基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体及其制备方法、应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，具体公开了一种基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体，由包括侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物、功能性核酸和交联剂自组装所得。与现有技术相比，本发明的DNA水凝胶在水溶液中可以室温原位自组装形成尺寸可控、大小均一的颗粒，此颗粒在生理条件下有着很好的稳定性，能够有效减缓核酸酶对包裹在DNA水凝胶内部的功能性核酸的降解作用，而且不需要任何阳离子或病毒等转染试剂即可有效输送功能性核酸至细胞质中，从而实现治疗效果，避免了所引入的阳离子或病毒等转染试剂带来的毒副作用。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体及其制备方法、应用。

背景技术

基因疗法是一种治疗疾病的重要方法，但是，与基因疗法相关的核酸类药物普遍存在着稳定性差、易降解、难以被细胞摄取、生物利用度低、体内分布不合理以及体内循环半衰期短等缺点(Adv.Drug Delivery Rev.,2009,8,129-138.)，这些缺点也极大地限制核酸类药物的临床应用。近年来，随着纳米科技的发展，人们开发了各种各样的载体用于核酸类药物的输送。关于输送核酸类药物的载体，主要可分为两大类，一种是病毒载体，另一种是非病毒载体。尽管病毒载体能高效的对功能性核酸进行转染，但是病毒载体本身的免疫原性与潜在的遗传毒性严重制约了其应用(Gene Ther.,2008,15,1500-1510.)。非病毒载体一般由带有正电荷的阳离子聚合物构成，例如PEI、胶束(J.Am.Chem.Soc.,2015,137,15217-15224.)、脂质体(J.Am.Chem.Soc.,2015,137,6000-6010.)等，这些阳离子聚合物通过静电作用与带有负电荷的功能性核酸结合，从而输送功能性核酸。这种策略的有效性与阳离子聚合物本身的性质有关；当阳离子聚合物所带正电荷越多时，其与功能性核酸静电作用越强，从而沉默效果越好，反之，其效果越差(J.Controlled Release,2007,123,1-10.)。但是阳离子聚合物所带正电荷越多时，将会导致严重的毒副作用(Adv.DrugDelivery Rev.,2012,64,1717-1729.)。因此，当前急需发展一种既能高效沉默基因，同时副作用又小的转染方法。随着纳米科技的发展，一类无需阳离子聚合物转染的材料引起了广泛的关注，这其中包括球形核酸(SNA)和DNA折纸结构(DNA origmi)。SNA是一种以纳米颗粒为核，表面修饰了高密度的单链或双链的核酸所形成的球形核酸，它不同与普通的单链核酸，能够识别细胞表面的受体，从而触发细胞内吞(J.Am.Chem.Soc.,2009,2072-2073.)，这样就实现在无阳离子转染试剂的作用下输送功能性核酸。相似地，DNA origmi作为一种具有三维的纳米结构的纳米粒子，同样能够与细胞表面的受体作用，触发细胞内吞(Nat.nanotech.,2012,7,389-393；Angew.Chem.Int.Ed.,2014,53,7745-7750.)。然而这两种策略中所装载的功能性核酸往往裸露在纳米粒子的外部，不能够对所装载的功能性核酸提供有效的保护。

发明内容

本发明的第一目的是提供一种基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体，实现对功能性核酸的有效输送，以解决现有输送技术中所采用的病毒衣壳或阳离子聚合物所导致的人体免疫反应、遗传毒性，以及人体脏器的炎症毒性和一些其它病症的技术性问题。

本发明的第二目的是提供一种上述基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体制备方法，实现DNA水凝胶的大小可控。

本发明的第三目的是提供一种上述基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体在制备基于基因疗法治疗疾病的核酸类药物的用途。

本发明的技术方案如下：

一种基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体，由包括侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物、功能性核酸和交联剂自组装所得。

优选为，所述的侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物由侧链带有叠氮基团的可降解高分子与二苯基环辛炔修饰的DNA(DBCO-DNA)连接所得。

优选为，聚合所述的可降解高分子的聚合单体为聚己内酯、聚磷酸酯、聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚肽中的一种，但不局限于这几种可降解高分子聚合物。

优选为，所述的侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物中DNA的碱基随机选取，但碱基个数大于8个；所述的交联剂由两条部分互补DNA链组成，其中，互补部分的碱基序列是随机的，但碱基个数大于12个，非互补部分的DNA能够与可降解高分子聚合物侧链的DNA相互配对。

