盐湖链霉菌TRM20170601及在消毒剂中的应用

摘要

本发明公开盐湖链霉菌TRM20170601及在消毒剂中的应用，通过在新疆硝尔库勒湖地区采集的土壤样品中分离、筛选、培养，获得一株产生物酶能力较高从而其发酵液有显著的生物膜抑制作用的盐湖链霉菌（

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种链霉菌新菌种及其在消毒剂中的应用的技术领域。

技术背景

消毒是指根据不同的生产环节、对象用适宜的方法清除或杀灭畜禽体表及其生存环境中的病原微生物及其它有害微生物。在目前集约化程度越来越高的趋势下，养殖农场疾病发病越来越复杂，动物疫病防治问题十分突出。规模化养殖场疫病的发生往往是多因素综合作用的结果，但其中最主要的是由于外界环境中病原微生物的侵入及扩散或场内动物本身病原微生物污染扩散造成的。有效的消毒是杜绝和降低养殖场环境中的病原体，切断疫病传播途径，预防和控制养殖场传染病的重要措施之一。但是使用现有的消毒剂往往在消毒后还有残留的耐药致病菌，使用效果不理想，不能有效防治某些规模化养殖场疫病，如奶牛隐性乳房炎等反复发作，难以治愈，成为畜牧养殖产业的痼疾。

近年来研究发现，生物被膜是导致这些致病菌难以根除的主要原因，以生物被膜形式存在的细菌不同于浮游细菌，它们对抗生素等杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制有很强的抗性，生物被膜内的细菌在生理、代谢、对底物的降解或利用和对环境的抵抗能力等方面都具有独特的性质，以现有的消毒剂来对这些致病菌进行消除是很难达到理想的消毒效果的，而含有生物膜抑制剂的消毒剂可以很好地解决这一问题，大幅度提升消毒效果，利用微生物生产的生物膜抑制剂是其中一类，一些放线菌能够产生抑制细菌生物膜形成的活性物质，如吲哚、蛋白酶类等，与传统抗生素作用机制完全不同的是，这些活性物质在不影响病原菌生长的前提下，通过干扰病原菌生物膜形成相关基因表达来实现抑制作用。与传统的抗菌消毒剂相比，新型生物膜抑制活性物质在一定程度上能够缓解细菌耐药性问题。因此，细菌生物膜形成抑制剂作为新型消毒剂成分，在预防微生物尤其生物膜感染领域具有广阔的应用前景，但目前关于微生物生物膜抑制剂用于消毒剂的报道很少，因此需要进一步探究微生物的生物膜抑制作用，为微生物生物膜抑制提供具有生物膜形成抑制作用且性能稳定的抗性菌株，将在消毒剂领域有潜在的应用开发前景。

发明内容

针对现有技术中未见有关本发明中的链霉菌新菌种及在消毒剂中的应用的相关报道，且现有的消毒剂在消毒后还有残留的耐药致病菌，使用效果不理想，不能有效防治规模化养殖场疫病的现状，本发明旨在为消毒剂中提供具有生物膜形成抑制作用且性能稳定的抗性新的菌株。本发明通过在土壤样品中分离筛选出一株链霉菌新菌种，且具有产生物酶能力较高从而其发酵液有显著的生物膜抑制作用。通过提供一种盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601CGMCC No.14260，以及该菌的发酵液在消毒剂中的应用技术方案。

本发明采用的主要技术方案：

本发明采用的土壤样品由塔里木大学生命科学学院采自新疆硝尔库勒湖，将采集的土壤样品经大量筛选、优选出一批生长良好的链霉菌菌株，进行16S rRNA基因序列的测定，从中筛选出一株抑制生物膜形成能力较强的链霉菌的新菌种(Streptomycessalilacus)。

本发明具体提供一种盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260，通过提供确定的的筛选方法，在采集的土壤样品中分离筛选和培养，获得一批链霉菌微生物菌株，从中筛选出一株抑制生物膜形成能力较强的链霉菌菌株TRM20170601，经微生物学分类与鉴定，属于链霉菌(Streptomyces salilacus)中新的菌株，暂命名为Streptomyces salilacusTRM20170601。

