公开/公告号CN107148574A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-09-08
原文格式PDF
申请/专利权人 思芬构技术有限公司;
申请/专利号CN201580053033.5
发明设计人 安德烈亚斯·贝格曼;奥勒·米兰德;梁·恩;
申请日2015-10-01
分类号
代理机构中原信达知识产权代理有限责任公司;
代理人金海霞
地址 德国亨利希斯多夫
入库时间 2023-06-19 03:14:54
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2020-04-10
授权
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2017-10-10
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N33/68 申请日:20151001
实质审查的生效
2017-09-08
公开
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本发明的主题内容是一种确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂))或HMG-CoA还原酶抑制剂(他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险的方法，所述方法包括下列步骤：
·确定所述受试者的血液样品中hGH和/或其同工型的水平，以及
·将所述血液样品中确定的hGH和/或其同工型的水平与预先确定的阈值进行比较，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险。
将生物标志物用于患有心血管疾病或处于发生心血管疾病的风险下的患者的分层以便进行成功的药理干预，在原理上是已知的。然而，到目前为止，这局限于与血管活性或炎性活性相关的生物标志物，例如在下述文献中所描述的：WO/2010/128071；RichardsAM等，Australia-New Zealand Heart Failure Group.Journal of the AmericanCollege of Cardiology 2001,37(7):1781-1787；Ridker等，The New England journalof medicine 2008,359(21):2195-2207。
人生长激素(hGH)从未在这种背景下被描述过。在WO/2014/108396中，仅仅知道在正常群体(特别是男性)中相对高的血浆hGH水平与发生偶发不良心脏事件的风险提高有关。
在这里，我们描述了受试者中高的血浆hGH和/或其同工型水平与使用高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的疗法的成功相关，而这种疗法在具有相对低的血浆hGH和/或其同工型水平的患者中不太有效。因此，测量受试者中的hGH和/或其同工型适用于对患者进行分层以便进行药理治疗。
本发明的主题内容是一种确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险的方法，所述方法包括下列步骤：
·确定所述受试者的血液样品中hGH和/或其同工型的水平，以及
·将所述血液样品中确定的hGH和/或其同工型的水平与预先确定的阈值进行比较，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险。
在一个特定实施方式中，所述受试者不具有高血压(至少>140mmHG(收缩压)至90mmHG(舒张压))。
在一个特定实施方式中，所述受试者尚未使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)进行治疗。
在一个实施方式中，通过在受试者中降低血压来降低血管风险意味着在所述受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病。
在所述方法的一个特定实施方式中，所述受试者在最近2周内、优选地在最近一周内、优选地在最近36小时内患有急性心肌梗塞或急性心力衰竭。
在本发明的方法的一个特定实施方式中，所述受试者从未具有主要心血管事件并且从未患有任何心血管疾病。在本发明的方法的另一个特定实施方式中，所述受试者具有颈动脉斑块但是没有颈动脉疾病的症状。检测动脉粥样硬化疾病的存在并监测其消退、停止或进展的一种已确立的方法是测量内-中膜厚度(IMT)(de Groot等，Nature ReviewsCardiology 5,280-288(May 2008)|doi:10.1038/ncpcardio1163)。这是动脉壁的最靠内的两个层即内膜和中膜的厚度的测量。所述测量通常通过外部超声来进行，偶尔通过内部侵入性超声导管来进行。FDA已批准将IMT作为动脉粥样硬化疾病的替代标志应用于临床试验中。已将IMT的范围与心血管结果相关联，并将其随时间的变化(每年IMT的统计学显著的变化)与药物的效能相关联(de Groot等，Nature Reviews Cardiology 5,280-288(May2008)|doi:10.1038/ncpcardio1163；Hedblad等，Circulation.2001；103:1721-1726)。
所述主要心血管事件或心血管疾病可以选自心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压、心肌病、心肌梗塞和中风。
在本发明的一个实施方式中，所述受试者是男性。
在本发明的方法的一个实施方式中，所述方法被用于预防主要心血管事件或预防心血管疾病。
所述主要心血管事件可以选自心肌梗塞、急性心力衰竭、中风和心血管死亡。
所述血液样品可以选自全血、血清和血浆。
在本发明的一个实施方式中，所述血液样品是禁食样品。
禁食样品意味着从在采血之前至少8小时未消费任何食物或可溶性营养物的受试者抽取的样品。在特定实施方式中，这种禁食样品在受试者禁食至少8小时后，在7:00至11:30a,m.之间从所述受试者获取。
在另一个实施方式中，生长激素(hGH)的禁食水平意味着在样品获取之前12h没有摄入食物的禁食受试者的血液、血清或血浆中确定的生长激素(hGH)水平。在所述实施方式中，禁食受试者意味着在样品获取之前12h没有摄入食物的受试者。
当在本文中使用时，术语“受试者”是指活的人类或非人类生物体。在本文中，所述受试者优选为人类受试者。如果没有另外陈述，所述受试者可以是健康的或患病的。术语“高水平”意味着高于某个阈值水平的水平。
在本发明的一个特定实施方式中，用于确定hGH和/或其同工型的水平的测量方法或测定法具有足以以不超过20％的测定间CV定量来自于禁食、健康、优选至少40岁的男性的正常范围的下方第95百分位的分析灵敏度。这种测定法的实例描述在WO/2014/108396中。
测定灵敏度(assay sensitivity)可以由“分析”测定灵敏度来定义，其被定义为例如剥离hGH的样品的20次测定的信号中值处的hGH浓度(标准曲线读数)+2标准偏差(SD)。
或者，所述测定灵敏度可以由“功能”测定灵敏度来定义，其更多地反映出临床日常工作中的检测极限。所述功能测定灵敏度被定义为在具有不同hGH浓度的各个个体样品中血浆(患者样品)的测定间变动系数(CV)的确定。所述功能测定灵敏度是测定间CV小于20％的最低hGH浓度。
测定灵敏度可以取决于所使用的校准方法和所使用的hGH测定法。不同的hGH测定法可以检测不同组的hGH同工型，引起不同的定量结果，意味着取决于所使用的测定法和校准方法引起不同的阈值和灵敏度要求。
为了克服不同hGH测定法的这种可能的不均一性，可以通过关联个体受试者的血浆hGH值来校正测定法校准值。如果关联曲线的斜率不是1，则可以通过差异系数来校正所述hGH值(校准值)，产生可比的校准值、可比的灵敏度分析和可比的阈值。
