避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法

摘要

本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，通过蛋白质免疫印迹技术同样可以在宰后肌肉中检测出不同肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平，所需的肌肉样品量少，操作过程较为简单，重复性好，检测所得条带清晰，实验价格低，是一种高效测定宰后肌肉中肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的方法。利用该方法可对羊骨骼肌中丝氨酸磷酸化肌原纤维蛋白的生化变化进行研究分析，也可延伸至其他动物肌肉生理生化的研究。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及到一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法。

背景技术

蛋白质磷酸化修饰是调控蛋白质结构与功能的重要途径，目前关于蛋白质磷酸化水平的方法主要集中在测定整体磷酸化水平。磷酸化修饰可能发生在丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸上，其中丝氨酸的磷酸化修饰是数量最多的，对于肌原纤维蛋白磷酸化的生化变化进行研究，以及基于肌原纤维蛋白磷酸化对动物肌肉生理生化的研究是科学研究中必不可少的。虽然现有技术中也有针对某种氨基酸的特异性抗体，但是肌原纤维蛋白种类繁多，各类之间含量差异巨大，虽然质谱可以检测到多种蛋白的磷酸化水平及磷酸化位点，但是单次检测样品少，价格高，数据分析复杂，目前还没有针对某种肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的免疫印迹检测方法。因此，一种可多蛋白识别、检测快速、价格低的测定肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的方法是亟需的。

发明内容

本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。

本发明还有一个目的是提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，按不同肌原纤维蛋白含量、分子量、信号响应值将不同肌原纤维蛋白区分开进行免疫印迹。

本发明再有一个目的是提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，避免各种肌原纤维蛋白之间丝氨酸磷酸化信号互相干扰，通过利用免疫印迹实现了对不同肌原纤维蛋白磷酸化水平的测定，解决了现有方法中不能准确检测某一种肌原纤维蛋白、操作繁琐、费用昂贵的问题。

本发明提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，包括以下步骤：

将肌原纤维蛋白样品的蛋白浓度调至2μg/μL；

将蛋白marker及肌原纤维蛋白样品分别上样至不同电泳泳道，电泳电压采用恒压 200V，待肌原纤维蛋白样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

通过蛋白质免疫印迹方法检测肌原纤维蛋白样品中丝氨酸磷酸化水平。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，蛋白marker与肌原纤维蛋白两条泳道之间留一条空白泳道。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为7.5％；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为10％；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为12％；

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，

蛋白marker上样量为2μL；

对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述肌原纤维蛋白反应的第一抗体采用丝氨酸磷酸化单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为60-80μg/ml。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用羊抗鼠IgG，所述第二抗体的浓度为0.05-0.2μg/mL。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA， 3.5min；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述第一抗体混合之前，沿蛋白marker用铅笔水平划线并延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，并将该条带垂直剪开，将剩余肌原纤维蛋白部分与所述第一抗体混合孵育。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

若检测目标非肌球蛋白重链、肌动蛋白，在与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220KDa条带、40-45KDa条带部分，将剩余部分切角标记，与第一抗体混合；

若检测目标为肌球蛋白重链与肌动蛋白，与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180KDa条带以下部分、及34-55KDa条带部分，将剩余部分切角标记。

优选的是，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述肌原纤维蛋白样品取自羊。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，通过蛋白质免疫印迹技术同样可以在宰后肌肉中检测出不同肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平，所需的肌肉样品量少，操作过程较为简单，重复性好，检测所得条带清晰，实验价格低，是一种高效测定宰后肌肉中肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的方法。利用该方法可对羊骨骼肌中丝氨酸磷酸化肌原纤维蛋白的生化变化进行研究分析，也可延伸至其他动物肌肉生理生化的研究。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例1中不同浓度凝胶经过不同时间转膜后肌球蛋白成像图；

图2为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例1中不同浓度凝胶经过不同时间转膜后肌间线蛋白成像图；

图3为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例1中不同浓度凝胶经过不同时间转膜后肌动蛋白成像图；

图4为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例1中不同浓度凝胶经过不同时间转膜后肌钙蛋白T成像图；

