一株促进毛叶苕子增长的根瘤菌及其应用

摘要

本发明公开了一株促进毛叶苕子增长的豌豆根瘤菌及其应用。该豌豆根瘤菌的菌株号为m1‑10‑3，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No.11877。实验证明，毛叶苕子接种豌豆根瘤菌m1‑10‑3后植株高度、植株鲜重比不接菌对照、接种豌豆根瘤菌H10和豌豆根瘤菌ACCC16505的植株高度、植株鲜重相比均显著增加。本发明在毛叶苕子种植业中具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及农业微生物领域中一株促进毛叶苕子增长的根瘤菌及其应用。

背景技术

毛叶苕子(Vicia villosa Roth，也称毛叶紫花苕子，简称毛苕)是一种优质的绿肥作物，主要分布在我国黄河、淮河、海河流域一带，近些年辽年、内蒙、新疆等地也有播种，栽种面积较大。毛叶苕子的抗寒能力较强，一般品种能耐短时间零下20℃的低温，并且幼苗的越冬率很高，同时毛叶苕子耐旱和耐贫瘠性也很强，一般在较贫瘠的土壤上种植，也能收到较高的产量，适应性较广。

为培肥地力，确保农业持续稳定发展，农业部决定从1995年夏季开始在全国实施以积造有机肥为主要内容的“沃土计划”，即是绿肥作物又是豆科作物的毛叶苕子种植面积在不断增加。豆科根瘤菌的研究和应用在世界范围内已有一百多年历史，几乎在全世界范围内都提倡对豆科作物进行根瘤菌接种。

氮素是植物生长中最重要的营养元素之一，根瘤菌是一类能侵染豆科植物根部(少数是茎部)形成根瘤进行生物固氮的细菌，根瘤菌与豆科植物共生体系是生物固氮中作用最强的体系，土壤中的固氮微生物将空气中的氮气转化为植物可吸收的氨，所固定的氮约为生物固氮总量的65％。当前，在退化土壤中种植豆科植物越来越受到人们的关注，因为退化土壤中氮素营养比较贫乏，通过豆科植物与根瘤菌的共生固氮作用可以提高土壤肥力，接种根瘤菌能够提高豆科植物的产量和氮储藏量。如果种植的豆科植物没有相应的高效根瘤菌株与之共生结瘤并固定空气中的氮素，它们将完全依赖土壤中的结合态氮，不但不能补充反而会消耗土壤中的氮素，导致土壤肥力下降。因此，为了充分发挥根瘤菌与豆科植物的共生固氮作用，以维持土壤氮素平衡，需要筛选高效菌株进行人工接种。开发和利用豆科植物与根瘤菌共生固氮效应的潜力很大。在生物固氮过程中，依据根瘤菌对寄主植物的专一性，把适于同一种根瘤菌结瘤固氮的植物列为一族，根瘤菌在族内各植物间可以转接，称为互接种族。毛叶苕子和豌豆在根瘤菌应用上是互接种族，豌豆根瘤菌既可以接种不同毛叶苕子也可以接种不同品种豌豆，但是接种效果差异较大。

有数据表明在不同绿肥种类间，毛叶苕子的固氮强度是最高的。同时毛叶苕子的改土培肥作用和压青、茬地的增产效应都是非常显著的。近十年来，我国毛叶苕子种植面积不断扩大，毛叶苕子的栽培和利用技术逐渐提高，毛叶苕子接种根瘤菌技术的研究和应用被加大重视。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何显著促进毛叶苕子增长。

为了解决以上技术问题，本发明提供了一株根瘤菌。

本发明所提供的根瘤菌是豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)，其菌株号为m1-10-3，该菌株已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11877，以下简称为豌豆根瘤菌m1-10-3。

豌豆根瘤菌m1-10-3属革兰氏染色阴性，短小杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.8)×(1.1-2.9)微米。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形凸起，边缘整齐，较湿润表面光滑，质地均一，浅乳白色，菌苔粘稠。豌豆根瘤菌m1-10-3具有序列表中序列1的16S rDNA序列。