为了比较通过不同测定法获得的结果，可以进行上述校正。
在实施例1中描述的测定法主要识别hGH同工型1，并通过重组人生长激素(NIBSC编号98/574，National Institute for Biological Standards and Control，Herfordshire，UK)来校准。
在本发明的特定方法中，体液中的生长激素(hGH)和/或其同工型的所述禁食水平通过超灵敏测定法来确定，所述测定法具有小于100pg/ml、优选地小于50pg/ml、优选地小于30pg/ml、优选地小于20pg/ml、优选地小于10pg/ml、优选地小于5pg/ml、优选为2pg/ml的分析测定灵敏度(其被定义为剥离hGH的样品的20次测定的信号中值处的hGH浓度+2标准偏差(SD))。hGH的测量值以ng/ml为单位来表述(1ng/ml＝2.6mU/L)。
或者，所述超灵敏测定法具有小于400pg/ml、优选地小于200pg/ml、优选地小于120pg/ml、优选地小于80pg/ml、优选地小于40pg/ml、优选地小于20pg/ml、优选为10pg/ml、最优选地小于8.5pg/ml的功能测定灵敏度(参见上文)。hGH的测量值以ng/ml为单位来表述。
所述测定法可以是免疫测定法或另一种检测方法，例如质谱法。
对于免疫接种和校准来说，我们使用重组人生长激素(NIBSC编号98/574，National Institute for Biological Standards and Control，Herfordshire，UK)。
在本发明的一个实施方式中，所述测定法如实施例1中所述来进行。
所述测定法可能选择性针对一种特定的hGH同工型，或者可能特异性针对并确定所述体液中选自hGH同工型1、同工型2、同工型3和同工型4(参见SEQ ID NO.1-4)的超过一种或所有的分泌的hGH异构体。
生长激素(hGH)的同工型可以选自hGH同工型1(22KD)、hGH同工型2、hGH同工型3和hGH同工型4。
所述同工型的序列：
SEQ ID NO.1：hGH同工型1(22KD)
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO.2：hGH同工型2
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO.3：hGH同工型3
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
SEQ ID NO.4：hGH同工型4
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF
在本发明的一个特定实施方式中，所述用于确定hGH和/或其同工型的水平的测量方法是测定灵敏度为至少50pg/ml的测定法。
在本发明的一个特定实施方式中，所述用于确定hGH和/或其同工型的水平的测量方法是测定灵敏度为至少50pg/ml的免疫测定法。
在本发明的一个实施方式中，在所述受试者中所述预先确定的阈值高于330pg/ml，优选地高于1370pg/ml。在本发明的一个实施方式中，在最近2周内、优选地最近一周内、优选地最近36小时内患有急性心肌梗塞的受试者中，所述预先确定的阈值高于330pg/ml，优选地高于1370pg/ml。
在一个实施方式中，所述阈值可以如下所述预先确定：
·将从所述受试者获得的体液中的hGH和/或其同工型浓度与从具有与所述受试者可比的基线状况的随机选择的受试者群体中的一整套预先确定的样品获得体液中的hGH和/或其同工型水平的中值进行比较，
·将从所述受试者获得的体液中的hGH和/或其同工型浓度与从具有与所述受试者可比的基线状况的受试者群体中的一整套预先确定的样品获得体液中的hGH和/或其同工型水平的分位数进行比较，
·在Cox比例危险分析的基础上或使用风险指数计算例如NRI(净重新分类指数)或IDI(综合鉴别指数)进行计算。
本领域技术人员理解，预先确定的阈值必须在所使用的测定法、所使用的校准方法和其他因素的背景下看待。
本发明的主题内容是一种通过使用针对生长激素(hGH)和/或其同工型的结合物来确定生长激素(hGH)和/或其同工型的水平、优选为禁食水平的方法。
在本发明的一个实施方式中，所述结合物选自结合生长激素(hGH)和/或其同工型的抗体、抗体片段或非Ig支架。
在本发明的一个特定实施方式中，所使用的免疫测定法包含至少两种结合hGH和/或其同工型的抗体。
根据本发明，所述诊断结合物选自抗体例如IgG这种典型的全长免疫球蛋白，或作为例如化学偶联的抗体的至少含有重链和/或轻链的F-可变结构域的抗体片段(抗原结合片段)，包括但不限于：Fab片段，包括Fab微抗体、单链Fab抗体、具有表位标签的单价Fab抗体例如Fab-V5Sx2；使用CH3结构域二聚化的二价Fab(微型抗体)；二价Fab或多价Fab，例如在异源结构域的协助下通过多聚化、例如通过dHLX结构域的二聚化所形成的，如Fab-dHLX-FSx2；F(ab’)2-片段，scFv片段，多聚化的多价或/和多特异性scFv片段，二价和/或双特异性双体，
在优选实施方式中，所述至少两种结合hGH和/或其同工型的抗体各自对hGH和/或其同工型具有至少107M-1、优选为108M-1的亲和性，优选地亲和性常数大于109M-1，最优选地大于1010M-1。本领域技术人员了解可以考虑通过使用较高剂量的化合物来补偿较低的亲和性，并且这种措施不会导致脱离本发明的范围。结合亲和性可以使用Biacore方法来确定，其在例如Biaffin,Kassel,Germany(http://www.biaffin.com/de/)作为分析服务被提供。
为了确定抗体的亲和性，使用Biacore 2000系统(GE Healthcare Europe GmbH,Freiburg,Germany)，利用无标记物表面等离子体共振来确定hGH与固定化抗体的结合的动力学。抗体的可逆固定化按照制造商的说明书(小鼠抗体捕获试剂盒；GE Healthcare)，使用以高密度共价偶联到CM5传感器表面的抗小鼠Fc抗体来进行{Lorenz等，靶向金黄色葡萄球菌的IsaA的功能性抗体增强宿主免疫应答并为抗细菌疗法开辟了新的前景(FunctionalAntibodies Targeting IsaA of Staphylococcus aureus Augment Host ImmuneResponse and Open New Perspectives for Antibacterial Therapy)，AntimicrobAgents Chemother.2011January；55(1):165–173}。
除了抗体之外，在本领域中公知其他的生物聚合物支架也络合靶分子，并且已被用于产生高度靶特异性的生物聚合物。实例是适体、镜像异构适配体(spiegelmer)、anticalin和芋螺毒素。非Ig支架可能是蛋白质支架，并且可用作抗体模拟物，因为它们能够结合配体或抗原。非Ig支架可以选自基于四连接素的非Ig支架(例如在US 2010/0028995中所描述的)、纤连蛋白支架(例如在EP 1266 025中所描述的)、基于脂钙蛋白的支架(例如在WO 2011/154420中所描述的)、遍在蛋白支架(例如在WO 2011/073214中所描述的)、转移支架(例如在US 2004/0023334中所描述的)、蛋白A支架(例如在EP 2231860中所描述的)、基于锚蛋白重复序列的支架(例如在WO 2010/060748中所描述的)、微型蛋白(microprotein)优选为形成胱氨酸结的微型蛋白支架(例如在EP 2314308中所描述的)、基于Fyn SH3结构域的支架(例如在WO 2011/023685中所描述的)、基于EGFR-A结构域的支架(例如在WO 2005/040229中所描述的)和基于Kunitz结构域的支架(例如在EP 1941867中所描述的)。