具体的，本发明通过对采集土壤样品进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为TRM20170601的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于链霉菌(Streptomycessalilacus)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2017年6月21日，菌种保藏号为CGMCCNo.14260。经微生物学鉴定为链霉菌(Streptomyces salilacus)，经过系统分类确定该菌种TRM20170601规范名称为盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)。该菌株最适生长条件为：温度28℃，培养基采用高氏一号培养基(甘露醇10g、七水硫酸镁1g、碳酸钙0.2g、丙氨酸1g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸亚铁0.01g、氯化钠15g、重铬酸钾50mg、琼脂粉18g、水1L、微量盐1mL(0.001g/L)、复合维生素1mL(0.5mg/L)、pH7.2～7.4)，培养时间4d；经4d培养后，在高氏一号培养基表面，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；该菌为革兰阳性菌、好氧、菌体杆状、无鞭毛、有内生孢子形成。根据以上形态特征，参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》对TRM20170601菌株进行形态学，生理生化鉴定，并结合分子生物学测序，初步鉴定该菌株为链霉菌(Streptomycessalilacus)的成员，但该菌种具有新菌种鲜明特征，从其分类学角度，暂命名为盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601。

同时，本发明通过提取菌株TRM20170601的总DNA，采用细菌16SrDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化后测序。将所测16SrRNA基因序列与GenBank数据库中的序列进行比对，结果表明：菌株TRM20170601与模式菌株Streptomyces macrosporusNBRC 14748^T(AB184616)最大同源为98.0％，与同属其它菌株同源性均小于97.0％，尚不能确定其确切分类，确定为一株新菌种，从其分类学角度暂命名为Streptomyces>

进一步，本发明提供一种盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601CGMCC No.14260发酵液在消毒剂中的应用。通过研究在不同pH值、温度、有机试剂处理条件下链霉菌(Streptomyces salilacus)发酵液对抑制生物膜形成的影响，得到菌种TRM20170601对生物膜形成的最佳抑制条件是pH值11，温度60℃，经乙醚处理。

通过实施本发明具体技术指标，实现本发明内容，可以达到以下有益效果：

(1)本发明提供的盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260，具有培养条件简单，繁殖快，遗传特性稳定，抑制生物膜形成能力较强的优点。

(2)本发明提供的盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液在消毒剂中应用时，在pH值11，温度60℃，经乙醚处理的条件下，抑制生物膜形成的能力最强，可以使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力低至10.94％，并且在杀菌试验时作用5min后对菌悬液内表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌平均杀灭对数值均＞5.00。

附图说明

图1所示为所示为盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260的菌落和菌体照片。

图2所示为所示为盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260的系统发育树状图。

图3所示为温度对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响。

图4所示为pH值对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响。

图5所示为有机试剂处理对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601CGMCC No.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响。

具体实施方式

下面，举实施例说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。本发明中选用的所有原辅材料(除表皮葡萄球菌ATCC 35984(生物膜形成阳性菌株)外，其由上海复旦大学医学院赠送)，以及选用的菌种培养方法都为本领域熟知选用的，本发明中涉及到的％都为重量百分比，除非特别指出除外。

实施例一：盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCC No.14260的分离、筛选及鉴定

1、菌种的分离和筛选

本发明所使用的盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601本发明土壤样品由塔里木大学生命科学学院采自新疆硝尔库勒湖，将采集的土壤样品经大量筛选、优选出一批生长良好的链霉菌菌株，进行16S rRNA基因序列的测定，从中筛选出一株编号为TRM20170601的菌株。

分离步骤：

采用微生物分离的梯度稀释法得到一系列的梯度稀释液，用灭菌吸管分别吸取I0^-1-10^-3稀释度的混合菌稀释液0.lmL，分别移放到倒有高氏一号培养基的平板上，用无菌玻璃棒涂布均匀，然后倒置于28℃的恒温培养箱中培养至长出单菌落，在无菌操作台中以无菌接种环挑取平板上长出的单菌落接种到装有高氏一号培养基的平板上划线分离待长出单菌落后，再次转入灭菌试管斜面上，每株菌每次做三个重复，置于28℃条件下培养3-5天。利用透过光、反射光及暗背景的光线观察菌落的一致性，涂片染色用光学显微镜观察菌体的一致性，经多次反复分离纯化直到菌落及个体均匀一致后备用。

2、菌株的培养条件

(1)编号为TRM20170601的菌株的生长培养基为高氏一号培养基：甘露醇10g、七水硫酸镁1g、碳酸钙0.2g、丙氨酸1g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸亚铁0.01g、氯化钠15g、重铬酸钾50mg、琼脂粉18g、水1L、微量盐1mL(0.001g/L)、复合维生素1mL(0.5mg/L)、pH7.2～7.4。