优选为，所述的功能性核酸为siRNA、mRNA、质粒、非编码RNA、反义寡核苷酸或Cas9-sgRNA中的一种。

优选为，当功能性核酸为siRNA时，siRNA既为功能性核酸，又是交联剂，其中，siRNA的反义链与正义链的一端分别多出一段能够与可降解高分子聚合物侧链的DNA相互配对的核酸序列。

优选为，当功能性核酸不是siRNA时，该功能性核酸一端多出一段能够与可降解高分子聚合物侧链的DNA相互配对的核酸序列。

本发明还公开了上述的基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)以开环聚合的方式合成侧链带有叠氮基团的可降解高分子，然后该可降解高分子与二苯基环辛炔修饰的DNA(DBCO-DNA)通过无铜催化点击(Click)反应，得到侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物；

(2)再将侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物溶解在水中，室温加入功能性核酸反应，搅拌混匀，使得功能性核酸与侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物完全相互配对，配对完成后，还加入交联剂与侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物完全相互配对，即制得DNA水凝胶水溶液。

优选为，所述的侧链修饰DNA的可降解高分子聚合物中的DNA与交联剂的摩尔比为8：1～2：1时，所制得的DNA水凝胶的尺寸为70nm-1.3μm。

更为优选为，当可降解高分子聚合物中的DNA与交联剂siRNA的摩尔比例为8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1时，所制得的DNA水凝胶的尺寸分别是75nm、100nm、120nm、200nm、360nm、650nm、1.2μm。

当所述的可降解高分子聚合物中的DNA与交联剂(除siRNA)的摩尔比例为8：1、7：1、6：1、5：1、4：1、3：1、2：1时，所制得的DNA水凝胶的尺寸分别是80nm、120nm、140nm、210nm、380nm、660nm、1.3μm。

本发明还公开了上述基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体在制备基于基因疗法治疗疾病的核酸类药物的用途。

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

一、本发明基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体，可在水溶液中可以原位自组装形成，能够保护功能性核酸，有效减缓核酸酶对功能性核酸的降解，完成功能性核酸的输送，而且可降解的高分子聚合物与DNA作为输送载体不会带来的毒副作用；

二、本发明基于DNA水凝胶的功能性核酸保护性载体的制备方法，可在室温下原位自组装形成尺寸可控、大小均一的颗粒，此颗粒在生理条件下有着很好的稳定性，能够有效减缓核酸酶对包裹在DNA水凝胶内部的功能性核酸的降解作用，而且不需要任何阳离子或病毒等转染试剂即可有效输送功能性核酸至细胞质中，从而实现治疗效果，避免了所引入的阳离子或病毒等转染试剂带来的毒副作用。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。

附图说明

图1为实施例1中DNA水凝胶A的制备路线示意图；

图2为实施例1中聚合物1的¹H>

图3为实施例1中聚合物2的¹H>

图4为实施例1中聚合物1和聚合物2的凝胶渗透色谱数据图；

图5为实施例1中聚合物3的变性凝胶电泳图；

图6为实施例1中DNA水凝胶A的0.5％琼脂糖电泳图；

图7为实施例1中聚合物3与步骤4制备的DNA水凝胶A的流体动力学直径数据图；

图8为实施例1中聚合物3的原子力显微镜照片；

图9为实施例1中DNA水凝胶A8-1的原子力显微镜照片；

图10为实施例1中DNA水凝胶A7-1的原子力显微镜照片；

图11为实施例1中DNA水凝胶A6-1的原子力显微镜照片；

图12为实施例1中DNA水凝胶A5-1的原子力显微镜照片；

图13为实施例1中DNA水凝胶A4-1的原子力显微镜照片；

图14为实施例1中DNA水凝胶A3-1的原子力显微镜照片；

图15为实施例1中DNA水凝胶A2-1的原子力显微镜照片；

图16为实施例2中装载反义核酸的DNA水凝胶B的制备路线示意图；

图17为实施例3中装载siRNA的DNA水凝胶C的制备路线示意图；

图18为实施例1中DNA水凝胶A6-1与含10％FBS的DMEM培养基孵育不同时间的0.5％琼脂糖电泳图；

图19为不同RNA酶浓度的DNA水凝胶A6-1的10％变形凝胶电泳图；

图20为实施例1中DNA水凝胶A6-1(装载沉默PLK1蛋白的siRNA)对肿瘤细胞凋亡作用的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1