在本发明的一个实施方式中，它可能是所谓的POC(床旁)测试，这是一种允许在患者附近、在不到1小时内进行测试而不需要全自动测定系统的测试技术。这种技术的一个实例是免疫层析测试技术。
在本发明的一个实施方式中，这样的测定法是使用任何种类的检测技术的夹心免疫测定法，所述检测技术包括但不限于酶标记物、化学发光标记物、电化学发光标记物，优选为全自动测定法。在本发明的一个实施方式中，这样的测定法是酶标记的夹心测定法。自动或全自动测定法的实例包括可用于下述系统之一的测定法：Roche
各种不同的免疫测定法是已知的，并且可用于本发明的测定法和方法，它们包括：放射免疫测定法(“RIA”)，均相酶放大免疫测定法(“EMIT”)，酶联免疫吸附测定法(“ELISA”)、脱辅基酶复活免疫测定法(“ARIS”)、试纸免疫测定法和免疫层析测定法。
在本发明的一个实施方式中，所述两种结合物中的至少一者被标记以便检测。
优选的检测方法包括采取各种不同形式的免疫测定法，例如放射免疫测定法(RIA)、化学发光和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠子阵列、蛋白质微阵列测定法和快速测试形式例如免疫层析试条测试。
在优选实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。
所述测定法可以是均相或非均相测定法、竞争和非竞争测定法。在一个实施方式中，所述测定法采取夹心测定法的形式，这是一种非竞争性免疫测定法，其中将待检测和/或定量的分子结合到第一抗体并结合到第二抗体。所述第一抗体可以被结合到固相例如珠子、孔或其他容器的表面、芯片或试条，并且所述第二抗体是例如用染料、放射性同位素、反应性或催化活性组成部分标记的抗体。然后通过适合的方法测量结合到所述被分析物的标记的抗体的量。使用“夹心测定法”所涉及的通用组合物和程序是已确立的，并且为专业技术人员公知{Ludvigsson J,Andersson E,Ekbom A,Feychting M,Kim J-L,Reuterwall C等，瑞典国家住院患者登记的外部审查和验证(External review and validation of theSwedish national inpatient register)，BMC Public Health.2011；11(1):450}。
在另一个实施方式中，所述测定法包含两种捕获分子、优选为抗体，两者都作为分散系存在于液体反应混合物中，其中第一标记组分被附连到所述第一捕获分子，其中所述第一标记组分是基于荧光或化学发光-淬灭或扩增的标记体系的一部分，并且所述标记体系的第二标记组分被附连到所述第二捕获分子，使得在两种捕获分子结合到所述被分析物后产生可测量的信号，允许检测包含所述样品的溶液中形成的夹心复合物。
在另一个实施方式中，所述标记体系包含稀土穴状化合物或稀土螯合物与荧光染料或化学发光染料、特别是花青素类型的染料的组合。
在本发明的情形中，基于荧光的测定法包括使用染料，所述染料可以例如选自FAM(5-或6-羧基萤光素)，VIC，NED，萤光素，萤光素异硫氰酸酯(FITC)，IRD-700/800，花青素染料例如CY3、CY5、CY3.5、CY5.5、Cy7，呫吨，6-羧基-2’,4’,7’,4,7-六氯萤光素(HEX)，TET，6-羧基-4’,5’-二氯-2’,7’-二甲氧基萤光素(JOE)，N,N,N’,N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)，6-羧基-X-罗丹明(ROX)，5-羧基罗丹明-6G(R6G5)，6-羧基罗丹明-6G(RG6)，罗丹明，罗丹明绿，罗丹明红，罗丹明110，BODIPY染料例如BODIPY TMR，俄勒冈绿，香豆素类例如伞形酮，苯甲酰亚胺类例如Hoechst 33258，菲啶类例如德克萨斯红，雅吉瓦黄，AlexaFluor，PET，溴化乙锭，吖啶类染料，咔唑染料，吩噁嗪染料，卟啉染料，聚甲炔染料等。
在本发明的情形中，基于化学发光的测定法包括使用基于在下述文献中为化学发光材料所描述的物理原理的染料：{D'Agostino RB,Sr.,Vasan RS,Pencina MJ,Wolf PA,Cobain M,Massaro JM等，用于初级护理的总体心血管风险分布情况：弗雷明汉心脏研究(General cardiovascular risk profile for use in primary care:the FraminghamHeart Study)，Circulation.2008；117(6):743-53.Epub 2008/01/24}。优选的化学发光染料是吖啶酯类。
正如在本文中提到的，“测定法”或“诊断测定法”可以是在诊断学领域中应用的任何类型的测定法。这种测定法可能是基于待检测的被分析物与一种或多种捕获探针的具有一定亲和性的结合。考虑到捕获分子与靶分子或感兴趣的分子之间的相互作用，亲和性常数优选地大于108M-1。
在本发明的情形中，“结合物分子”是可用于结合来自于样品的靶分子或感兴趣的分子、即被分析物(即在本发明的情形中是hGH和/或其异构体)的分子。因此，结合物必须在空间上和表面特点例如表面电荷、疏水性、亲水性、路易斯供体和/或受体的存在或不存在两方面充分塑造，以特异性结合靶分子或感兴趣的分子。因此，所述结合可以例如由捕获分子与靶分子或感兴趣的分子之间的离子、范德华、π-π、σ-π、疏水或氢键相互作用或上述相互作用中的两者或更多者的组合来介导。在本发明的情形中，结合物分子可以例如选自核酸分子、糖类分子、PNA分子、蛋白质、抗体、肽或糖蛋白。优选地，所述结合物分子是抗体，包括其对靶分子或感兴趣的分子具有足够亲和性的片段，并包括重组抗体或重组抗体片段，以及所述抗体的化学和/或生物化学修饰的衍生物或其源自于所述变体链的长度为至少12个氨基酸的片段。
化学发光标记物可以是吖啶酯标记物、甾类标记物包括异鲁米诺标记物等。
酶标记物可以是乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CPK)、碱性磷酸酶、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、酸性磷酸酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶等。
在本发明的一个实施方式中，所述两种结合物中的至少一者被结合到固相例如磁珠和聚苯乙烯表面。
在本发明的用于确定样品中生长激素(hGH)和/或其同工型的水平的测定法的一个实施方式中，这种测定法是夹心测定法，优选为全自动测定法。它可以是全自动或手动的ELISA。它可以是所谓的POC(床旁)测试。自动或全自动测定法的实例包括可用于下列系统之一的测定法：Roche
在本发明的用于确定样品中生长激素(hGH)和/或其同工型的水平的测定法的一个实施方式中，所述两种结合物中的至少一者被标记以便检测。标记物的实例在上文中提供。
在本发明的用于确定样品中生长激素(hGH)和/或其同工型的水平的测定法的一个实施方式中，所述两种结合物中的至少一者被结合到固相。固相的实例在上文中提供。
在本发明的用于确定样品中生长激素(hGH)和/或其同工型的水平的测定法的一个实施方式中，所述标记物选自化学发光标记物、酶标记物、荧光标记物、放射性碘标记物。
本发明的另一个主题是一种包含本发明的测定法的工具包，其中所述测定法的组分可以被包含在一个或多个容器中。
在本发明的一个实施方式中，hGH和/或其同工型的水平通过质谱法来确定。
在一个特定实施方式中，根据本发明的所述方法被用于监测所述受试者的血管风险。因此，本发明的主题内容还包括至少两次、优选地每年确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险的方法，所述方法包括下列步骤：