为了解决以上技术问题，本发明还提供了促进毛叶苕子生长的菌剂。

本发明所提供的促进毛叶苕子生长的菌剂，含有豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代谢物。

所述促进毛叶苕子生长的菌剂具体可为提高毛叶苕子单株重量和/或提高毛叶苕子株高的菌剂。所述毛叶苕子单株重量是指毛叶苕子单株的地上部分和地下部分重量之和。

上述菌剂的活性成分可为豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代谢物，上述菌剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述菌剂的其他活性成分本领域技术人员可根据菌剂对毛叶苕子植株重量和/或植株高度促进效果确定。所述菌剂还可包括载体。所述载体可为固体载体或液体载体。所述固体载体为矿物材料、生物材料；所述矿物材料可为草炭、粘土、滑石、高岭土、蒙脱石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一种；所述生物材料为各类作物的秸秆、松壳、稻草、花生壳、玉米粉、豆粉、淀粉、草炭和动物的粪便中的至少一种；所述液体载体可为水；所述菌剂中，豌豆根瘤菌m1-10-3或/和豌豆根瘤菌m1-10-3的代谢物可以以被培养的活细胞、活细胞的发酵液、细胞培养物的滤液或细胞与滤液的混合物的形式存在。所述菌剂的剂型可为多种剂型，如液剂、乳剂、悬浮剂、粉剂、颗粒剂、可湿性粉剂或水分散粒剂。

其中，豌豆根瘤菌m1-10-3的代谢物是将豌豆根瘤菌m1-10-3在微生物液体发酵培养基中培养得到的物质。

根据需要，所述菌剂中还可添加表面活性剂(如吐温20、吐温80等)、粘合剂、稳定剂(如抗氧化剂)、pH调节剂等。

豌豆根瘤菌m1-10-3或所述促进毛叶苕子生长的菌剂在制备促进毛叶苕子生长的产品中的应用和在促进毛叶苕子生长中的应用均属于本发明的保护范围。

上述应用中，所述促进毛叶苕子生长可为提高毛叶苕子单株重量和/或提高毛叶苕子株高。

上述应用中，所述促进毛叶苕子生长的产品可为促进毛叶苕子生长的菌剂或含有所述促进毛叶苕子生长的菌剂的生物肥料。

本申请中，所述毛叶苕子可为土库曼毛苕、青海苕子、和/或青苕一号。

为了解决以上技术问题，本发明还提供了一种培养豌豆根瘤菌m1-10-3的方法。

本发明所提供的培养豌豆根瘤菌m1-10-3的方法，包括在用于培养根瘤菌的培养基中培养豌豆根瘤菌m1-10-3的步骤。

所述用于培养根瘤菌的培养基可按照如下方法配制：丙三醇3-5ml，甘露醇2-5g，酵母浸粉0.8-1g，K₂HPO₄>4>4·2H₂O>4)6Mo₇O₂₄·4H₂O>3BO₃>

实验证明，本发明的豌豆根瘤菌m1-10-3对毛叶苕子比豌豆根瘤菌H10和豌豆根瘤菌ACCC16505具有更显著的促进生长和增产效果。豌豆根瘤菌m1-10-3与毛叶苕子接种组合对毛叶苕子具有显著的增产效果，具有较高的实用性和可推广性，有望发展成为毛叶苕子根瘤菌应用领域中一项新的优良组合技术。本发明在毛叶苕子种植业中具有广阔的应用前景。

保藏说明

菌种名称：豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum

菌株编号：m1-10-3

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2015年12月14日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.11877

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)ACCC 16505于1990年4月1日收藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心(简称ACCC，地址：北京市海淀区中关村南大街12号，中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，邮编100081)，自该收藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中心获得该菌株。豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)ACCC 16505在下文中简称豌豆根瘤菌ACCC16505。

下述实施例中的固体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K₂HPO₄>4>4·2H₂O>4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O1ml、1％H₃BO₃>

下述实施例中的液体培养基的配制方法如下：丙三醇5ml，甘露醇5g，酵母浸粉1g，K₂HPO₄>4>4·2H₂O>4)₆Mo₇O₂₄·4H₂O1ml、1％H₃BO₃>

实施例1、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)m1-10-3CGMCC11877的分离及鉴定

1、菌株的分离

从青海省海东市平安区采集野生毛叶苕子根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株m1-10-3。

