一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌U‑19‑3及应用

摘要

本发明涉及一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌U‑19‑3及应用；海洋放线菌U‑19‑3，分类为小单孢菌，micromonospora sp。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC号：12139。海洋放线菌U‑19‑3；分离自取胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物；利用干热法进行预处理，重铬酸钾作为分离抑制剂；其基内菌丝呈橙色，气生菌丝呈黑色。从基因组中成功扩增出Ⅰ型聚酮合酶(PKS I)基因和Ⅱ型聚酮合酶基因(PKS Ⅱ)，预示其具有产聚酮化合物的潜在能力。对藤黄八叠微球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌、白色假丝酵母菌具有良好的抑菌效果。

说明书

技术领域

本发明涉及一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌U-19-3，其属于微生物学中放线菌领域。

背景技术

放线菌(Actinomycetes)是一类高(G+C)含量(>55％)的革兰氏阳性细菌，因其菌落边缘菌丝常呈放线状而得名[1]。放线菌作为一类有价值的微生物资源，拥有合成丰富的生物活性的次级代谢产物的能力。目前在已发现的33500种天然活性产物中，40％以上在放线菌中发现[2]；生活中普遍应用的各类抗生素约70％也是由放线菌生产[3]。

海洋环境由于其特殊的极端性(高压、低温、高盐、缺乏光照、营养匮乏等)，造就了海洋微生物独特的生存方式、代谢途径，从而具备合成新颖活性化合物的能力[4]，使得海洋微生物成为了活性天然产物的重要来源之一，也成为新药研发的主力军[5]。据统计，来源于放线菌的活性化合物约占微生物天然活性产物的45％，这些结构新颖、功能多样和具有特殊生理活性的海洋放线菌次级代谢产物的发现和其蕴含的应用价值潜力，提供了产生新颖抗生素的潜力，为海洋微生物来源的天然产物的开发奠定基础，也为海洋微生物资源的高效利用提供科学依据。

[1]周长林，微生物学，北京：中国医药科技出版社，2009

[2]Bérdy J.Thoughts and facts about antibiotics:where we are now andwhere we are heading.Journal of Antibiotics,2012,65(8):385～395

[3]Bérdy J.Bioactive microbial metabolites.Journal of Antibiotics,2005,58(1):1～26

[4]赵成英，朱统汉，朱伟明，2010～2013之海洋微生物新天然产物，有机化学2013，33(6)：1195-1234

[5]Hu G P,Yuan J,Sun L,et al.Statistical research on marine naturalproducts based on data obtained between 1985 and 2008.Marine Drugs,2011,9(4):514～525

发明内容

鉴于上述，本发明利用胶州湾海洋微生物资源，提供一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌，该菌对藤黄八叠微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)均具有良好的抑菌效果，并含有PKS I和PKS II基因。

本发明所涉及的一株具有广谱抗菌活性的海洋放线菌U-19-3，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类为小单孢菌，micromonospora sp。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，CGMCC号：12139，保藏日期：2016年2月18号。

本发明的海洋放线菌U-19-3；从其基因组中扩增出I型和Ⅱ型聚酮合酶基因。

本发明的的海洋放线菌U-19-3；分离自取胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物；利用干热法进行预处理，重铬酸钾作为分离抑制剂；其基内菌丝呈橙色，气生菌丝呈黑色。

本发明的的海洋放线菌U-19-3；具有广谱抗菌活性，对藤黄八叠微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)具有良好的抑菌效果。

具体说明如下:

取胶州湾海域观测站位采集的表层沉积物，用干热法进行预处理，稀释成不同浓度在重铬酸钾筛选培养基上培养14-21天后纯化。进行菌株发酵，采用牛津杯法和纸片扩散法检测发酵液抗菌活性。观察菌株形态特征，进行生理生化试验。提取菌株基因组，扩增16SrDNA和PKS I和PKSII基因，分别对这些序列进行比对分析。

U-19-3对供试藤黄八叠微球菌(Micrococcus luteus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)均具有良好的抑菌效果。通过形态观察，在生长最佳的察氏培养基上，U-19-3基内菌丝呈橙色，气生菌丝呈黑色。通过生理生化试验，发现U-19-3不能液化明胶，不能凝固和胨化牛奶，可以水解淀粉，不产生硫化氢；碳源试验中，只能利用阿拉伯糖和木糖。通过对16S rDNA的鉴定，结合上述特征，初步将放线菌U-19-3分类为小单孢菌，micromonospora sp。对其PKSI及PKS II基因的扩增揭示了其产聚酮化合物的潜力。