·确定所述受试者的血液样品中hGH和/或其同工型的水平，以及
·将所述血液样品中确定的hGH和/或其同工型的水平与预先确定的阈值进行比较，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险。
在所述监测方法中，上面提到的方法步骤每年至少进行一次。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的方法还可以包括：
·推荐向确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值并且被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，或
·推荐对确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值并且被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者不给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)。
在本发明的一个实施方式中，根据本发明的方法还可以包括：
·向确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值并且被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，或者
·对确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值并且被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者不给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)。
在本发明的一个实施方式中，所述高血压药物选自血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)、他汀类药物及其组合，以及与其他药物例如利尿药的组合。
在本发明的一个实施方式中，所述血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)选自贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、美西普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、群多普利和佐芬普利。
在本发明的一个实施方式中，所述血管紧张肽受体阻断剂(ARB)选自阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、坎地沙坦、坎地沙坦西来替昔酯、依普沙坦、非马沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、米法沙坦、奥美沙坦、泊米沙坦、普拉沙坦、利匹沙坦、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦和缬沙坦。
在本发明的一个实施方式中，所述β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)选自阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、奈必洛尔、艾司洛尔、倍他洛尔、醋丁洛尔、塞利洛尔、普萘洛尔、布拉洛尔、噻吗洛尔、卡维地洛、索他洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、氧烯洛尔、阿普洛尔和卡替洛尔。
在本发明的一个实施方式中，所述他汀类药物选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀和美伐他汀(康帕定)及其组合，以及与其他药物的组合。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，并且其中所述受试者不具有高血压。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，并且其中所述受试者不具有高血压，并且其中所述血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)选自贝那普利、卡托普利、西拉普利、依那普利、福辛普利、咪达普利、赖诺普利、美西普利、培哚普利、喹那普利、雷米普利、螺普利、群多普利和佐芬普利。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，并且其中所述受试者不具有高血压，并且其中所述血管紧张肽受体阻断剂(ARB)选自阿齐沙坦、阿齐沙坦酯、坎地沙坦、坎地沙坦西来替昔酯、依普沙坦、非马沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、米法沙坦、奥美沙坦、泊米沙坦、普拉沙坦、利匹沙坦、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦和缬沙坦。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，并且其中所述受试者不具有高血压，并且其中所述他汀类药物选自阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、西立伐他汀和美伐他汀(康帕定)。
本发明的主题内容是一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照本发明的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，并且其中所述受试者不具有高血压，并且其中所述β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)选自阿替洛尔、比索洛尔、美托洛尔、奈必洛尔、艾司洛尔、倍他洛尔、醋丁洛尔、塞利洛尔、普萘洛尔、布拉洛尔、噻吗洛尔、卡维地洛、索他洛尔、纳多洛尔、吲哚洛尔、氧烯洛尔、阿普洛尔和卡替洛尔。
大多数上述活性化合物可以以不同的盐形式配制。当使用常用程序时，可以获得可药用盐。因此，主题内容还包括上述活性化合物的所有可药用盐。
这些盐形式可以是常见的碱和酸加成盐，其从使用相应的有机或无机酸的转化来获得。形成所述活性化合物的盐的酸包括硫酸、磺酸、磷酸、亚硝酸、硝酸、高氯酸、氢溴酸、盐酸、甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、草酸、葡萄糖醛酸(采取左旋和右旋形式)、乳酸、苹果酸、酒石酸、羟基丙二酸、延胡索酸、柠檬酸、抗坏血酸、马来酸、丙二酸、羟基马来酸、丙酮酸、苯乙酸、(邻-、间-、对-)甲基苯甲酸、苯甲酸、对-氨基苯甲酸、水杨酸、对-氨基水杨酸、甲磺酸、乙磺酸、羟甲基磺酸、乙烯基磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、萘基氨基磺酸、磺胺酸、樟脑磺酸、奎尼酸、邻-甲基扁桃酸、苦味酸(2,4,6-三硝基苯酚)、己二酸、氨基酸例如甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸和特别是酸性氨基酸例如谷氨酰胺或天冬氨酸。
在所述活性化合物中存在酸取代基的情况下，也可以形成碱加成盐，特别是与碱金属以及与氨基酸。因此，碱金属盐例如钠盐、钾盐、锂盐或镁盐、钙盐、烷基氨基盐或与氨基酸形成的盐，例如与氨基酸例如赖氨酸碱形成的盐。