图5为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例2中蛋白marker对曝光信号干扰图；

图6为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例4中肌球蛋白重链丝氨酸磷酸化曝光成像图；

图7为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例4中肌动蛋白丝氨酸磷酸化曝光成像图；

图8为本发明提供的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法的实施例5中肌原纤维蛋白(肌球蛋白重链及肌动蛋白除外)丝氨酸磷酸化曝光成像图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。

本发明提供一种避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，包括以下步骤：

将肌原纤维蛋白样品的蛋白浓度调至2μg/μL；

将蛋白marker及肌原纤维蛋白样品分别上样至不同电泳泳道，电泳电压采用恒压 200V，待肌原纤维蛋白样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

通过蛋白质免疫印迹方法检测肌原纤维蛋白样品中丝氨酸磷酸化水平。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，蛋白marker 与肌原纤维蛋白两条泳道之间留一条空白泳道。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为7.5％；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为10％；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，所选分离胶浓度为12％；

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，蛋白marker上样量为2μL；

对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述肌原纤维蛋白反应的第一抗体采用丝氨酸磷酸化单克隆抗体，所述第一抗体的浓度为60-80μg/ml，或70μg/ml。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，通过蛋白质免疫印迹方法检测所述肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述第一抗体结合的第二抗体采用羊抗鼠IgG，所述第二抗体的浓度为0.05-0.2μg/mL。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min；

对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA， 3.5min；

对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，与所述第一抗体混合之前，沿蛋白marker用铅笔水平划线并延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，并将该条带垂直剪开，将剩余肌原纤维蛋白部分与所述第一抗体混合孵育。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，在通过蛋白质免疫印迹方法检测所述磷酸化的肌原纤维蛋白样品的丝氨酸磷酸化水平过程中，

若检测目标非肌球蛋白重链、肌动蛋白，在与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220KDa条带、40-45KDa条带部分，将剩余部分切角标记，与第一抗体混合；

若检测目标为肌球蛋白重链与肌动蛋白，与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180KDa条带以下部分、及34-55KDa条带部分，将剩余部分切角标记。

所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法中，所述的避免信号干扰的肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化水平的测定方法，其特征在于，所述肌原纤维蛋白样品取自羊。

本发明中用到的试剂和试剂盒：

2×还原性上样缓冲液：10％SDS 4mL，甘油2mL，0.5M Tris-HCl pH6.8 2mL，1M DTT 2.0mL，溴酚蓝0.01g：

7.5％、10％、12％的分离胶及4％的浓缩胶：Bio-Rad#1610181，#1610183，#1610185；

TBS缓冲液：Tris 1.211g，NaCl 8.76g，1mol/L的HCl调pH至7.5；

封闭液中包含：TBS 50ml/L，Tween20 25μl/L，BSA 1.5g/L：

TBST1：每500mLTBS加0.5mL Tween20；

TBST2：Tris 3.0275g，NaCl 4.38g，Tween20 0.5mL，HCl调pH至7.5，定容至500mL；

蛋白质标准品：thermo#26616；

ECL显色法中使用的试剂盒为：Bio-Rad#1705061；

BCA法测定提取样品的蛋白浓度使用的试剂盒为Thermo#23225；

下述实施例均采用Bio-Rad单向电泳系统、Bio-Rad半干法转膜仪及Bio-Rad凝胶成像系统。

实施例1

a)取部分-80℃保存的羊背最长肌肌原纤维蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度；

b)SDS-PAGE电泳：采用7.5％、10％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，凝胶的每孔均加入10μg或2μg蛋白样品，蛋白marker上样量为2μL，对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，采用7.5％的分离胶，对于分子量高于40KDa 且小于100KDa的目标蛋白，采用10％的分离胶，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，采用12％的分离胶；电泳电压采用恒压200V，待样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5 mm停止电泳；

c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF 膜用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以半干法转膜技术，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa 的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF 膜三次，每次3min；

将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭2h；

第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Sigma公司的磷酸化丝氨酸单克隆抗体(货号：P3430)，浓度为70μg/ml；更换杂交袋，将PVDF膜与配制好的一抗溶液 4℃过夜孵育；

第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次20min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μg/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育2h；