(2)编号为TRM20170601的菌株在25-50℃条件下均能生长，最适生长温度为28℃，培养时间为3-5d。

(3)编号为TRM20170601的菌株最适生长pH7。

具体的，本发明通过对采集土壤样品进行分离、筛选和培养，从中筛选出一株编号为TRM20170601的菌株，经微生物学分类与鉴定，该菌株属于链霉菌(Streptomycessalilacus)菌株。该菌株已于申请日前保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。保藏日期2017年6月21日，菌种保藏号为CGMCCNo.14260。经微生物学鉴定为链霉菌的新菌种，从其分类学角度暂定分类为链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601。该菌株最适生长条件为：温度28℃，培养基采用高氏一号培养基(甘露醇10g、七水硫酸镁1g、碳酸钙0.2g、丙氨酸1g、磷酸氢二钾1g、七水硫酸亚铁0.01g、氯化钠15g、重铬酸钾50mg、琼脂粉18g、水1L、微量盐1mL(0.001g/L)、复合维生素1mL(0.5mg/L)、pH 7.2～7.4)，培养时间4d。

3、菌株TRM20170601的生理生化鉴定

形态特征：TRM20170601经4d培养后，在高氏一号培养基表面，菌落呈圆形、边缘整齐、凸起、光滑、白色、不透明、黏稠不易挑起；该菌为革兰阳性菌、好氧、菌体杆状、无鞭毛、有内生孢子形成，其菌落和菌体形态参见附图1。

生理生化特征：Biolog GN2板检测该菌可利用的碳源为：L-岩藻糖、葡萄糖和D-果糖。

通过上述菌种盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260的菌体形态、培养特征观察及生理生化指标测定，即通过菌体形态观察、菌株培养特征观察、生长温度测定等试验，参照《伯杰氏系统细菌学鉴定手册》第八版和《常用细菌系统鉴定手册》的方法进行，编号为TRM20170601的菌种与常见的链霉菌菌种相比，具有明显的生理生化特性差异，且抑制生物膜形成能力更强，表明TRM20170601菌株是一种典型的新菌种，从其分类学角度，该菌株归属链霉菌(Streptomyces salilacus)的成员，暂命名为盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601。

实施例二：盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCC No.14260分子水平鉴定

提取菌株TRM20170601的总DNA，采用采用细菌16S rDNA PCR扩增通用引物，进行PCR扩增，PCR产物经切胶纯化后测序。菌株TRM20170601的全基因序列参见附后提供的SEQUENCE LISTING，将实验菌株的所得序列与GenBank数据库中的已知序列进行BLAST比较，确定与实验菌株亲缘关系最近的种属关系。并结合EzTaxon(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)中序列比对并调取相关模式菌株序列，以进行系统发育树分析标准模式菌序列，利用MEGA5.0软件包采用邻接法(Neighbor-Joiningmethod)进行聚类分析和系统进化树构建。由系统进化树可示，菌株TRM20170601与模式菌株Streptomycesmacrosporus NBRC 14748^T(AB184616)最大同源为98.0％，系统进化树参见附图2，编号为TRM20170601的菌种与其常见的链霉菌(Streptomyces salilacus)成员菌具有鲜明的区别，具有明显的分子水平差异性，确定为链霉菌为典型的新菌种，从其分类学角度，该菌株归属(Streptomyces salilacus)的成员，暂命名为Streptomyces>

实施例三：盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCC No.14260发酵液的制备

(1)菌株的活化：将保存在甘油管中的菌株接种到高氏一号培养基平板上，28℃培养5d。

(2)种子液的制备：将活化好的菌株从高氏一号固体平板上挑取单菌落转接到装有150mL液体高氏培养基的500mL三角瓶中，恒温摇床28℃，185r/min培养5-7d。

(3)初始发酵培养条件：将种子液按4％的接种量接种到液体高氏一号培养基中，恒温摇床28℃，185r/min培养15d。

实施例四：不同pH值、温度、有机试剂处理条件下盐湖链霉菌(Streptomycessalilacus)发酵液对抑制生物膜形成的影响

1、试验方法

将菌液按1:100比例稀释，发酵液经无菌滤膜过滤，将处理后的发酵液按不同浓度(10％～50％)与菌液进行混合，混合后吸取20μL至96孔板，每个梯度4孔，恒温培养箱37℃静置培养24h，测OD590(需要核实是OD590还是OD₅₉₀，下同)，流水缓慢洗板3次，以洗去未黏附细菌。放入烘箱，56℃，烘干1h，用0.5％结晶紫染色5min，流水冲洗，洗去多余的结晶紫染液，自然晾干，测OD490。