本实施例1的DNA水凝胶A的制备路线如图1所示，具体步骤如下：

1.1聚合物1的合成

取2-氯-己内酯(700.0毫克)溶解在15毫升无水甲苯中，通过甲苯与水共沸除去溶液中的水分，除水后溶液温度在70℃时，在氮气保护下，加入干燥的乙醇(17毫克)与辛酸锡(II)，反应20分钟后，温度升至130℃继续反应4小时，反应完毕后，经二氯甲烷/冰乙醚的条件下反复冲析提纯3次，得白色粉末(500毫克)，即制得侧链修饰氯元素的可降解高分子-聚合物1，产率为69.7％。

聚合物1的¹H>3，各质子峰的归属如下：δ(ppm):4.32-4.27(m,64H,ClCH),4.26-4.15(m,128H,OCH₂),2.14-1.92(m,135H,CH₂),1.82-1.69(m,134H,CH₂),1.68-1.44(m,140H,CH₂),1.35-1.30(t,3H,CH₃).聚合物1的数均分子量Mn是11300，质均分子量Mw是15304，如图4所示。

1.2聚合物2的合成

取聚合物1(500.0毫克)溶解在10毫升无水N,N’-二甲基甲酰胺中，将NaN₃(400毫克)加入反应溶液中，25℃反应12小时，反应完毕后，减压蒸馏除N,N’-二甲基甲酰胺后，加入5毫升甲苯，离心(4000转/分钟)20分钟，除去NaN₃，再经二氯甲烷/冰乙醚的条件下反复冲析提纯3次，得白色粉末(350毫克)，即制得侧链修饰叠氮基的可降解高分子-聚合物2，产率为68.4％。

聚合物2的¹H>3，各质子峰的归属如下：δ(ppm):4.29-4.17(m,131H,OCH₂),3.91-3.84(m,64H,N₃CH),1.96-1.67(m,281H,CH₂CH₂),1.64-1.44(m,139H,CH₂),1.36-1.32(t,3H,CH₃).聚合物2的数均分子量Mn是11217，质均分子量Mw是15305，如图4所示。

1.3聚合物3的合成

取聚合物2(0.132毫克)溶解在500微升二甲基亚砜中，加入DBCO-DNA(3.3毫克)，50℃反应24小时，反应完毕后，透析除去二甲基亚砜，用50000Da的超滤离心管离心除去未反应的DBCO-DNA，所得溶液用紫外-可见分光光度计检测260nm的吸光度，计算得聚合物3上的DNA的总量。通过10％变性PAGE凝胶电泳，可以看出聚合物3由于含有大量的DNA，导致其电泳的速度极慢，如图5所示。。

本步骤制备的侧链修饰DNA的可降解高分子-聚合物3的流体动力学直径如图7所示，聚合物3粒径的平均流体动力学直径为21纳米。原子力显微镜照片如图8所示，聚合物3粒径的平均尺寸在100纳米，平均高度在0.7纳米。

1.4DNA水凝胶A的合成

本实施例详细地考察了聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的不同摩尔比，对DNA水凝胶颗粒粒径的影响，以此说明可通过调整两者的摩尔比，来控制DNA水凝胶颗粒粒径的大小。

1.4.1当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为8：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A8-1。

制备的DNA水凝胶A8-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为弥散的条带，并且条带是可以完全跑进0.5％的琼脂糖凝胶中，说明DNA水凝胶A8-1小于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A8-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A8-1粒径的平均流体动力学直径为75纳米。原子力显微镜照片如图9所示，DNA水凝胶A8-1粒径的平均尺寸在85纳米，平均高度在2.5纳米。

1.4.2当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为7：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A7-1。

制备的DNA水凝胶A7-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为弥散的条带，并且条带是可以完全跑进0.5％的琼脂糖凝胶中，说明DNA水凝胶A7-1小于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A7-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A7-1粒径的平均流体动力学直径为100纳米。原子力显微镜照片如图10所示，DNA水凝胶A7-1粒径的平均尺寸在110纳米，平均高度在4.5纳米。

1.4.3当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为6：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A6-1。

制备的DNA水凝胶A6-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为弥散的条带，并且条带是可以完全跑进0.5％的琼脂糖凝胶中，说明DNA水凝胶A6-1小于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A6-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A6-1粒径的平均流体动力学直径为120纳米。原子力显微镜照片如图11所示，DNA水凝胶A6-1粒径的平均尺寸在140纳米，平均高度在8纳米。

1.4.4当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为5：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A5-1。

制备的DNA水凝胶A5-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为弥散的条带，并且琼脂糖凝胶的上样孔与凝胶中都有条带，说明DNA水凝胶A5-1的尺寸有大于200nm，也有小于200nm的，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A5-1的流体动力学直径如图6所示，DNA水凝胶A5-1粒径的平均流体动力学直径为200纳米。原子力显微镜照片如图12所示，DNA水凝胶A5-1粒径的平均尺寸在240纳米，平均高度在9纳米。

