一种用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂及制备方法

摘要

一种用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂，其特征在于：其药物活性成分由丹参酮IIA和灯盏花乙素混合而成；所述的丹参酮IIA结构式为：

说明书

技术领域

本发明涉及一种药物组合物复方配伍制剂及制备方法以及该药物组合物在制备治疗脑缺血药物中的用途。

背景技术

脑中风是由于脑部血管突然破裂或阻塞造成血液循环障碍而引起脑组织损伤的一组疾病，又称脑卒中或脑血管意外，具有极高的病死率和致残率。在我国，每年有超过200万人新发生脑血管病，有150万人死于该病，幸存者中大约有3/4的人不同程度地丧失劳动能力，约有1/4－1/3可能在2至5年内复发。主要发病对象为60岁以上人群，脑中风已成为严重威胁中老年人健康的主要疾病。中风后存活的病人，约有60％－80％有不同程度的残疾，最常见的后果就是病人会产生“三偏”、言语障碍、吞咽障碍、认知障碍、日常活动能力障碍以及大小便障碍。“三偏”：偏瘫，一侧肢体活动障碍；偏身感觉障碍，就是一侧肢体没有感觉；偏盲，是指视野某一部分缺损。这些会产生很严重的后果，并给无数的患者和家庭带来了巨大的痛苦和沉重的负担。老年人中风发病率高的事实，引起医务人员和社会的共同关注。年龄与中风的关系十分密切，70岁以上人的中风率是50岁以下的20倍，究其原因就是动脉硬化。

目前临床上治疗中风后遗症的常用方法有：中药康复治疗、针炙康复法、科学的运动功能训练等，而治疗此病症的西药却廖廖无几。常用治疗中风后遗症的中药以我国祖传秘方居多，如华佗再造丸、人参再造丸、大活络丹、天欣泰血栓心脉宁片等。在这些组方的中药中，人参再造丸由56味中药组成，大活络丹则含有50味中药。大组方中的有效成分复杂，并且如此大的组方中，到底是哪几味中药或是哪几个成份发挥着至关重要的作用却不得而知。

丹参具有活血调经、祛瘀止痛、凉血消痈、清心除烦、养血安神等作用。其味苦、微辛，性微寒。常用其治疗冠心病心绞痛、动脉粥样硬化、支气管哮喘、心悸不安、心烦失眠等症。灯盏花性寒、微苦、甘温辛，具有微寒解毒、祛风除湿、活血化瘀、通经活络、消炎止痛的功效。

灯盏花注射液在临床上主要用于心脑血管系统疾病，如高血压脑溢血、脑血栓形成、脑栓塞等。

由于上述两种中药都具有扩张冠脉和预防血栓形成的作用，因此我们将这两味中药作为药对，提取其中有效成份，从而增强治疗作用并进一步降低药物的不良反应。

国内外研究现状：脑中风主要分为出血性脑中风(脑出血或蛛网膜下腔出血)和缺血性脑中风(脑梗塞、脑血栓)两大类，以脑梗塞最为常见。脑中风发病急，病死率高，是世界上最重要的致死性疾病之一。高血压病和动脉粥样硬化是脑中风最主要和常见的病因。对于脑中风，仅能通过控制高血压、糖尿病等疾患，并保持饮食清淡以及维持情绪稳定等进行预防，而一旦发生并且侥幸存活，大部分病人却因此残疾。能够治疗脑中风后遗症的方法和药物却非常有限，并且具有用药时间长、预后差的特点。

用于治疗中风后遗症的常用中药有：

1)大活络丹：有舒筋活血通络、温经散寒止痛、祛风除湿豁痰等多种功效。常用于治疗中风痰癖引起的瘫痪、言语不清、足萎痹痛、筋脉拘挛、腰腿疼痛，以及跌打损伤、行走不便等。经临床观察表明，大活络丹具有抗凝血、抗脑血栓和活血化癖的功效，具有改善病变部位血液循环和肢体营养的作用，在治疗缺血性偏瘫的同时，还可以起到预防脑血栓再次形成的作用。但是，有少数病人出现口干舌燥和大便秘结的不良反应。

2)华佗再造丸：主要功能是活血化癖、化痰通络、行气止痛。用于痰癖阻络之中风恢复期和后遗症所致的半身不遂、拘挛麻木、口眼歪斜、言语不清等。药理研究表明，华佗再造丸能增强脑血液循环，降低血液粘稠度，促进清除颅内血肿块，抑制血小板聚集及血栓形成，使血液流通顺畅；更重要的是能直接保护脑细胞，激活正常脑细胞功能，从本质上恢复神经功能，使手足麻木、口眼歪斜、瘫痪等中风后遗症得到有效治疗。但是病人会出现失眠多梦、心烦易怒、便秘和咽干口苦等。

3)人参再造丸：有补气活血、通经通络、强筋健骨之效，为治疗筋骨疼痛、四肢麻木、半身不遂、口眼歪斜、语言不清、手足拘挛等症而设。研究表明，人参再造丸可促进血液循环，使血流加速，提高机体免疫力及修复功能，对缺血性中风有良好的治疗和调节作用。但是本品含朱砂及马兜铃科植物细辛，不宜长期服用，服用应定期检查，应检查血、尿中汞离子浓度，检查肝、肾功能，超过规定限度者立即停用。此外，老人一般不宜使用。