2、菌株的鉴定

2.1、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株m1-10-3进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株m1-10-3，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明菌株m1-10-3属革兰氏染色阴性，短小杆状，菌体染色不均匀，形成着色与不着色部分的环状体，不着色的部分脂类含量较高。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，能运动。菌体大小为(0.5-0.8)×(1.1-2.9)微米。在酵母汁甘露醇琼脂培养基平面上生长，菌落呈圆形凸起，边缘整齐，较湿润表面光滑，质地均一，浅乳白色，菌苔粘稠。

2.2、16S rDNA序列同源性分析

采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株m1-10-3的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株m1-10-3的16S rDNA具有序列表中序列1的核苷酸序列。菌株m1-10-3的rRNA基因片段与豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)菌株CCBAU 85022的16S rRNA基因部分序列(Sequence ID:EU256422.1)的相似性最高为99％。

2.3、生理生化特征鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株m1-10-3的生理生化特征。结果表明菌株m1-10-3为化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株m1-10-3鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)m1-10-3已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11877，以下简称为豌豆根瘤菌m1-10-3。

实施例2、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂的制备

1、豌豆根瘤菌m1-10-3的斜面培养

挑取实施例1的豌豆根瘤菌m1-10-3接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌m1-10-3。

2、菌种的活化

挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌m1-10-3，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养48小时，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌液。

3、种子罐培养

取3L步骤2的豌豆根瘤菌m1-10-3菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养56小时培养，得到豌豆根瘤菌m1-10-3种子液。

4、发酵罐培养

按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌m1-10-3种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养56小时，得到豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液，该豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液中豌豆根瘤菌m1-10-3的含量为30亿cfu/mL。

5、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂的制备

将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。

将步骤4的豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂中的豌豆根瘤菌m1-10-3的含量为2.0×10⁸cfu/克。

实施例3、豌豆根瘤菌m1-10-3接种毛叶苕子的水培试验

采用滤纸桥试管水培法。将滤纸裁成条状，制成M型，中间凹处根据幼苗的大小制成V型小孔，M型滤纸的高度为试管的长度减去4cm。所用试管为2.0cm×20cm。

将配制好的无氮营养液分别装入带有滤纸支撑物的试管中，其高度位于H型滤纸的凹处，每个处理重复4个试管，并设对照管4个，灌装后用耐高温高压的塑料薄膜封好后，15磅121℃灭菌1h备用。

选择大小均一的土库曼毛苕种子，用95％乙醇浸泡5min后用0.1％HgCl₂表面灭菌5min,再用无菌水冲洗10次。将消毒的种子置于28—30℃温箱中保温催芽。光照要求从顶部照射，根部避光，可放置温室或光照箱中，光照照强度约7000lux—8000lux；温度：25—30℃；催芽长度为0.8-1.5cm。

实验设不接菌对照处理和豌豆根瘤菌m1-10-3处理。实验设三次重复，每次重复的实验方法如下：

豌豆根瘤菌m1-10-3处理：将10粒催芽成功的种子放入菌悬液(用液体培养基稀释实施例2步骤4的豌豆根瘤菌m1-10-3发酵液至豌豆根瘤菌m1-10-3的含量为2.0×10⁷cfu/mL得到菌悬液)中浸泡30min,用无菌的镊子小心夹出种子放入水培液试管的滤纸桥中固定好播种，将菌悬液平均吸入试管中。封口后于光照箱中光照培养，光照从顶部照射，光照时间14h/10h，根部避光，光照强度为7000lux—8000lux；温度：25—30℃。

不接菌对照处理：与豌豆根瘤菌m1-10-3处理的区别仅在于将菌悬液替换为液体培养基，其他操作完全相同。

表1、土库曼毛苕接种豌豆根瘤菌m1-10-3水培试验结果

结果如表1所示，表明将豌豆根瘤菌m1-10-3接种土库曼毛苕后，植株高度、植株根长、植株鲜重和植株干重比不接菌对照分别增长32.56％、18.01％、19.32％和47.62％，表明本发明的可接种毛叶苕子的豌豆根瘤菌m1-10-3具有显著的促生长效果。

对比例1、豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)H10CGMCC No.11878的分离及鉴定

1、菌株的分离

从青海省乐都县采集野生豌豆根瘤，用平板(取甘露醇10g，酵母浸粉1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸钙0.2g，硫酸镁0.2g，氯化钠0.1g，质量含量为1％的钼酸铵水溶液1ml和质量含量为1％的硼酸水溶液1ml，0.5％刚果红1ml，20g琼脂，用水定容至1L，pH值为6.8-7.0)划线分离得到菌株H10。