用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用Bio-rid公司的ECL(货号为)显色。

实施例2

a)取部分-80℃保存的羊背最长肌肌原纤维蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度；

b)SDS-PAGE电泳：采用7.5％、10％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，凝胶的每孔均加入10μg或2μg蛋白样品，蛋白marker上样量为2μL，对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，采用7.5％的分离胶，对于分子量高于40KDa 且小于100KDa的目标蛋白，采用10％的分离胶，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，采用12％的分离胶；电泳电压采用恒压200V，待样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5 mm停止电泳；

c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF 膜用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以半干法转膜技术，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa 的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF 膜三次，每次3min；

将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭2h；

将蛋白marker从PVDF膜剪下；

第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Sigma公司的磷酸化丝氨酸单克隆抗体(货号：P3430)，浓度为70μg/ml；更换杂交袋，将剪掉蛋白marker的PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次20min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μg/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育2h；

用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用Bio-rid公司的ECL(货号为)显色。

实施例3

a)取部分-80℃保存的羊背最长肌肌原纤维蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度；

b)SDS-PAGE电泳：采用7.5％、10％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，凝胶的每孔均加入10μg或2μg蛋白样品，蛋白marker上样量为2μL，对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，采用7.5％的分离胶，对于分子量高于40KDa 且小于100KDa的目标蛋白，采用10％的分离胶，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，采用12％的分离胶；蛋白marker和样品之间隔一空白泳道不上样，电泳电压采用恒压200V，待样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF 膜用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以半干法转膜技术，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa 的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF 膜三次，每次3min；

将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭2h；

沿蛋白marker水平用铅笔划线，延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，将蛋白marker从PVDF膜沿蛋白marker与样品之间的空白条带中间剪下；

第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Sigma公司的磷酸化丝氨酸单克隆抗体(货号：P3430)，浓度为70μg/ml；更换杂交袋，将剪掉蛋白marker的PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次20min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μg/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育2h；

用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用Bio-rid公司的ECL(货号为)显色。

实施例4

a)取部分-80℃保存的羊背最长肌肌原纤维蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度；

b)SDS-PAGE电泳：采用7.5％、10％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，凝胶的每孔均加入10μg或2μg蛋白样品，蛋白marker上样量为2μL，对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，采用7.5％的分离胶，对于分子量高于40KDa 且小于100KDa的目标蛋白，采用10％的分离胶，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，采用12％的分离胶；蛋白marker和样品之间隔一空白泳道不上样，电泳电压采用恒压200V，待样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF 膜用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以半干法转膜技术，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa 的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF 膜三次，每次3min；

将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭2h；

沿蛋白marker水平用铅笔划线，延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，将蛋白marker从PVDF膜沿蛋白marker与样品之间的空白条带中间剪下；

若检测目标为肌动球蛋白、肌动蛋白，在与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量180KDa条带以下部分、及34-55KDa条带部分，将剩余部分切角标记；

第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Sigma公司的磷酸化丝氨酸单克隆抗体(货号：P3430)，浓度为70μg/ml；更换杂交袋，将剪掉蛋白marker的PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次20min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μg/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育2h；

用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用Bio-rid公司的ECL(货号为)显色。

实施例5

a)取部分-80℃保存的羊背最长肌肌原纤维蛋白样品，BCA法测定蛋白浓度；

b)SDS-PAGE电泳：采用7.5％、10％、12％的分离胶和4％的浓缩胶，凝胶的每孔均加入10μg或2μg蛋白样品，蛋白marker上样量为2μL，对于肌原纤维蛋白中含量较高的肌球蛋白重链、肌动蛋白上样量为2.5μg，对于其他肌原纤维蛋白上样量为10μg；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，采用7.5％的分离胶，对于分子量高于40KDa 且小于100KDa的目标蛋白，采用10％的分离胶，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，采用12％的分离胶；蛋白marker和样品之间隔一空白泳道不上样，电泳电压采用恒压200V，待样品溴酚蓝标记跑至距离胶底物0.5mm停止电泳；

c)蛋白质免疫印迹(IB)：电泳结束后卸下胶板，将凝胶放入转膜缓冲液中平衡；PVDF 膜用纯甲醇活化15s，与准备好的转膜专用滤纸一起放入转膜缓冲液中平衡；以半干法转膜技术，使得凝胶上的蛋白条带转移至PVDF膜上；对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa 的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min；转膜结束后，用TBS缓冲液洗涤PVDF 膜三次，每次3min；

