功能性核酸结构的设计及其在DNA计算、SNP检测和RNA干扰中的应用

摘要

核酸(nucleic acid)是生命体至关重要的遗传信息载体，同时也是一种性能优异的纳米材料。在特异性的碱基互补配对原则的支撑下，核酸能够自组装形成大尺寸有序或是具有特定功能的多维纳米结构;而在toehold诱导的链替换反应机制的催动下，核酸结构器件则拥有了动态运转的能力。在本论文中，我们提出了三种功能性的核酸结构的设计，分别应用于分子计算、SNP检测以及RNA干扰领域的相关研究。 我们首先设计了一种DNA“组合底物”结构以构建多输入的DNA计算体系。常规的DNA底物是一种线性形式的DNA多链复合物(本章中称为“线性底物”，linear substrate)，由一条长的底部连接链和多条短的保护链通过热退火杂交而成。因长链化学合成错误率高以及多链复合物纯化难度大，因此常规的“线性底物”纯度有限，易引发严重的泄漏反应，故而难以用于构建复杂的、放大的DNA反应体系。相比之下，我们设计的“组合底物”则拥有诸多优势:其由DNA双链组合单元组合而成，因而规避了对DNA长链的依赖，同时也赋予了底物以扩展性;纯化过程仅限于双链组合单元，因此在技术上极大降低了纯化难度，有利于提高底物的纯度;理论上，“组合底物”中引入的“组合臂”(junction)结构也有利于抑制渐进式泄漏(Asymptotic leakage)的发生。作为概念验证，我们利用优化后的“组合底物”逐步扩展，分别构建了双输入、三输入以及四输入的DNA计算体系。相比于“线性底物”，“组合底物”在这些体系中都表现出了更好的抗泄漏能力，同时也赋予这些体系更好的反应动力学行为。因此，可扩展的“组合底物”可以用作构建复杂DNA反应体系的可靠基盘。 在第三章中，我们构建了一种DNA探针结构，用以区分DNA单核苷酸多态性(SNP)。这种探针由两部分组成，即三链形式的探针底物以及单链形式的竞争—催化链。相比于常规的toehold交换探针，该探针拥有更好的区分低浓度SNP的能力。在该章研究中，探针区分SNP的能力通过产率差(yield difference，Y)衡量。通过绘制探针检测的浓度—产率差关系曲线（即产率差谱， Y谱），我们从理论计算、模拟以及实验论证三个角度系统性地研究了探针在不同toehold参数以及检测时间下的SNP区分行为。结果表明，竞争—催化性探针的区分能力（即 Y）随浓度变化呈抛物线型的变化趋势。其峰的位置（即目标链检测最佳的初始浓度[I]0,m）随探针invading toehold的长度(n)的增加、incumbent toehold的长度(m)的减小、或是检测时间的延长而向低浓度方向偏移。这就为提高探针在低浓度下的区分能力提供了优化方向。此外，该探针也表现出了对SNP错配位置的不敏感，体现了这种探针的高特异性。这些结果有利于DNA杂交探针的设计从而实现更高效的SNP区分。 第四章中，我们设计了一种小的短发夹RNA结构（sshRNA）以实现对基因沉默能力的调控。调控的机制是toehold诱导的链替换反应。该sshRNA在“柄”(stem)区和3'端悬挂区分别有一段碱基错配(mismatch)和toehold序列，意在打破常规的沉默引发机制并引入新的机制，即toehold诱导的链替换反应。通过toehold区的识别结合，目标mRNA可与sshRNA发生链替换反应从而消除碱基错配的抑制效应，进而在Ago2蛋白的作用下引发基因沉默。而对沉默能力的调控则通过调节toehold的长度来实现。实验中，我们首先构建了一个稳定可靠且具有可调控性的体外转录(IVT)目标mRNA的表达平台。随后在这一基因表达平台的基础上，通过对“活性sshRNA—错配致失活—toehold可控活性”这三步设计思路的一一验证，最终得到了沉默活性可调控的sshRNA。然而调控效果有限，因此将围绕优化sshRNA的结构参数开展后续的设计和实验，最终实现对基因沉默能力的高效控制。 综上所述，本论文中包含了三种功能性核酸结构的设计以及应用，即DNA”组合底物”结构以用于DNA计算、DNA探针结构以区分低浓度SNP，以及sshRNA结构以实现对基因沉默能力的调控。这三方面的研究都充分体现了功能性核酸结构的优势和潜在的应用价值。

目录

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摘要

第一章绪论

1．1核酸的结构与材料性质

1．2核酸的自组装

1．2．1大尺寸规则结构体的组装

1．2．2功能性核酸结构体的组装

1．3基于链替换反应的DNA动态纳米技术

1．3．1简介

1．3．2制约因素——泄漏反应

1．4 DNA探针的单核苷酸多态性检测

1．5可调控的外源性双链RNA干扰技术

1．5．1外源性双链RNA干扰技术

1．5．2链替换反应调控的双链RNA干扰

2．1引言

2．2实验方法

2．2．1实验材料

2．2．2 DNA序列设计

2．2．3 DNA底物制备及纯化

2．2．4荧光分析

2．3结果与讨论

2．3．1常规的线性底物

2．3．2“组合底物”的设计及其初始泄漏分析

2．3．3渐进式泄漏分析

2．3．4“组合底物”的优化

2．3．5双输入反应体系

2．3．6三输入反应体系

2．3．7四输入反应体系

2．4本章小结

第三章竞争—催化性DNA探针的单核苷酸多态性检测

3．1引言

3．2实验方法

3．2．1实验材料

3．2．2 DNA探针底物的制备及纯化

3．2．3荧光分析

3．3结果与讨论

3．3．1竞争—催化性DNA探针的设计

3．3．2竞争—催化性探针区分SNP的理论分析

3．3．3竞争—催化性探针的SNP区分行为

3．4本章小结

第四章链替换反应调控的sshRNA干扰体系的构建

4．1引言

4．2实验方法

4．2．1实验材料

4．2．2 sshRNAs以及mRNA的制备

4．2．3基因表达的分析方法

4．2．4体外转录的mRNA的表达能力及其可调控性验证

4．2．5基于toehold诱导的链替换反应的sshRNA干扰体系的构建

4．3本章小结

第五章总结与展望

5．1总结

5．2展望

参考文献

致谢

在读期间发表的学术论文与取得的其他研究成果