根据本发明的优选的特定盐选自硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、乙酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、柠檬酸盐、葡萄糖酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、羟基马来酸盐、琥珀酸盐、双羟萘酸盐、苯甲酸盐、丙酸盐、丙酮酸盐、草酸盐、丙二酸盐、肉桂酸盐、水杨酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和芳烷基磺酸盐。
活性化合物的适合的盐是所有酸加成盐或所有碱盐。可以特别提到的是在药物学中惯常使用的可药用无机和有机酸和碱。
一方面，适合的盐是与酸例如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸、硫酸、乙酸、柠檬酸、D-葡萄糖酸、苯甲酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、丁酸、磺基水杨酸、马来酸、月桂酸、苹果酸例如(-)-L-苹果酸或(+)-D-苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、草酸、酒石酸例如(+)-L-酒石酸或(-)-D-酒石酸或内消旋酒石酸、帕莫酸、硬脂酸、甲苯磺酸、甲磺酸或3-羟基-2-萘甲酸形成的水不溶性和特别是水溶性酸加成盐，取决于所涉及的是一元酸还是多元酸并取决于所想要的盐，所述酸以等摩尔定量比例或与其不同的比例使用在盐制备中。此外，谷氨酸盐和天冬氨酸盐是上述活性化合物的适合的盐。
可以例如在工业规模上在本发明的化合物制备期间作为过程产物或副产物获得的不可药用的盐，通过本领域技术人员已知的方法转变成可药用盐。
在本发明的情形中，术语“可药用的”意味着本发明的相关衍生物、功能等同物、盐、溶剂化物、水合物、赋形剂、载体、稀释剂和溶剂可以被安全有效地包含使用在哺乳动物中，并相应地具有所需生物活性和/或功能。
下面列出本发明的一些选出的实施方式：
1.确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险的方法，所述方法包括下列步骤：
·确定所述受试者的血液样品中hGH和/或其同工型的水平，以及
·将所述血液样品中确定的hGH和/或其同工型的水平与预先确定的阈值进行比较，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险，并且
·其中在所述确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值的情况下，所述受试者被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)的降血压疗法来降低的血管风险。
2.权利要求1的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述受试者不具有高血压(至少>140mmHG(收缩压)至90mmHG(舒张压))。
3.权利要求1或2的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述血液样品从尚未用抗高血压药物治疗的受试者获取。
4.权利要求1、2或3的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中通过在受试者中降低血压来降低血管风险意味着在所述受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病。
5.权利要求1至4任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述受试者从未具有主要心血管事件并且从未患有任何心血管疾病。
6.权利要求1至4任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述受试者在最近2周内、优选地在最近一周内、优选地在最近36小时内患有急性心肌梗塞或急性心力衰竭。
7.权利要求1至6任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述抗高血压药物选自血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)、他汀类药物或其组合。
8.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述血液样品选自全血、血清和血浆。
9.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述血液样品是禁食样品。
10.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中用于确定hGH和/或其同工型的水平的测量方法具有至少50pg/ml的灵敏度。
11.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中用于确定hGH和/或其同工型的水平的测量方法是具有至少50pg/ml的测定灵敏度的免疫测定法。
12.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述预先确定的阈值为1370pg/ml，优选为330pg/ml。
13.权利要求1-12任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中hGH和/或其同工型的水平通过包含至少两种结合hGH和/或其同工型的抗体的免疫测定法来确定。
14.权利要求11的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述至少两种结合hGH和/或其同工型的抗体中的每一种对hGH和/或其同工型具有至少108M-1的亲和性。
15.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述方法用于在所述受试者中预防选自心力衰竭、动脉粥样硬化、高血压、心肌病、心肌梗塞和中风的主要心血管事件和/或心血管疾病和/或心血管事件和/或心血管疾病的前期阶段。
16.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述方法还包括：
·推荐向确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值并且被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，或
·推荐对确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值并且被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者不给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)。
17.前述权利要求任一项的确定受试者是否具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的方法，其中所述方法还包括：
·向确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值并且被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，或者
·对确定的hGH和/或其同工型的水平低于所述预先确定的阈值并且被鉴定为不具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险的受试者不给药抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)。