相对生物膜形成能力＝(处理组OD490/空白OD490)×100。

2.不同温度对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响

把温度为-20℃设为未处理组，处理组温度分别为：30℃、40℃、60℃、80℃、100℃将发酵液用不同温度水浴处理30min后，结果如附图3所示，当蛋白温度为-20℃时相对生物膜形成能力为51.36％；温度为30℃时相对生物膜形成能力为52.02％；温度为40℃时相对生物膜形成能力为49.88％；温度为60℃时相对生物膜形成能力为37.89％；温度为80℃时相对生物膜形成能力为54.68％；温度为100℃时相对生物膜形成能力为59.04％；温度为60℃时发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力最强。

3.不同pH值对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响

以pH值为7为未处理组，分别将发酵液调至不同pH值，测其对表皮葡萄球菌ATCC35984相对生物膜形成能力的影响，结果如附图4所示，当蛋白的pH值为3时相对生物膜形成能力为27.47％；pH值为5时相对生物膜形成能力为30.24％；pH值为7时相对生物膜形成能力为38.54％；pH值为9时相对生物膜形成能力为25.74％；pH值为11时相对生物膜形成能力为10.94％；当pH值为11时相对生物膜形成能力最弱，其生物膜抑制率最高。

4.不同有机试剂对盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜形成能力的影响

把未加有机试剂只加了发酵液的设为未处理组，以丙酮、氯仿、乙酸乙酯、乙醚设为处理组，结果如附图4所示，经丙酮处理的其相对生物膜形成能力为14.47％；经氯仿处理的其相对生物膜形成能力为38.4％；经乙酸乙酯处理的其相对生物膜形成能力为11.21％；经乙醚处理的其相对生物膜形成能力为10.98％；未经有机试剂处理的其相对生物膜形成能力为45.27％；通过以上实验表明发酵液经乙醚处理后生物膜形成能力最弱，发酵液抑制表皮葡萄球菌生物膜活性最强。

实施例五：基于盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCCNo.14260发酵液制备的消毒剂对不同细菌杀灭效果

用无菌标准硬水将基于盐湖链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601CGMCC No.14260发酵液制备的消毒剂稀释成试验浓度2倍的消毒剂，将消毒液于60℃±1℃水浴中恒温10min。在无菌试管内加入1.0ml菌悬液与4.0ml消毒液(阳性对照组为稀释液)混合，作用至预定时间。取1ml菌药混合液，加于装有10ml中和剂的试管中，混匀，中和作用15min。经充分混合，吸取1.0ml样液作倾注接种培养，进行活菌计数，计算杀灭对数值。试验重复2次，结果如表1所示。

表1：基于新菌种发酵液制备的消毒剂对不同细菌杀灭效果

基于链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601 CGMCC No.14260发酵液制备的消毒剂稀释液作用5min，对菌悬液内表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌平均杀灭对数值均＞5.00；对白色念珠菌作用5min，平均杀灭对数值为3.57。

以上实验可知，将本发明提供的链霉菌(Streptomyces salilacus)TRM20170601CGMCC No.14260发酵液研制成消毒剂，在pH值11，温度60℃，经乙醚处理的条件下，抑制生物膜形成的能力最强，可以使表皮葡萄球菌相对生物膜形成能力低至10.94％，并且在杀菌试验时作用5min后对菌悬液内表皮葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌平均杀灭对数值均＞5.00，该菌种具有培养条件简单，繁殖快，遗传特性稳定，抑制生物膜形成能力较强的优点，获得显著突出的技术效果。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所延伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 塔里木大学

<120> 盐湖链霉菌TRM20170601及在消毒剂中的应用

<130> TRM 20170601

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1498

<212> DNA

<213> TRM 20170601

<220>

<221> TRM 20170601

<222> (1)..(1498)

<400> 1

gagtttgatc ctggctcagg acgaacgctg gcggcgtgct taacacatgc aagtcgaacg 60

atgaacctcc ttcgggaggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg ggcaatctgc 120

cctgcactct gggataactc cgggaaaccg gagctaatac cggataggac cgcctcgggc 180

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gtggggtgat ggcctaccaa ggcgacgacg ggtagccggc ctgagagggc gaccggccac 300

actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa 360

tgggcgcaag cctgatgcag cgacgccgcg tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc 420

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ttgttctgtg ttgccagcaa cgtcttcggg cggttgggga ctcacaggag actgccgggg 1140

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