2、菌株的鉴定

2.1、形态学鉴定

将处于对数生长期，且菌落大小稳定，上述步骤1分离并纯化得到的菌株H10进行单菌落状态描述，主要包括菌落的大小、颜色、透明度、湿润度、菌落表面状态、菌落边缘状态。另一方面，对处于对数生长期的菌株H10，经涂片染色后采用光学显微镜观察菌体的形态。

结果表明菌株H10属革兰氏染色阴性，小短杆状，菌体大小为0.5～0.9微米×1.2～6.0微米，在不同环境中生长的菌体形态不同。一般含有聚-β-羟基丁酸盐颗粒。无芽孢，具端生鞭毛或周生鞭毛，运动，好氧。最适生长温度25～30℃，最适pH6.0～7.0。菌落呈圆形，边缘整齐，微凸起，无色半透明或浅乳白色，粘稠。在酵母汁甘露醇无机盐琼脂培养基平板上生长3-6天后直径2～4mm。在含糖培养基上的生长物常伴有丰富的胞外粘液。

2.2、16S rDNA序列同源性分析

采用菌落PCR方法扩增步骤1所得的菌株H10的16S rDNA片段，相关试剂由全式金公司提供。对16S rRNA基因片段进行扩增并克隆测序的结果表明，菌株H10的16S rDNA具有序列表中序列2的核苷酸序列。菌株H10的16S rDNA与豌豆根瘤菌Rhizobium leguminosarum strain INTA D156的16S rRNA基因(Sequence ID:KX066064.1)的相似性最高为99％。

2.3、生理生化特征鉴定

参考《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社，2011.)和《微生物学实验》(沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)测定菌株H10的生理生化特征。结果表明菌株H10是化能异养型，能利用各种碳水化合物和有机酸的盐类作为碳源，如能利用葡萄糖、乳糖、D-核糖、D-纤维二糖、D-阿拉伯糖、甘露醇、木糖、D-半乳糖、果糖、卫矛醇和肌醇；能利用铵盐、硝酸盐和多数氨基酸可作为氮源；刚果红吸色反应微吸色；石蕊牛奶反应不凝结，不产酸；不能利用纤维素和淀粉；不能水解酪素；不利用3-酮基乳糖；从甘露醇产酸；在含糖培养基上生长常伴有丰富的胞外粘液；不产生硫化氢；不在甘油磷酸钙培养基产生沉淀。

鉴于上述形态、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1分离纯化得到的菌株H10鉴定为豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)。该豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)H10已于2015年12月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.11878，以下简称为豌豆根瘤菌H10。豌豆根瘤菌H10已于2016年11月28日由本申请的申请人提出中国发明专利申请，申请号为201611072530.2。

对比例2、豌豆根瘤菌H10菌剂的制备

1、豌豆根瘤菌H10的斜面培养

挑取对比例1的豌豆根瘤菌H10接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌H10。

2、菌种的活化

挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌H10，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养72小时，得到豌豆根瘤菌H10菌液。

3、种子罐培养

取3L步骤2的豌豆根瘤菌H10菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60小时培养，得到豌豆根瘤菌H10种子液。

4、发酵罐培养

按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌H10种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60小时，得到豌豆根瘤菌H10发酵液，该豌豆根瘤菌H10发酵液中豌豆根瘤菌H10的含量为30亿cfu/mL。

5、豌豆根瘤菌H10菌剂的制备

将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。

将步骤4的豌豆根瘤菌H10发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌H10菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌H10菌剂中的豌豆根瘤菌H10的含量为2.0×10⁸cfu/克。

对比例3、豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂的制备

1、豌豆根瘤菌ACCC16505的斜面培养

挑取豌豆根瘤菌ACCC16505接种于固体培养基进行斜面培养，在28℃下培养56小时，得到斜面培养的豌豆根瘤菌ACCC16505。

2、菌种的活化

挑取步骤1斜面培养的豌豆根瘤菌ACCC16505，将其接种于500mL液体培养基中，在28℃下培养72小时，得到豌豆根瘤菌ACCC16505菌液。

3、种子罐培养

取3L步骤2的豌豆根瘤菌ACCC16505菌液，将其接入100L种子罐中(含有60L液体培养基)进行种子培养，在30℃、120rpm下振荡培养60小时培养，得到豌豆根瘤菌ACCC16505种子液。