18.一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病的方法中，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照权利要求1-17任一项的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险。
19.一种抗高血压药物(例如血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE抑制剂)、血管紧张肽受体阻断剂(ARB)、β-肾上腺素受体阻断剂(β-阻断剂)和/或他汀类药物)，其用于在受试者中预防主要心血管事件和/或心血管疾病的方法中，所述受试者的确定的hGH和/或其同工型的水平高于所述预先确定的阈值，并且其中所述受试者按照权利要求1-17任一项的方法被鉴定为具有能够通过使用抗高血压药物的降血压疗法来降低的血管风险，其中所述受试者不具有高血压。
实施例
实施例1.us-hGH测定法
使用以前在WO/2014/108396中描述的hGH测定法测量血浆样品。所述测量使用超灵敏化学发光免疫测定法(参见实施例1us-hGH测定法)进行。检测极限为2pg/ml，功能测定灵敏度为8.5pg/ml。hGH的测量值以ng/ml为单位表述(1ng/ml＝2.6mU/L)。
化学品
如果没有另外陈述，则化学品以分析级从Merck(Darmstadt,Germany)获得。
抗原
对于免疫接种和校准来说，我们使用重组人生长激素(NIBSC编号98/574，National Institute for Biological Standards and Control,Herfordshire,UK)。
抗体的开发
针对hGH的小鼠单克隆抗体由UNICUS(Karlsburg,Germany)开发。
所述抗体按照下述方法产生：
将BALB/c小鼠在第0和第14天用100μg hGH(乳化在100μl弗氏完全佐剂中)并在第21和第28天用50μg hGH(乳化在100μl弗氏不完全佐剂中)进行免疫接种。在进行融合实验前3天，动物接受50μg溶解在100μl盐水中的偶联物，其以一次腹膜内和一次静脉内注射来提供。
将来自于免疫接种的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞系SP2/0的细胞在37℃下，用1ml50％聚乙二醇融合30s。在清洗后，将细胞接种在96孔细胞培养板中。杂交克隆通过在HAT培养基[增补有20％胎牛血清和HAT增补剂的RPMI 1640培养基]中生长来选择。在两周后，将HAT培养基更换为HT培养基进行三次传代，然后返回到正常细胞培养基。
在融合后三周，对细胞培养上清液进行初筛以获得抗原特异性IgG抗体。将测试阳性的微量培养物转移到24孔板中进行繁殖。在重新测试后，将所选培养物克隆并使用有限稀释技术再次克隆，并确定同种型。(Lane,R.D.，用于提高分泌单克隆抗体的杂交瘤的生产的短期聚乙二醇融合技术(A short-duration polyethylene glycol fusion techniquefor increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas)，J.Immunol.Meth.81:223-228，(1985)；Ziegler,B.等，在通过单克隆GAD抗体的细胞荧光测定法和补体依赖性抗体介导的细胞毒性检查的大鼠胰岛细胞的表面上不能检测到谷氨酸脱羧酶(GAD)(Glutamate decarboxylase(GAD)is not detectable on the surface ofrat islet cells examined by cytofluorometry and complement-dependentantibody-mediated cytotoxicity of monoclonal GAD antibodies)，Horm.Metab.Res.28:11-15,(1996))。
单克隆抗体生产
我们选择了5种抗体用于进一步调查。
抗体通过标准的抗体生产方法生产(Marx等，单克隆抗体生产(MonoclonalAntibody Production)(1997),ATLA 25,121)并通过蛋白A层析进行纯化。在SDS凝胶电泳分析的基础上，所述抗体的纯度>95％。
抗体的标记和包被
所有抗体按照下述程序用吖啶酯标记：
标记的化合物(示踪剂)：将100μg(100μl)抗体(1mg/ml，在pH 7.4的PBS中)与10μl吖啶NHS酯(1mg/ml，在乙腈中，InVent GmbH,Germany)(EP 0353971)混合并在室温下温育20min。标记的抗体通过凝胶过滤HPLC在Bio-Sil SEC 400-5(Bio-Rad Laboratories,Inc.,USA)上纯化。将所述纯化的标记的抗体在(300mmol/l磷酸钾，100mmol/l NaCl，10mmol/l Na-EDTA，5g/l牛血清白蛋白，pH 7.0)中稀释。最终浓度为每200μl约800.000相对光单位(RLU)的标记的化合物(约20ng标记的抗体)。吖啶酯化学发光使用AutoLumat LB953(Berthold Technologies GmbH&Co.KG)来测量。
固相抗体(包被的抗体)：
固相：将聚苯乙烯管(Greiner Bio-One International AG,Austria)用抗体(1.5μg抗体/0.3ml 100mmol/l NaCl，50mmol/l Tris/HCl，pH 7.8)包被(室温下18h)。在用5％牛血清白蛋白阻断后，将管用pH 7.4的PBS清洗并真空干燥。
hGH免疫测定法：
将50μl样品(或校准物)吸取到包被的管中，在添加标记的抗体(200ul)后，将所述管在18-25℃下温育2h。通过用清洗溶液(20mmol/l PBS，pH 7.4，0.1％Triton X-100)清洗5次(每次1ml)除去未结合的示踪剂。管结合的标记的抗体使用LB 953来测量。使用1ng/ml的固定浓度的hGH。不同抗体组合的信号(在1ng hGH/ml下的RLU)与噪音(没有us-hGH时的RLU)之比提供在表1中。所有抗体都能够产生与任何其他抗体的夹心复合物。具有最强信噪比(最佳灵敏度)的抗体对随后被用于进行us-hGH免疫测定法：hGH G12抗体被用作包被管的抗体，hGH H4抗体被用作标记的抗体。
表1：不同hGH抗体对之间的信噪比测定结果。
校准：
所述测定法使用在20mM K2PO4，6mM>
测定法性能参数
分析测定灵敏度(不含hGH的样品的20次测定的相对光单位平均值加2S.D.)为2pg/ml hGH，功能测定灵敏度(参见上文)为8.5pg/ml。回收和稀释大于5-10.000pg/ml hGH的测量内范围的85％。N＝997个样品的us-hGH测定法与特异性针对重组hGH(22KD)的hGH测定法之间关联系数为r＝0.98，并且对于偏好性识别由垂体天然产生的hGH同工型的测定法来说，发现r为0.95(Bidlingmaier M,Suhr J,Ernst A,Wu Z,Keller A,Strasburger CJ等，用于检测在运动中掺杂的生长激素的高灵敏度化学发光免疫测定法(High-sensitivity chemiluminescence immunoassays for detection of growth hormonedoping in sports)，Clinical chemistry.2009；55(3):445-53.Epub2009/01/27)。这些数据指示了本发明中的所有hGH同工型测量值的适合性。
实施例2.研究群体：