将PVDF膜放入裁剪好的杂交袋中，加入5ml封闭液，室温下在摇床上震荡封闭2h；

沿蛋白marker水平用铅笔划线，延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，将蛋白marker从PVDF膜沿蛋白marker与样品之间的空白条带中间剪下；

若检测目标非肌动球蛋白、肌动蛋白，在与第一抗体混合之前，沿蛋白marker水平剪去膜中分子量大于220KDa条带、40-45KDa条带部分，将剩余部分切角标记；

第一抗体简称一抗，一抗孵育：在5ml封闭液中加入Sigma公司的磷酸化丝氨酸单克隆抗体(货号：P3430)，浓度为70μg/ml；更换杂交袋，将剪掉蛋白marker的PVDF膜与配制好的一抗溶液4℃过夜孵育；

第二抗体简称二抗，二抗孵育：用TBST1缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次20min；在5ml封闭液中加入Sigma公司的anti-mouse IgG(货号为A9044)，浓度为0.1μg/ml，作为二抗溶液与PVDF膜室温震荡孵育2h；

用TBST2缓冲液洗涤PVDF膜三次，每次10min，之后利用Bio-rid公司的ECL(货号为)显色。

如图1、图2、图3和图4所示，分别采用7.5％、10％、12％的分离胶进行凝胶电泳，目标为肌球蛋白及肌动蛋白，上样量为2.5μg，目标为其他蛋白，上样量为10μg，对于分子量大于等于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，4.5min，对于分子量高于40KDa且小于100KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，3.5min，对于分子量小于等于40KDa的目标蛋白，转膜条件为半干法转膜，3mA，2.5min。肌球蛋白重链分子量约为220kDa，肌间线蛋白分子量约为55kDa，肌动蛋白分子量约为43 kDa，肌钙蛋白T分子量约为37kDa。采用上述条件，以对应的抗体检测肌球蛋白重链、肌间线蛋白、肌动蛋白、肌钙蛋白T，所检测到的条带清晰，且转膜后PVDF膜上无目标蛋白残留。

图5是实施例2所得的结果，如图5所示，采用自动曝光，只能观察到清晰的蛋白 marker的条带，说明marker也存在丝氨酸磷酸化现象，过度曝光后，能观察到肌原纤维蛋白中一些蛋白的丝氨酸磷酸化修饰现象，但蛋白marker对相邻泳道产生较强的信号干扰，剪掉marker后进行过度曝光，肌原纤维蛋白中一些蛋白的丝氨酸磷酸化信号更强，但是与marker相邻的泳道仍然存在信号干扰现象。

图6和图7是实施例4所得的结果，同时采用了实施例3的方法，如图3所示，肌球蛋白重链及肌动蛋白是肌原纤维蛋白中含量最高的两种蛋白，将两个蛋白所在分子量范围的部分在一抗孵育前从PVDF膜上剪下，可以得到清晰的丝氨酸磷酸化条带，且将蛋白 marker与样品隔一个泳道上样，成功排除了marker的信号干扰。

图8是实施例5所得的结果，同时采用了实施例3的方法，如图8所示，将肌球蛋白重链及肌动蛋白从PVDF膜上剪掉后，可以成功避免这两种蛋白对含量相对较低的其他蛋白的信号干扰，能检测到多条丝氨酸磷酸化条带；且将蛋白marker与样品隔一个泳道上样，成功排除了marker的信号干扰；同时在剪蛋白marker之前，沿蛋白marker水平用铅笔划线，延伸至蛋白marker与肌原纤维蛋白间空余的条带，可以标记蛋白分子量，在排除蛋白marker干扰的同时也发挥了蛋白marker的作用。

这里说明的处理规模是用来简化本发明的说明的。对本发明的磷酸化方法和蛋白质免疫沉淀及免疫印迹等方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。

如上所述，根据本发明，检测羊背最长肌中肌原纤维蛋白丝氨酸取得了成功，且，经反复实验，本发明方法实验重复性好，结果可靠，可为羊等动物骨骼肌中肌原纤维蛋白丝氨酸磷酸化检测研究提供技术范例。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。