4、发酵罐培养

按10％比例(体积比)将步骤3的豌豆根瘤菌ACCC16505种子液接入1000L发酵罐中(含有600L液体培养基)进行发酵培养，在28℃、150rpm下振荡培养60小时，得到豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液，该豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液中豌豆根瘤菌ACCC16505的含量为30亿cfu/mL。

5、豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂的制备

将草炭自然干燥后进行粉碎，过100目筛，然后用石灰水调pH值为6.8，在121℃灭菌60min，得到无菌草炭。

将步骤4的豌豆根瘤菌ACCC16505发酵液与该无菌草炭混匀，再在28℃条件下增殖培养48h，得到豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂，分装入库。经检测成品合格，该豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂中的豌豆根瘤菌ACCC16505的含量为2.0×10⁸cfu/克。

实施例4、豌豆根瘤菌m1-10-3与豌豆根瘤菌H10和豌豆根瘤菌ACCC16505接种毛叶苕子品种的效果比较试验

选择土库曼毛苕、青海苕子和青苕一号这三个毛叶苕子品种进行促进生长实验。

本试验采用随机区组设计，随机设置12个处理区，每个处理区设三个小区重复。12个处理区分别为m1-10-3-青海苕子处理区、m1-10-3-土库曼毛苕处理区和m1-10-3-青苕一号处理区这三个豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理区，H10-青海苕子处理区、H10-土库曼毛苕处理区和H10-青苕一号处理区这三个豌豆根瘤菌H10菌剂处理区，ACCC16505-青海苕子处理区、ACCC16505-土库曼毛苕处理区和ACCC16505-青苕一号处理区这三个豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理区，对照-青海苕子处理区、对照-土库曼毛苕处理区和对照-青苕一号处理区这三个不接菌对照处理区。

每个小区大小为4㎡,土壤pH8.3，土著根瘤菌平均数量2.0×10²cfu/g干土。按照毛叶苕子播种量为7.5kg/hm²准备种子。

m1-10-3-青海苕子处理区、m1-10-3-土库曼毛苕处理区、m1-10-3-青苕一号处理区分别播种m1-10-3-青海苕子种子、m1-10-3-土库曼毛苕种子、m1-10-3-青苕一号种子(将实施例2的豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂分别和青海苕子种子、土库曼毛苕种子和青苕一号种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为m1-10-3-青海苕子种子、m1-10-3-土库曼毛苕种子、m1-10-3-青苕一号种子)。

H10-青海苕子处理区、H10-土库曼毛苕处理区、H10-青苕一号处理区分别播种H10-青海苕子种子、H10-土库曼毛苕种子、H10-青苕一号种子(将对比例2的豌豆根瘤菌H10菌剂分别和青海苕子种子、土库曼毛苕种子和青苕一号种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为H10-青海苕子种子、H10-土库曼毛苕种子、H10-青苕一号种子)。

ACCC16505-青海苕子处理区、ACCC16505-土库曼毛苕处理区、ACCC16505-青苕一号处理区分别播种ACCC16505-青海苕子种子、ACCC16505-土库曼毛苕种子、ACCC16505-青苕一号种子(将对比例3的豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂分别和青海苕子种子、土库曼毛苕种子和青苕一号种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为ACCC16505-青海苕子种子、ACCC16505-土库曼毛苕种子、ACCC16505-青苕一号种子)。

对照-青海苕子处理区、对照-土库曼毛苕处理区、对照-青苕一号处理区分别播种CK-青海苕子种子、CK-土库曼毛苕种子和CK-青苕一号种子(将实施例2中的无菌草炭分别和青海苕子种子、土库曼毛苕种子和青苕一号种子均按照1：10的质量比混合、拌匀得到的种子分别称为CK-青海苕子种子、CK-土库曼毛苕种子和CK-青苕一号种子)。

将上述种子按照小区设计均匀播种到土壤中，播种方法为条播，行距为10cm。上述各处理区除所播种的种子不同外，其他条件完全相同。播种后在相同条件下培养至开花期，记录各处理区各个植株地上部分高度(植株高度)、地上部分鲜重和地下部分鲜重得到植株鲜重(地上部分鲜重和地下部分鲜重之和)，并计算出各组的平均值，分别得到植株平均高度、植株平均鲜重。