我们研究了在2004年8月至2007年4月之间在莱斯特大学医院NHS信托(University Hospitals of Leicester NHS trust)入院的953位STEMI和NSTEMI患者。这项观察性组群研究遵守赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)并得到当地伦理委员会批准，从患者获得了书面知情同意书。如果患者具有高于第99百分位数的心肌肌钙蛋白I水平并具有下述指标中的至少一者，则被诊断为AMI：持续超过20分钟的胸痛，或由新的病理性Q波或ST-段和T-波变化构成的诊断性系列心电图变化。在前一个月具有已知的恶性肿瘤、肾替代疗法或手术的患者被排除。估算的肾小球滤过率(eGFR)从肾病中的饮食改良的简化公式来计算(Smilde TD,van Veldhuisen DJ,Navis G,Voors AA,Hillege HL，估算患有慢性心力衰竭和收缩功能障碍的患者中的肾功能的公式的缺点和预后价值(Drawbacksand prognostic value of formulas estimating renal function in patients withchronic heart failure and systolic dysfunction)，Circulation 2006；114:1572-80)。所有接受标准医学治疗和血管再生的患者由主治医生全权处理。
血浆样品：在诊断后立即并在症状出现的36h内，在卧床休息15min后抽取血液样品(使用EDTA和抑肽酶抗凝)。将血浆储存在-80℃下，直至在单一批次中进行测定，用于在不知情的情况下确定血浆hGH。
实施例3.分析
根据患者的hGH浓度来分析使用各种不同药物对患有急性心肌梗塞的患者的治疗效能，所述hGH浓度在症状出现后最多36小时的时间框内确定。所分析的药物是：a)血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE)或血管紧张肽受体阻断剂(ARB)，以及b)β-阻断剂。确定效能的终点是在症状出现后1年内发生主要不良心脏事件(MACE)。MACE被定义为下列终点的组合：所有原因造成的死亡，由于心力衰竭或再次急性心肌梗塞(re-AMI)而住院。
血管紧张肽转化酶抑制剂(ACE)或血管紧张肽受体阻断剂(ARB)：
患者组群由在1年内具有245个MACE终点的953个病例构成。正如通过Cox回归分析所确定的，将各种不同的临床变量与1年内MACE的预测相关联(表1)。当将hGH浓度添加到统计模型时(表2)，hGH是MACE的独立预测物，并且令人吃惊的是，hGH与使用ACE/ARB的治疗的相互作用也是独立预测物。对于分离成hGH三分位组后的患者群体、即具有低(<330pg/mL)、中(330–1370pg/mL)和高浓度(>1370pg/mL)hGH的患者来说，也对随着使用ACE/ARB的治疗MACE的发生进行了Kaplan-Meier分析。所述亚组的MACE数目示出在表3中。正如表4中所示，ACE/ARB对MACE的治疗效果依赖于hGH三分位组，并且仅仅对于hGH三分位组2和3、即中和高hGH浓度的三分位组才是显著的。与hGH三分位组2中相比，在hGH三分位组3中效果更加显著。图2-4示出了三个hGH三分位组的相应Kaplan-Meier图。
方程中的变量
表1：用于预测1年内的MACE的多变量Cox回归分析。
方程中的变量
表2：包括hGH和与ACE/ARB疗法的相互作用的用于预测1年内的MACE的多变量Cox回归分析。
病例处理概述
表3：在具有低(三分位组1)、中(三分位组2)和高(三分位组3)
浓度hGH的患者中取决于ACE/ARB治疗的MACE的病例处理概述。
成对比较
表4：取决于hGH三分位组，ACE/ARB对MACE的治疗效果的统计学比较。
β-阻断剂
在同样的患者组群中，多变量Cox回归分析还揭示了hGH与使用β-阻断剂的治疗的显著相互作用，用于预测1年MACE(表5)。
对于分离成hGH三分位组后的患者群体、即具有低、中和高浓度hGH的患者来说，对随着使用β-阻断剂的治疗MACE的发生进行了Kaplan-Meier分析。所述亚组的MACE数目示出在表6中。正如表7中所示，β-阻断剂对MACE的治疗效果依赖于hGH三分位组，并且仅仅对于hGH三分位组2和3、即中和高hGH浓度的三分位组才是显著的。与hGH三分位组2中相比，在hGH三分位组3中效果更加显著。图5-7示出了三个hGH三分位组的相应Kaplan-Meier图。
方程中的变量
表5：包括hGH和与β-阻断剂疗法的相互作用的用于预测1年内的MACE的多变量Cox回归分析。
病例处理概述
表6：在具有低(三分位组1)、中(三分位组2)和高(三分位组3)浓度hGH的患者中取决于β-阻断剂治疗的MACE的病例处理概述。
成对比较
表7：取决于hGH三分位组，β-阻断剂对MACE的治疗效果的统计学比较。
在入院时953位AMI患者按照hGH三分位组的特征提供在表8中。
表8：在入院时953位AMI患者按照hs-GH三分位组的特征。数值数据被呈现为n(％)。对于Kruskal Wallis或卡方检验来说，引用了P值以分别用于连续或分类变量。报告了数目(％)或平均值±SD。*ARB＝血管紧张肽2受体阻断剂
在超过2年的随访期间，存在281个MACE这种主要组成性终点(包含117例死亡、71例HF入院和93例re-AMI)。与无事件存活者(590[20-21 600]，p<0.0005，使用Mann-Whitney检验)相比，具有MACE的患者在陈述时具有更高的GH水平(中位数[范围]，910[40-26 280]pg/mL)。表8还说明了在具有较高GH水平的患者中MACE的普遍性更高。
表9报告了在2年时影响MACE结果的各种不同因素、疗法和生物标志物的单变量危险比。在多变量分析中，检查了各个疗法和它们与GH水平的相互作用。在所有模型中，年龄、Killip类型>1、eGFR与GH水平一起保持作为独立的预测物。β-阻断剂疗法与较低的MACE相关(p＝0.03)并显示出与GH水平的显著相互作用(p＝0.047，表9)。使用ACE/ARB的疗法也显示出与GH水平的显著相互作用(p＝0.016，表9)。
使用Kaplan-Meier存活率分析按照GH三分位组来显示与使用β-阻断剂或ACE/ARB的疗法的相互作用(图8)。对于β-阻断剂疗法来说，在第二(p＝0.009)和第三GH三分位组(p<0.0005)中，在接受这种治疗与未接受这种治疗的患者之间存在MACE比率的显著差异。对于ACE/ARB治疗来说，在第二(p＝0.001)和第三GH三分位组(p<0.0005)中，在接受这种治疗与未接受这种治疗的患者之间存在MACE比率的显著差异。相反，对于两种治疗来说，在最低的GH三分位组中的患者中，在接受或未接受这些治疗的患者之间不存在MACE比率的差异。
表9.对AMI后2年时MACE的Cox回归分析。对于模型1和2报告了多变量分析结果，所述模型包括临床变量和hGH，以及hGH与β-阻断剂(模型1)或ACE/ARB(模型2)的相互作用项。
实施例4.
在基线时进行颈动脉超声。简单来说，扫描右颈动脉分叉的预定范围中斑块的存在，并测量所述分叉处的最大IMT(IMTbulb)和颈总动脉中的平均IMT(IMTcca)。在MDC-CC中的3397位个体(1957位女性，58％)的初始横断回归模型中，hs-GH在整个组群(P＝0.003)和男性(P＝0.003)中表现出与IMTbulb的显著正相关性(表10)。当对传统的心血管风险因子进行调整时，这种关联性基本上不受影响(分别为P＝0.002和P＝0.005)。女性中的结果不显著。在可用于本分析的4425位个体(2658位女性，60％)中，禁食hs-GH水平与IMTcca不相关。
