一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用

摘要

一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明的分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 13099。所述杂交瘤细胞株CGMCC No. 13099可以分泌产生对他达拉非具有较好的特异性和较高的灵敏度，对他达拉非的50%抑制浓度IC

说明书

技术领域

本发明涉及一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，属于食品安全免疫检测领域。

背景技术

他达拉非（Tadalafil, Ta）为可逆的选择性磷酸二酯酶-5（PDE-5）抑制剂，用于治疗功能性勃起障碍（ED）。由于其疗效优于枸橼酸西地那非（俗称“伟哥”），于是个别不法厂家将其添加于中药保健品。而他达拉非对心肌梗死、心律失常等心脏疾患有很大的危害,故随意服用后果严重。由于保健品中添加枸橼酸西地那非的报道较多，已引起人们的注意，而添加他达拉非又具有一定的隐蔽性，因此有必要建立快速、灵敏的检测方法用以鉴定此类保健品，为药监部门认定、查处提供参考依据。

目前他达拉非检测多采用理化方法如紫外光谱法、薄层色谱法和高效液相色谱法等，紫外光谱法和薄层色谱法因干扰难以排除，方法受到限制。仪器检测方法可进行定量分析并具有较低的检测限，但是通常需要昂贵的仪器和复杂的操作，前处理及检测时间长，严重制约了这些检测方法的推广。而免疫分析方法具有低成本、高通量、高灵敏、对技术人员相对要求低等特点，因此适用于大量样品的快速筛查。

发明内容

本发明的目的在于提供一株分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2及其应用，为间接竞争 ELISA 试剂盒以及胶体金试纸条的研发推广奠定了基础。

生物材料样品保藏：单克隆细胞株CIT1F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13099，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。

抗他达拉非特异性单克隆抗体，其由所述保藏编号CGMCC No.13099杂交瘤细胞株CIT1F2分泌产生。

所述抗他达拉非特异性单克隆抗体的应用，用于食品中他达拉非残留检测中的应用。

本发明提供的细胞株CIT1F2的制备基本步骤为：

（1）免疫原的制备与鉴定：他达拉非半抗原通过碳化二亚胺法（EDC法）与蛋白载体的氨基相连，反应结束后，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，完全抗原通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（2）小鼠的免疫：将免疫原与福氏佐剂乳化完全后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；

（3）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法，使小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株CIT1F2；

（4）杂交瘤细胞株性质的鉴定：采用小鼠单抗Ig类/亚类鉴定用酶标二抗套装测定；IC₅₀值、交叉反应率和亲和力的测定通过ELISA法。

本发明的有益效果：（1）本发明获得的单克隆细胞株CIT1F2分泌的抗体，对他达拉非有较好的检测灵敏度和亲和力；（2）获得一种新的合成他达拉非免疫原的方法，半抗原的合成步骤更加简化，有效，为今后人们的研究提供了合成免疫原的思路与方法。

生物材料样品保藏：分泌抗他达拉非特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株CIT1F2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.13099，保藏日期2016年10月31日，分类命名单克隆细胞株。

附图说明

图1是免疫原的紫外吸收光谱表征。

图2是他达拉非单克隆抗体对他达拉非的标准抑制曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。

本发明通过将他达拉非完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过间接ELISA和间接竞争ELISA筛选细胞上清，最终得到了对他达拉非有较好亲和力和灵敏度的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

实施例1 杂交瘤细胞株CIT1F2的制备

半抗原的合成：取500mg他达拉非和104mg氨基乙酸溶解在20mL的甲醇中，边搅拌边加入354.5mg 的三乙基胺。混合物在70℃反应4h。 反应结束后，将50mL蒸馏水加入反应物中终止反应。之后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，用饱和NaCl溶液清洗三次， Na2SO4除去有机相中的水，过硅胶柱，真空干燥得黄色固体粉末，即得他达拉非半抗原。

完全抗原的合成：取5mg他达拉非半抗原，再加入4.5mg EDC（1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐）和3.2mg NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），使用DMF（N,N-二甲基甲酰胺）溶解，室温搅拌，活化6h；另取10mg KLH（钥孔血蓝蛋白）溶解于2mL、0.05M、pH9.6的CB（碳酸盐缓冲溶液）溶液中，将上述活化液逐滴加入KLH溶液中，室温搅拌反应过夜后，取出免疫原，在PBS缓冲液中透析三天，-20℃分装保存。