1.4.5当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为4：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A4-1。

制备的DNA水凝胶A4-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为单一的条带，并且条带是可以完全在琼脂糖凝胶上样孔中，说明DNA水凝胶A4-1大于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A4-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A4-1粒径的平均流体动力学直径为360纳米。原子力显微镜照片如图13所示，DNA水凝胶A4-1粒径的平均尺寸在400纳米，平均高度在12纳米。

1.4.6当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为3：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A3-1。

制备的DNA水凝胶A3-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为单一的条带，并且条带是可以完全在琼脂糖凝胶上样孔中，说明DNA水凝胶A3-1大于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A3-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A3-1粒径的平均流体动力学直径为650纳米。原子力显微镜照片如图14所示，DNA水凝胶A3-1粒径的平均尺寸在700纳米，平均高度在26纳米。

1.4.7当修饰在聚合物3侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为2：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶A2-1。

制备的DNA水凝胶A2-1在0.5％的琼脂糖凝胶电泳中表现为单一的条带，并且条带是可以完全在琼脂糖凝胶上样孔中，说明DNA水凝胶A2-1大于200nm，如图6所示。

制备的DNA水凝胶A2-1的流体动力学直径如图7所示，DNA水凝胶A2-1粒径的平均流体动力学直径为1.1微米。原子力显微镜照片如图15所示，DNA水凝胶A2-1粒径的平均尺寸在1.3微米，平均高度在25纳米。

实施例2

本实施例2的DNA水凝胶B的制备路线如图16所示，具体步骤如下：

2.1聚合物4的制备

在手套箱中，将化合物1(700.0毫克)溶解在20毫升无水N,N’-二甲基甲酰胺中，迅速加入400微升新配置的Ni(COD)depe，溶液由浅黄色迅速变成亮黄色，室温反应12小时，反应完毕后，减压蒸馏除去N,N’-二甲基甲酰胺，再经二氯甲烷/冰乙醚的条件下反复冲析提纯3次，室温真空干燥得白色粉末(600毫克)，即聚合物4，产率为85.7％。

2.2聚合物5的制备

取聚合物4(0.13毫克)溶解在500微升二甲基亚砜中，加入DBCO-DNA(2.3毫克)，50℃反应24小时，反应完毕后，透析除去二甲基亚砜，用50000Da的超滤离心管离心除去未反应的DBCO-DNA，所得溶液用紫外-可见分光光度计检测260nm的吸光度，计算得聚合物4上的DNA的总量。

本步骤制备的聚合物5粒径的平均流体动力学直径为25纳米。

2.3聚合物5-antisense的制备

将聚合物5溶解在水溶液中，加入反义核酸(当修饰在聚合物4侧链上的DNA与所加的反义核酸的摩尔比例大于2)，相互混匀，使两者完全配对，形成聚合物5-antisense。

2.4DNA水凝胶B的合成

本实施例详细地考察了聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNAlinker的不同摩尔比，对DNA水凝胶颗粒粒径的影响，以此说明可通过调整两者的摩尔比，来控制DNA水凝胶颗粒粒径的大小。

2.4.1当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为8：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B8-1。

制备的DNA水凝胶B8-1粒径的平均流体动力学直径为70纳米。

2.4.2当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为7：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B7-1。

制备的DNA水凝胶B7-1粒径的平均流体动力学直径为100纳米。

2.4.3当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为6：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B6-1。

本步骤制备的DNA水凝胶B6-1粒径的平均流体动力学直径为135纳米。

2.4.4当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为5：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B5-1。

制备的DNA水凝胶B5-1粒径的平均流体动力学直径为200纳米。

2.4.5当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为4：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B4-1。

制备的DNA水凝胶B4-1粒径的平均流体动力学直径为340纳米。

2.4.6当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为3：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B3-1。

制备的DNA水凝胶B3-1粒径的平均流体动力学直径为600纳米。

2.4.7当修饰在聚合物5侧链上的DNA与所加的交联剂DNA linker的摩尔比例为2：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶B2-1。

本步骤制备的DNA水凝胶B2-1粒径的平均流体动力学直径为1.2微米。

实施例3

本实施例3的DNA水凝胶C的制备路线如图17所示，具体步骤如下：

3.1聚合物6的制备

聚乙二醇单甲醚(100.0毫克)溶解在15毫升无水甲苯中，通过甲苯与水共沸除去溶液中的微量水分，并减压除去剩余的甲苯。转移至手套箱中，加入10毫升干燥后的四氢呋喃，然后依次加入化合物2(357毫克)和一滴辛酸锡(II)，在35℃反应3小时，反应完毕后，再经甲醇/冰乙醚的条件下反复冲析提纯3次，得白色粉末(232毫克)，产率为50.8％。