较高的禁食hs-GH水平与男性中颈动脉球中IMT的增加相关。在男性中，hs-GH与颈动脉球处的IMT之间的关系与以前的结果相符，即较高的禁食hs-GH值与心血管疾病相关，这也倾向性地在男性中看到(Hallgren等，2014.JACC 64:1452-1460；Maison等，1998.BMJ[Clinical Research ed]316:1132-1133)。IMTbulb是动脉粥样硬化的良好度量(Naqvi和Lee，2014.JACC>
表10：在MDC-CC研究中使用基线时的IMT作为依从变量并使用hs-GH作为独立变量的线性回归。一个粗糙模型对性别和年龄进行调整，一个模型另外还对传统的心血管风险因子进行调整。
粗糙模型对性别和年龄进行调整。调整的模型对下述因子进行调整：性别，年龄，收缩压，抗高血压药物，糖尿病，当前吸烟，BMI，LDL-C和HDL-C。β系数被表示为hs-GH的自然对数的标准化值每增加1时IMT的自然对数的标准化值的增量。缩写：IMTcca，颈总动脉中内-中膜厚度的平均值。IMTbulb，颈动脉分叉处内-中膜厚度的最大值。
实施例5.BCAPS
研究描述
β-阻断剂降胆固醇无症状斑块研究(Cholesterol-Lowering AsymptomaticPlaque Study)(BCAPS)是在1994至1999年间进行的一项随机双盲安慰剂对照的单中心临床试验。BCAPS的详细描述可以在原始论文中发现(Hedblad等，2001.Circulation 103:1721-1726)，下面是简要概述。原始研究群体由从MDC-CC征召的49至70岁的361位男性和432位女性(总共n＝793)构成。包括在BCAPS中的受试者在右颈动脉中具有斑块，但是没有颈动脉疾病的症状。排除判据是：在之前3个月内患有心肌梗塞、心绞痛或中风；以前在右颈动脉中动过手术；经常使用β-阻断剂或他汀类药物；血压>160(收缩压)或>95(舒张压)mmHg；总胆固醇>8.0mmol/l；怀疑需要胰岛素治疗的高血糖症；以及从调查人员的观点来看使参加者不适合于所述试验的状况。
所有参加者提供书面知情同意书，所述研究得到Lund大学伦理委员会(TheEthics Committee of Lund University)批准。
所述研究由4个不同治疗组构成，参加者被随机分配到下列组之一：安慰剂/安慰剂，美托洛尔CR/XL(25mg，每日一次)/安慰剂，氟伐他汀(40mg，每日一次)/安慰剂或美托洛尔CR/XL(25mg，每日一次)/氟伐他汀(40mg，每日一次)。
治疗时间长度为36个月。在基线时和12、24和36个月时抽取禁食血液样品。在
超声
在基线、18和36个月时进行颈动脉超声(Hedblad等，2001.Circulation 103:1721-1726)。简单来说，扫描右颈动脉分叉的预定范围中斑块的存在，并测量所述分叉处的最大IMT(IMTbulb)和颈总动脉中的平均IMT(IMTcca)。
统计分析
在对治疗组进行比较的分析中，所述组是4个随机组，或者它们被分成氟伐他汀对非氟伐他汀(即安慰剂)或美托洛尔对非美托洛尔的两个组。由于已知禁食hs-GH在男性和女性之间不同，因此所有模型为男性和女性以及二者的组合分别进行。所有模型对年龄、性别(如果尚未将性别分开)和基线时禁食hs-GH水平的自然对数进行调整。
为了调查禁食hs-GH是否受到使用氟伐他汀或美托洛尔的治疗的影响，我们使用ΔGH(从12个月值中减去基线值)作为依从变量并使用治疗组作为独立变量进行了多重回归分析。
然后我们在使用36个月时的IMT作为依从变量的一系列多个回归模型中分析了hs-GH是否影响不同药物对IMT的治疗效果。在这些分析中，使用了较大的随机组以获得更大效力。取决于模型，产生治疗组之间的相互作用项与ΔGH或hs-GH的自然对数的乘积，以评估该相互作用。少量个体在随访期间丢失并且未能完成36个月时的IMT超声检查。当分析IMT时，对这些个体使用最近的IMT值(即18个月的值)，并且将所述分析对IMT测量之间的时间进行调整。所述模型另外还对基线时的IMT的自然对数进行调整。
所有分析在SPSS(22.0.0版，SPSS Inc.,Chicago,Ill)中进行。小于0.05的双向P-值被认为是统计上显著的。
结果
BCAPS研究群体中472位个体的基线特征示出在表11中。所有组中的女性与男性相比在基线时具有更高的hs-GH值。由于在基线或12个月时的样品丢失而未能测量hs-GH的受试者在它们的基线特征方面没有差异。丢失的样品均衡分布在不同治疗组中，但总体来说在样品丢失的组中男性多于女性。这使得在4个治疗组的两个组中男性/女性比率出现边缘差异(表11)。
在线性回归模型中，针对不同治疗组，对12个月时与基线相比hs-GH水平的变化(ΔGH)进行关联。当分析整个组群时，所有分析都不是显著的。在男性中，与安慰剂相比，使用氟伐他汀/美托洛尔的治疗与ΔGH具有显著的负相关性(P＝0.015)。与安慰剂相比，在ΔGH与氟伐他汀治疗之间也存在显著的负相关性(P＝0.046)。在女性中，所述相关性对于氟伐他汀/美托洛尔来说是正的且显著的(P＝0.010)，对于氟伐他汀来说是边界显著的(P＝0.051)。
与未使用氟伐他汀治疗的受试者相比，使用氟伐他汀治疗的男性受试者在12个月内具有更大的hs-GH降低。在男性中，与安慰剂/安慰剂相比，使用美托洛尔/氟伐他汀的治疗与12个月的治疗期间hs-GH的更大降低显著相关，且不依赖于hs-GH的基线水平。此外，当将所有接受氟伐他汀(美托洛尔/氟伐他汀和安慰剂/氟伐他汀)的男性受试者与所有未进行氟伐他汀治疗的受试者进行比较时，氟伐他汀治疗也与12个月hs-GH的更大降低相关，提示在男性中禁食hs-GH值被使用氟伐他汀的治疗降低。然而，在这种情形中，应该指出，当与安慰剂/安慰剂组相比时，氟伐他汀/安慰剂组中12个月内hs-GH的变化没有显著差异。
表12：比较不同治疗组的ΔGH(12个月-基线)的多个线性回归模型。
模型对年龄和基线时hs-GH的自然对数的标准化值进行了调整。此外在所有亚组中还对性别进行了调整。
执行了三种不同模型：在“所有组”中，将不同的治疗组各自针对安慰剂进行比较。在“所有氟伐他汀”中，将接受氟伐他汀的个体针对未接受氟伐他汀的个体进行比较，在“所有美托洛尔”中反之亦然。B系数被表示为与安慰剂相比，使用所讨论的药物的治疗的ΔGH的增量。
附图说明
图1：示出了典型的us-hGH测定法剂量/信号曲线。
图2：在具有三分位组1中的hGH浓度的患者中，ACE/ARB治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图3：在具有三分位组2中的hGH浓度的患者中，ACE/ARB治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图4：在具有三分位组3中的hGH浓度的患者中，ACE/ARB治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图5：在具有三分位组1中的hGH浓度的患者中，β-阻断剂治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图6：在具有三分位组2中的hGH浓度的患者中，β-阻断剂治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图7：在具有三分位组3中的hGH浓度的患者中，β-阻断剂治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
图8：在分别具有三分位组1、2和3中的hGH浓度的患者中，β-阻断剂或ACE/ARB治疗对MACE的效能的Kaplan-Meier图。
序列表
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机译： HGH测定，用于指导受试者预防重大不良心脏事件或心血管疾病
机译： HGH测定，用于指导受试者预防重大不良心脏事件或心血管疾病
机译： HGH测定，用于指导受试者预防重大不良心脏事件或心血管疾病