表2、各处理区的植株平均高度和植株平均鲜重

表3、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂和豌豆根瘤菌H10菌剂的促生长比较效果

注：m1-10-3表示豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理区，H10表示豌豆根瘤菌H10菌剂处理区，ACCC16505表示豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理区，对照表示不接菌对照处理区。

结果如表2和表3所示，表明：

1、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的土库曼毛苕与不接菌对照处理的土库曼毛苕相比，株高增加了62.36％，植株鲜重增加了98.39％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青海苕子与不接菌对照处理的青海苕子相比，株高增加了45.05％，植株鲜重增加了6.68％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青苕一号与不接菌对照处理的青苕一号相比，株高增加了56.07％，植株鲜重增加了14.22％；

2、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的土库曼毛苕与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理的土库曼毛苕相比，株高增加了51.36％，植株鲜重增加了55.55％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青海苕子与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理的青海苕子相比，株高增加了19.89％，植株鲜重增加了-8.41％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青苕一号与豌豆根瘤菌ACCC16505菌剂处理的青苕一号相比，株高增加了40.10％，植株鲜重增加了53.33％；

3、豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的土库曼毛苕与豌豆根瘤菌H10菌剂处理的土库曼毛苕相比，株高增加了36.69％，植株鲜重增加了32.34％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青海苕子与豌豆根瘤菌H10菌剂处理的青海苕子相比，株高增加了2.14％，植株鲜重增加了4.96％；豌豆根瘤菌m1-10-3菌剂处理的青苕一号与豌豆根瘤菌H10菌剂处理的青苕一号相比，株高增加了4.72％，植株鲜重增加了6.03％。

上述结果表明本发明的豌豆根瘤菌m1-10-3对毛叶苕子比豌豆根瘤菌H10和豌豆根瘤菌ACCC16505具有更显著的促进生长和增产效果。

<110> 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所

<120> 一株促进毛叶苕子增长的根瘤菌及其应用

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1364

<212> DNA

<213> 豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)

<400> 1

tgcgctacca tgcaagtcga gcgcgtagca atacgagcgg cagacgggtg agtaacgcgt 60

gggaatctac ccttgactac ggaataacgc agggaaactt gtgctaatac cgtatgtgtc 120

cttcgggaga aagatttatc ggtcaaggat gagcccgcgt tggattagct agttggtggg 180

gtaaaggcct accaaggcga cgatccatag ctggtctgag aggatgatca gccacattgg 240

gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc 300

gcaagcctga tccagccatg ccgcgtgagt gatgaaggcc ctagggttgt aaagctcttt 360

caccggagaa gataatgacg gtatccggag aagaagcccc ggctaacttc gtgccagcag 420

ccgcggtaat acgaaggggg ctagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gcgcacgtag 480

gcggatcgat cagtcagggg tgaaatccca gggctcaacc ctggaactgc ctttgatact 540

gtcgatctgg agtatggaag aggtgagtgg aattccgagt gtagaggtga aattcgtaga 600

tattcggagg aacaccagtg gcgaaggcgg ctcactggtc cattactgac gctgaggtgc 660

gaaagcgtgg ggagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacgatgaat 720

gttagccgtc gggcagtata ctgttcggtg gcgcagctaa cgcattaaac attccgcctg 780

gggagtacgg tcgcaagatt aaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 840

agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgca gaaccttacc agcccttgac atgcccggct 900

acttgcagag atgcaaggtt cccttcgggg accgggacac aggtgctgca tggctgtcgt 960

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct cgcccttagt 1020

tgccagcatt gagttgggca ctctaagggg actgccggtg ataagccgag aggaaggtgg 1080

ggatgacgtc aagtcctcat ggcccttacg ggctgggcta cacacgtgct acaatggtgg 1140

tgacagtggg cagcgagcac gcgagtgtga gctaatctcc aaaagccatc tcagttcgga 1200

ttgcactctg caactcgagt gcatgaagtt ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1260

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccatgg gagttggttt 1320

tacccgaagg tagtgcgcta accgcaagga ggcagcaacc gcga 1364