3.2聚合物7的制备

聚合物6(0.110毫克)溶解在500微升二甲基亚砜中，加入DBCO-DNA(2.8毫克)，50℃反应24小时，反应完毕，透析除去二甲基亚砜，用50000Da的超滤离心管离心除去未反应的DBCO-DNA，所得溶液用紫外-可见分光光度计检测260nm的吸光度，计算得聚合物6上的DNA的总量。

本步骤制备的聚合物7粒径的平均流体动力学直径为18纳米。

3.3DNA水凝胶C的合成

本实施例详细地考察了聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的不同摩尔比，对DNA水凝胶颗粒粒径的影响，以此说明可通过调整两者的摩尔比，来控制DNA水凝胶颗粒粒径的大小。

3.3.1当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为8：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C8-1。

制备的DNA水凝胶C8-1粒径的平均流体动力学直径为67纳米。

3.3.2当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为7：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C7-1。

制备的DNA水凝胶C7-1粒径的平均流体动力学直径为95纳米。

3.3.3当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为6：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C6-1。

制备的DNA水凝胶C6-1粒径的平均流体动力学直径为120纳米。

3.3.4当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为5：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C5-1。

本步骤制备的DNA水凝胶C5-1粒径的平均流体动力学直径为190纳米。

3.4.5当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为4：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C4-1。

制备的DNA水凝胶C4-1粒径的平均流体动力学直径为340纳米。

3.4.6当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为3：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C3-1。

制备的DNA水凝胶C3-1粒径的平均流体动力学直径为600纳米。

3.4.7当修饰在聚合物7侧链上的DNA与所加的siRNA的摩尔比例为2：1时，相互混匀后，室温放置1小时，得DNA水凝胶C2-1。

本步骤制备的DNA水凝胶C2-1粒径的平均流体动力学直径为1.0微米。

实施例4

本发明的DNA水凝胶能够在含10％FBS的DMEM培养基稳定存在。

将实施例1步骤4中制备的DNA水凝胶A6-1与含10％FBS的DMEM在37℃下分别孵育1小时、2小时、4小时、8小时，采用0.5％琼脂糖凝胶电泳进行分析，结果如图18所示。当孵育时间增加至8小时，在琼脂糖凝胶中所跑出来的条带中并没有聚合物3和siRNA的条带，而且与未经孵育处理的DNA水凝胶A6-1相比，条带的弥散程度相似，说明DNA水凝胶A6-1能够在含10％FBS的DMEM培养基中稳定存在。

实施例5

本发明的DNA水凝胶能够有效减缓RNA酶对siRNA的降解作用。

向实施例1步骤4中制备的DNA水凝胶A6-1中加入RNA酶，分别配置RNA酶浓度为0.05U/mL、0.1U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.8U/mL的DNA水凝胶A6-1溶液，37℃孵育1小时，进行10％变性凝胶电泳分析，结果如图19所示。对照组中，含有0.05U/mL RNA酶的siRNA溶液37℃孵育5分钟后，siRNA被RNA酶完全降解。而RNA酶浓度为0.4U/mL的DNA水凝胶A6-1溶液，37℃孵育1小时后，siRNA只会被部分降解，说明DNA水凝胶能够有效减缓RNA酶对siRNA的降解作用。

实施例6

本发明的DNA水凝胶能够通过基因沉默抑制肿瘤的增值，最终致使肿瘤的凋亡。

选择Polo样激酶1(PLK1)作为基因沉默的靶点。将实施例1步骤4中制备的DNA水凝胶A6-1与MDA-MB-231细胞共培养72小时后，采用Annexin V-FITC/PI方法进行细胞凋亡测试，结果如图20所示，装载有沉默PLK1蛋白的siRNA的DNA水凝胶A6-1显示了很好的诱导癌细胞的凋亡的能力，说明该DNA水凝胶在治疗恶性肿瘤中具有潜在的应用价值。

以上公开的本发明优选实施例只是用于帮助阐述本发明。优选实施例并没有详尽叙述所有的细节，也不限制该发明仅为所述的具体实施方式。显然，根据本说明书的内容，可作很多的修改和变化。本说明书选取并具体描述这些实施例，是为了更好地解释本发明的原理和实际应用，从而使所属技术领域技术人员能很好地理解和利用本发明。本发明仅受权利要求书及其全部范围和等效物的限制。