一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌及其应用

摘要

本发明公开了一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌及其应用。该溶血葡萄球菌的名称为溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)JS‑1，保藏编号为CCTCC NO：M 2017308，于2017年6月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。该溶血葡萄球菌对水稻白叶枯病菌具有优异的拮抗作用，在此基础上可以进行进一步的田间试验，借以开发出一种成熟的微生物有机肥，对减少大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于微生物筛选领域，特别涉及一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌及其应用。

背景技术

水稻白叶枯病是水稻上的重要细菌性病害，主要是在亚洲、北美和非洲部分地区发病，在亚洲中又数中国南方稻区及南亚国家的水稻发病相对严重。受害水稻一般减产20％～30％，严重的可达50％，甚至没有收成。水稻白叶枯病菌(Xoo)属于革兰氏阴性菌，菌体短杆状，单鞭毛，极生或亚极生，不具芽孢及荚膜，有粘质的胞外多糖包围在菌体外。水稻白叶枯病菌通过水孔或伤口侵染水稻叶片的维管束而引发水稻白叶枯病。

水稻白叶枯病又称白叶瘟、茅草瘟、地火烧等。我国各稻区均有发生，秧苗在低温下不显症状，高温下秧苗病斑短条状，小而狭，扩展后叶片很快枯黄凋萎。水稻白叶枯病分为如下类型：(1)叶缘型：是一种慢性症状，先从叶缘或叶尖开始发病，发现暗缘色水渍状短线病斑，最后粳稻上的病斑变灰白色，籼稻上为橙黄色或黄褐色，病健明显；(2)青枯型：是一种急性症状，植株病感后，尤其是茎基部或根部受伤而感病，叶片呈现失水青枯，没有明显的病斑边缘，往往是全叶青枯；病部青灰色或绿色，叶片边缘略有皱缩或卷曲。

目前，水稻白叶枯病菌的防治方法主要有加强田间管理、培育抗病品种、使用化学药剂和施用生防菌剂等，但实践证明，田间管理难以有效控制水稻白叶枯病的发生，抗性材料的选育耗时长，而化学防治污染环境、破坏生态平衡，且化学药剂的长期使用易使病原菌产生抗药性。因此，利用生防菌株及其活性产物防治水稻白叶枯病菌越来越受到人们的重视。

因此，获得更多能防治水稻白叶枯病菌的生防菌株更有利于防治水稻白叶枯病菌。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌。

本发明的另一目的在于提供所述用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌，名称为溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)JS-1，保藏编号为CCTCC NO：M 2017308，于2017年6月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心。

所述的用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌在制备防治水稻白叶枯病菌制剂中的应用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明提供的溶血葡萄球菌JS-1对水稻白叶枯病菌有优异的拮抗作用。在此基础上可以进行进一步的田间试验，借以开发出一种成熟的微生物有机肥，对减少大量化肥、农药的使用，减轻农业面源污染具有重要意义。

附图说明

图1是本发明中菌株JS-1对水稻白叶枯病菌的拮抗效果示意图。

图2是本发明中水稻白叶枯病菌拮抗菌JS-1的生防效果试验图。

图3是本发明中菌株JS-1的菌落示意图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：细菌进行分离纯化：

1、培养基

LB培养基：蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH>

2、实验步骤

2.1培养基配制

配制如1所述的LB琼脂培养基，为细菌培养基。

2.2样品采集

选择具代表性的地点(湖南永州的水稻田地)，铲去表层土，用采土工具采取距离地表下5～10厘米深度的土层中的土壤，每个地点采5个样本，装入袋中并作好记录。

2.3土壤稀释液的制备

称取10g土壤，放入装有90mL无菌水的三角瓶中充分振荡，制成1：10(体积比)浓度的土壤稀释液。待土粒沉淀后，吸取1ml上清液，移入盛有9ml灭菌水的试管中，制成1：100浓度的土壤悬浮液，依次类推，制成1：1000和1：10000的土壤悬浮液，制成10^-2、10^-3、10-4、10^-5和10^-6倍的土壤溶液备用。

2.4细菌分离

选择10^-3、10^-4、10^-5和10^-6四个浓度各0.1ml，将稀释的土壤悬浮液分别倒入LB培养基培养皿中，将涂布棒在酒精灯火焰充分灼烧灭菌，待冷却后涂布平板。将接种完的培养皿倒置，30℃恒温培养，设置三个重复。

2.5结果

按上述方法分离得到细菌435株。

实施例2：分离得到的细菌对水稻白叶枯病菌的平板拮抗试验

1、培养基

1.1固体培养基

LB培养基：蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract)5g，NaCl 10g，琼脂15g，H₂O定容至1000ml，pH>

1.2液体培养基

LB液体培养基：不加琼脂即可。

2、实验步骤

2.1平板拮抗试验-----初筛

2.1.1菌种活化

水稻白叶枯病菌和细菌进行菌种活化：水稻白叶枯病菌PXO99(水稻白叶枯病菌菲律宾6号小种，购买自ATCC)和分离细菌分别转接至LB培养基平板，分别于28℃和30℃，培养2天和1天，备用。

2.1.2水稻白叶枯病菌平板的制备

活化的水稻白叶枯病菌接入LB液体培养基中于28℃、200rpm进行摇瓶培养。隔天以LB固体培养基倒平板，等培养基凝固后每个直径为9cm的平板中加入0.1ml(OD₆₀₀约2.0)水稻白叶枯病菌发酵液(发酵2天)，涂布均匀，吹干备用。

2.1.3平板拮抗试验初筛

用灭菌的牙签挑取活化的分离细菌单菌落，点接在含水稻白叶枯病菌的LB平板上，每个平板接30株不同的拮抗菌，3个重复，28℃培养，24h、36h和48h分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的有无。