动物免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取他达拉非完全抗原（1mg/mL）与等量福氏佐剂乳化均匀后，通过皮下多点注射免疫BALB/c小鼠，每只100μL。首次免疫采用福氏完全佐剂，加强免疫使用福氏不完全佐剂，冲刺免疫时免疫剂量为前一次免疫剂量的一半，与生理盐水混合均匀后直接进行腹腔注射；各次免疫间隔为三周。第三次免疫后，间隔一周采血检测血清效价和抑制；选择抑制最好的小鼠，在五免后18天冲刺免疫，准备融合。

细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：

（1）无菌取小鼠脾脏，研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，并进行细胞计数；

（2）收集SP2/0细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；

（3）将脾细胞和SP2/0细胞按照2-10:1的计数比例混合，离心后用PEG融合，时间1min，之后按照从慢到快，加入RPMI-1640基础培养液，离心后悬浮于含20% 胎牛血清、2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，加到96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。

细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20% 胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用间接ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用他达拉非为标准品，用间接竞争ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对他达拉非有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株CIT1F2。

单克隆抗体的制备与鉴定：取8～10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射石蜡油1mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×10⁶杂交瘤细胞，从第7天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-饱和硫酸铵法纯化，获得的单抗置于-20℃保存。

使用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对腹水纯化获得的单克隆抗体进行免疫球蛋白亚型鉴定，其亚型为IgG2a型。

使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对他达拉非的IC₅₀为4.75μg/L，可用于他达拉非的特异性快速检测。

抗体应用：将杂交瘤细胞株CIT1F2通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于他达拉非ELISA添加回收试验，具体步骤如下：

用碳酸盐缓冲液（CBS）稀释好的0.1μg/mL的他达拉非包被作为包被原包被96孔酶标板，每孔100μL，37℃包被2h后，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3 min，拍干；

用含0.2%明胶的CBS进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，用PBST洗液洗板三次，每次每孔200μL，每次3min，拍干；

用磷酸盐缓冲液（PBS）分别配置0，0.01，0.02，0.05，0.1，0.2，0.5，1μg/L的他达拉非标准溶液。将标准溶液以及待检测样品提取液，分别加入到已经封闭好的酶标板中，每孔50μL，每个样品重复3个孔，再每孔加入50μL 1：16000稀释的抗他达拉非单克隆抗体，37℃ 反应0.5h后，洗板拍干；

每孔加入100μL 用含0.1%明胶的PBS 1：3000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃反应0.5h后，洗板拍干；

每孔加入100μL TMB显色液，37℃显色15min后，每孔加入50μL 2M H₂SO₄终止液，450nm测吸光值。

添加回收及样品前处理：称取1g鸡肉样本添加三个不同剂量的他达拉非标准品，分别为0.2ng、0.5ng和1ng。均质后，加入50μL葡萄苷酸酶-芳基磺酸酯酶，混匀后，加入10mL的乙腈超声提取20min。向溶液中加入0.13g的NaCl，震荡均匀。8000rpm离心10min后提取1mL有机相氮气吹干，加入正己烷1mL，震荡1min后再加入标准品稀释液2mL，8000 rpm离心5min后，取下层液用于检测。滤液用含0.01% 明胶的PBS稀释4倍后，作为ELISA样品提取液，采用间接竞争ELISA进行添加回收试验，其回收率分别为101%，95%，95%。

溶液的配置：碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na₂CO₃>3>

磷酸盐缓冲液（PBS）：8.00g NaCl，0.2g KCl，0.24g KH₂PO₄，3.62g>2HPO₄·12H₂O，溶于800mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000mL；

PBST：含0.05% Tween20的PBS；

TMB显色液：A液：Na₂HPO₄·12H₂O>

表1.他达拉非单克隆抗体的亚型鉴定

抗体亚型亚类OD值IgA0.009IgG10.126IgG2a1.93IgG2b0.068IgG30.021IgM0.121

表2.CIT1F2单克隆抗体对他达拉非，伐地那非，红地那非，豪莫西地那非，以及西地那非的IC50和交叉反应率

IC_50>(μg/L)交叉反应率他达拉非4.75100.00%伐地那非>500<1%红地那非>500<1%豪莫西地那非>500<1%西地那非>500<1%

综上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用来限定本发明的实施范围。即凡依本发明申请专利范围的内容所作的等效变化与修饰，都应为本发明的技术范畴。