,置于50>
实施例5所述Rh@Pd纳米枝晶的制备,步骤如下:
取2 mL、15 mmol/L的Na2PdCl4与0.5>3·3H2O混合,置于50>
实施例6所述Rh@Pd纳米枝晶的制备,步骤如下:
取2 mL、20 mmol/L的Na2PdCl4与0.5>3·3H2O混合,置于50>
实施例7 所述磺化碳纳米管的制备,步骤如下:
称取2 g多壁碳纳米管,在60 °C下真空炉中干燥24 h;称取1 g烘干后的多壁碳纳米管置于圆底烧瓶中,依次缓慢加入10 mL浓硫酸,30 mL浓硝酸,超声10 min至溶液分散均匀,于120 °C油浴中,搅拌回流10 min,自然冷却至室温,用超纯水洗涤至中性,60 °C下烘干10h,制得磺化碳纳米管。
实施例8所述磺化碳纳米管的制备,步骤如下:
称取2.5 g多壁碳纳米管,在60 °C下真空炉中干燥24 h;称取1.2 g烘干后的多壁碳纳米管置于圆底烧瓶中,依次缓慢加入10 mL浓硫酸,30 mL浓硝酸,超声10 min至溶液分散均匀,于120 °C油浴中,搅拌回流20 min,自然冷却至室温,用超纯水洗涤至中性,60 °C下烘干12 h,制得磺化碳纳米管。
实施例9所述磺化碳纳米管的制备,步骤如下:
称取3 g多壁碳纳米管,在60 °C下真空炉中干燥24 h;称取1.5 g烘干后的多壁碳纳米管置于圆底烧瓶中,依次缓慢加入10 mL浓硫酸,30 mL浓硝酸,超声10 min至溶液分散均匀,于120 °C油浴中,搅拌回流30 min,自然冷却至室温,用超纯水洗涤至中性,60 °C下烘干15 h,制得磺化碳纳米管。
实施例10所述负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液的制备,步骤如下:
称取10 mg上述制备的磺化碳纳米管,分散在10 mL、1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液中,室温下连续搅拌15 h,离心分离,35 °C下真空干燥箱中烘干,制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管;
称取5 mg的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管超声分散至5 mLpH7.2的PBS缓冲溶液中制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液;
所述1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液是将10 mg Rh@Pd纳米枝晶分散至10 mL超纯水中制得。
实施例11所述负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液的制备,步骤如下:
称取10 mg上述制备的磺化碳纳米管,分散在15 mL、1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液中,室温下连续搅拌15 h,离心分离,35 °C下真空干燥箱中烘干,制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管;
称取10 mg的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管超声分散至5 mLpH7.2的PBS缓冲溶液中制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液;
所述1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液是将10 mg Rh@Pd纳米枝晶分散至10 mL超纯水中制得。
实施例12所述负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液的制备,步骤如下:
称取10 mg上述制备的磺化碳纳米管,分散在20 mL、1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液中,室温下连续搅拌15 h,离心分离,35 °C下真空干燥箱中烘干,制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管;
称取15 mg的负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管超声分散至5 mLpH7.2的PBS缓冲溶液中制得负载Rh@Pd纳米枝晶的磺化碳纳米管分散液;
所述1 mg/mL的Rh@Pd纳米枝晶分散液是将10 mg Rh@Pd纳米枝晶分散至10 mL超纯水中制得。
实施例13 肿瘤标志物CEA的检测,检测步骤如下:
(1)使用电化学工作站以三电极体系进行测试,饱和甘汞电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极,所制备的传感器为工作电极,在10 mL,含10 mmol/L的铁氰化钾的pH=5.8 ~ 8.0磷酸盐缓冲溶液中进行测试;
(2)用差分脉冲伏安法对分析物进行检测,初始电位为0 V,终止电位为0.5 V,脉冲振幅为50 mV,脉冲宽度为50 ms,脉冲周期为50 ms,记录电流变化;
(3)记录不同浓度下的肿瘤标志物抗原所对应的电流峰值;
(4)利用工作曲线法,测定样品中CEA的线性范围为25 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为8.3 fg/mL。
实施例14肿瘤标志物SCCA的检测
按照实施例13的方法对样品中SCCA进行检测,其线性范围为25 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为8.3 fg/mL。
实施例15肿瘤标志物CA125的检测
按照实施例13的方法对样品中CA125进行检测,其线性范围100 fg/mL ~ 100 ng/mL,检测限为33.3 fg/mL。
机译: 用于催化剂载体的短碳纳米管,其制备方法,使用该碳纳米管的碳纳米管负载的催化剂以及使用该碳纳米管的燃料电池
机译: 基于碳纳米管和金纳米颗粒的电化学免疫传感器检测碱性磷酸酶的研究进展
机译: 碳纳米管负载电极的制造方法,通过该方法制造的碳纳米管负载电极及其应用