2.2平板拮抗试验-----复筛

2.2.1菌种活化

同2.1.1，活化选择初筛有抑菌圈的分离细菌。

2.1.2水稻白叶枯病菌平板的制备

活化的水稻白叶枯病菌接入LB液体培养基中于28℃、200rpm进行摇瓶培养。隔天以水稻白叶枯病菌培养基倒平板，等培养基凝固后每个直径为9cm的平板中加入0.1ml(OD₆₀₀约2.0)水稻白叶枯病菌发酵液(发酵2天)，涂布均匀，吹干后打孔器(Φ5mm)打孔，每个平板打一个孔备用。

2.2.3分离细菌液体发酵

在水稻白叶枯病菌液体摇瓶培养的第二天，活化分离细菌转入液体LB培养基中于30℃、200rpm进行摇瓶培养，培养24小时(OD₆₀₀约2.0)。

2.2.4平板拮抗试验复筛

用移液枪吸取10μl分离细菌发酵液放入水稻白叶枯病菌平板的孔中，吹干，3个重复，28℃培养。24h、36h和48h分别观察实验结果，主要观察抑菌圈的有无和大小。

3、结果

通过初筛试验得到有拮抗效果的细菌30株，通过平板拮抗试验打孔复筛，得到拮抗效果较好的细菌5株，菌株JS-1为抑菌圈最明显的菌株，如图1所示。图1试验为先在平板上涂0.1ml水稻白叶枯病菌发酵液，然后用打孔器打孔，将菌株JS-1发酵液放入孔中吹干，28℃培养而得。

由图1可以看出抑菌圈明显，说明菌株JS-1对水稻白叶枯病菌具有明显的拮抗作用。

实施例3：菌株JS-1发酵液在盆栽上对水稻白叶枯病菌进行生防效果试验，为了检验菌株SJ-1的生防效果，进行了本实验。

实验步骤：

1.1水稻种子萌发

水稻种子品种为黄华占，先用5％(w/v)的次氯酸钠消毒1小时，在37℃条件下浸泡24小时，随后将浸泡的种子平铺(密度稀)在玻璃培养皿上，黑暗下发芽48小时，特别注意发芽时玻璃培养皿中不要留水，只让种子一直保持湿润即可；播种前，选取出芽比较一致的下种。

1.2苗移栽

在花盆(规格50×20×16cm)装满泥塘土，略压紧，然后每盆移入6株水稻苗，浇水后两指在根部略压紧，在大棚中培养。

1.3水稻白叶枯病菌和拮抗菌活化和发酵液制备

水稻白叶枯病菌和拮抗菌分别活化，然后挑单菌落接入液体摇瓶培养，28℃和30℃，200rpm，培养两天(OD₆₀₀都约2.5)。

1.4水稻白叶枯病菌和拮抗菌穿刺法接种

本实验采用穿刺法接种，用无菌牙签沾取菌液，选择长势相似叶片穿刺接种，实验设置2个对照组，即CK1和CK2，CK1：只沾取LB培养基；CK2：只沾取水稻白叶枯病菌发酵液，不加拮抗菌发酵液。菌株JS-1处理：水稻白叶枯病菌发酵液和拮抗菌发酵液按体积比1:1混合后，再用无菌牙签沾取，做穿刺接种，每个处理6株。

1.5记录

隔一天记录发病植株数和发病严重程度。

2、结果

如图2所示，只接种LB培养基的对照组不发病，只接种水稻白叶枯病菌的对照组比接种了拮抗菌JS-1的发病情况严重很多，说明拮抗菌JS-1对水稻白叶枯病菌有很好的防治作用。

实施例4：对分离得到的细菌进行鉴定

(1)菌株JS-1的形态特征如图3所示：在LB培养基中生长良好，菌株细胞球状，在LB琼脂平板上培养时菌落圆形凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，不透明。

(2)菌株JS-1的生理生化特征如下：参照伯杰氏细菌鉴定手册，对该菌株JS-1进行鉴定，结果如表1所示，初步确认为属溶血葡萄球菌。

(3)对菌株JS-1进行凝固酶实验，检测其致病性：试管法：于试管内加按体积比1：4稀释的兔或人血浆0.5ml，再加1～2个待试菌菌落，置37℃水浴，每30min观察1次结果。如有凝块或整管凝集出现为阳性。2h后无上述现象出现，则放置过夜后再观察。本发明的拮抗菌JS-1用兔血浆进行检测，凝固酶实验结果为阴性，表明拮抗菌JS-1是无致病力菌株，可以放心使用。

(4)菌株JS-1的16S rDNA序列：将该菌株送到测序公司进行16S rDNA测序，结果如下所示。将16S rDNA基因序列进行Blast结果分析，得到与溶血葡萄球菌相似度达99.9％，结合其形态特征及生理生化特性与溶血葡萄球菌最相似，因此根据16S rDNA基因序列测定和形态特征、生理生化特性结果来看，该菌株可以归为溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)。将该菌株命名为溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)JS-1，于2017年6月6日保藏于位于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2017308。

表1菌株JS-1理化实验结果

菌株JS-1 16S rDNA基因序列测定结果如下:

GTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAACAGACAAGGAGCTTGCTCCTTTGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGGGATAACTTCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAATATTTCGAACCGCATGGTTCGATAGTGAAAGATGGTTTTGCTATCACTTATAGATGGACCCGCGCCGTATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTCTTCGGATCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACATACGTGTAAGTAACTATGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGAAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAAGCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACAACTCTAGAGATAGAGCCTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAGCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAATACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTCAAGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGATTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTTGGAGCTAGCCGTCGAA。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一株用于防治水稻白叶枯病菌的溶血葡萄球菌及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 溶血葡萄球菌

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