本发明的优点是：

海洋放线菌U-19-3具有广谱抗菌活性，对供试藤黄八叠微球菌(Micrococcusluteus)、大肠杆菌(Escherichia coli)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色假丝酵母菌(Candida albicans)具有良好的抑菌效果。从海洋放线菌U-19-3中扩增出的PKS I和PKSII基因揭示了其产聚酮化合物的潜力。

附图说明

图1：U-19-3在GAU培养基生长示意图。

具体实施方式

1.样品的采集与预处理

样品采集信息：在胶州湾海域9个不同观测站位采集的表层沉积物，由中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室提供。将采集得到的样品保存于4℃低温冰箱中，用无菌塑料袋长期保存。使用时，将10mL海底沉积物样品铺于无菌培养皿内，80℃或120℃干热处理1-2h，磨细成粉末，稀释后做分离待用。

2、海洋放线菌的分离

海洋放线菌的分离主要采取平板梯度稀释法，具体步骤如下：

(1)均称取干热处理的样品10.0g，加入90mL无菌海水中，150r/min震荡20min后，静置30min取上清液，逐级稀释至10-2、10-3、10-4，各取100微升涂布上述个选择性平板，每个梯度设3个重复；

(2)培养基中含0.0075％的重铬酸钾(或选择萘啶酮酸+制霉菌素)，以抑制细菌和真菌的生长，放入28℃的培养箱中倒置培养14d～21d；

(3)挑取不同形态的菌落到放线菌筛选培养基平板上进行培养，然后将分离的菌落在平板上反复划线纯化，直至得到菌落形态单一的培养物命名为U-19-3。

3、抗菌活性测定

采用牛津杯(管碟法)和纸片扩散法来检测U-19-3发酵液抗菌活性，具体步骤如下：

(1)牛津杯法

1)以无菌操作在固体培养基(细菌为LB，真菌为YPD)表面直接垂直放上4～6支牛津杯，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，

2)在杯中加入待检测U-19-3发酵液(离心取上清)，一般可以装200μL，勿使其外溢。

3)加满后置37℃(细菌)或28℃(真菌)培养2～3d，观察结果，用尺子量抑菌圈直径。

(2)纸片扩散法

1)取较厚的平整滤纸，用打孔器制作直径为6mm的滤纸片，将无菌滤纸片均匀放置于生物检定平板中，每板4～8个均可。

2)取10μL U-19-3发酵液(离心取上清)置于在生物检定平板中的滤纸片上，将生物检定平板先置于4℃冰箱中1～2h。培养并观察测量抑菌圈直径。

表1 U-19-3对供试菌株的抑菌直径

4、形态学特征观察

U-19-3在培养基上28℃条件下培养2～3周后，通过光学显微镜观察菌丝体形态。参照国际链霉菌规划(International Streptomyces Projects，ISP)的标准方法，采用的标准培养基进行，在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、营养琼脂、察氏琼脂、马铃薯琼脂七种典型的放线菌培养基进行培养，观察培养过程中菌落形态、菌丝的变化。

表2菌株U-19-3的形态特征

5、生理生化实验

内容包括：明胶液化、牛奶凝固与胨化、淀粉水解、硫化氢产生和碳源利用实验，其中碳源有葡萄糖、果糖、木糖、鼠李糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、棉子糖和肌醇。

表3 U-19-3生理生化特征

6、16S rDNA序列测定和系统进化树构建

提取海洋放线菌U-19-3基因组DNA，采用细菌通用引物扩增16S rDNA并纯化测序，测序结果通过NCBI的Blastn程序进行同源性比较，采用MEGA5.1软件，用Neighbor-Joining法建立系统发育树。通过序列分析，并结合其形态特征和生理生化特征,可以将菌株U-19-3初步分类为小单孢菌，micromonospora sp。7、PKS I和PKS II基因的扩增

利用简并引物对PKS I和PKS II基因进行扩增，得到的片段纯化后，进行转化实验并测序，测序结果通过NCBI的Blastp程序进行同源性比较，采用MEGA5.1软件，用Neighbor-Joining法建立系统发育树。通过序列分析，发现菌株U-19-3的Ⅰ型聚酮合酶序列与Micromonospora subsp.carbonacea Luedemann and Brodsky 1965(炭样小单孢菌)的Ⅰ型聚酮合酶序列(NCBI Reference Sequence:WP_043962713.1)最为接近，二者相似度高达94％。菌株U-19-3的Ⅱ型聚酮合酶与Frankia sp.EI5c(NCBI Reference Sequence:OAA20009.1)和Frankia sp.DSM 45899(NCBI Reference Sequence:CUU53565.1)的minimal PKS ketosynthase(KS/KS alpha)最为接近。