4)小活络丹：有温经散寒、逐癖通络之功效。常用于治疗脑血管意外后遗症，尤其对于手足麻木、伸展不利、肢体不暖有良好作用。患有严重心脏病、高血压，以及肝肾功能不全的患者忌服此药。

5)解语丹：有祛风通络、化痰开窍之效，适用于中风后遗症之口眼歪斜、筋脉拘急、麻木冷痛、言语不清、流涎不解、吞咽不便等。

6)步长脑心通胶囊：用于气虚血滞、脉络淤阻所致的中风，症见半身不遂、肢体麻木、口眼歪斜、舌强话謇。但是有胃病的患者需注意饭后服药。

中风病理机制复杂，中药认为瘀血阻滞是其病理关键。丹参味苦微寒，祛瘀生新，功效卓著；灯盏花味苦性温，化瘀止痛、祛风散寒。二者相须为用，化瘀之功更胜，二药各取其有效部位，力专效宏。适于中风后遗症的治疗。

丹参又名赤参、紫丹参、红根等。生于山坡草地林边道旁，或疏林干燥地上。为双子叶植物唇形科，干燥根及根茎。主产于安徽、河南、陕西等地。以根条粗壮，干燥、色紫红、无芦头及须根者为佳。丹参是益气活血和治疗心脑血管疾病的常用中药，它的作用主要有：

1)心血管系统的作用：

a.强心加强心肌收缩力、改善心脏功能，不增加心肌耗氧量；

b.对血管作用扩张冠脉，增加心肌血流量；扩张外周血管，血流增加；脑血流量下降；

c.抗血栓形成，提高纤溶酶活性；延长出、凝血时间；抑制血小板聚集(提高血小板内cAMP水平抑制TXA2合成)；改善血液流变学特性(血粘度降低、红细胞电泳时间缩短)；

d.改善微循环。

2)促进组织的修复与再生作用：

a.促进组织的修复与再生坏死心肌清除快；纤维母细胞分化、胶原纤维形成较明显；肉芽形成比较成熟。局部淤血减轻、血液循环改善，愈合时间缩短；

b.抑制过度增生对过度增生的纤维母细胞有抑制作用。

3)保肝改善肝微循环。

4)抗菌丹参制剂中含有隐丹参酮、二氢丹参酮，对体外的葡萄球菌、大肠杆菌、变性杆菌有抑制作用。

丹参含有多种有效成分，但可归纳为脂溶性成分和水溶性成分。前者以丹参酮为主，后者以酚酸为主。丹参中的脂溶性成分最主要的有三种：丹参酮I、丹参酮IIA和隐丹参酮，其中丹参酮IIA含量相对较高，约为药材的0.1～0.9％，一直作为有效成分的质量控制指标。丹参酮分离一般采用有机溶剂如甲醇、乙醇、二氯甲烷等提取，传统的分离方法是用95％乙醇热回流提取。但由于丹参酮在受热时不稳定，因而超声法作为非热提取可有效避免加热造成的损失，提高其含量。超临界提取是近来发展新方法，尤其适合丹参酮的提取分离，其纯度和得率都有大幅提高，是一种值得推广的方法。丹参中水溶性成分为原儿茶醛、丹参素和丹酚酸。随着研究深入，人们发现丹参水溶性最有效成分不是前二者，而是丹酚酸，其中丹酚酸A活性最强。丹酚酸A的含量约为丹参药材的0.01～0.06％，而丹酚酸B的含量较高，可达2～8％。因此丹酚酸B为丹参水溶性成分中最主要的活性成分。传统的水溶性酚酸分离采用的是水提醇沉，但加热处理，包括热提取、热浓缩、干燥均引起了丹酚酸的降解，因此缩短受热时间是提高其含量的有效方法，如减压浓缩、喷雾干燥等。大孔树脂提取是近年发展起来用于分离丹参水溶性酚酸的方法，采用此法分离效率高，酚酸含量高，损失小。实验室分离已经获得了多种丹参有效成分，但以此开发的药物仍然较少，如丹参注射液和丹参滴丸分别以水溶性成分和脂溶性成分为主的制剂。

灯盏花是菊科植物短葶飞蓬的干燥全草，又名灯盏细辛、东菊。生于向阳坡地，主要分布于我国西南地区，尤以云南较多。在临床上主要用于治疗高血压、脑溢血、脑血栓形成、脑栓塞、多发性神经炎、慢性蛛网膜炎等瘫痪后遗症，此外，对糖尿病、肾病、颈性眩晕、老年性疾病也有较好的疗效。

灯盏花素是从灯盏花中提取的黄酮类有效成分，主成分为灯盏花乙素(4′-羟基黄芩素-7-o-葡萄糖醛酸苷醛酸苷)，另含少量灯盏甲素(芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷)。灯盏花素具有扩张脑血管的作用，能降低脑血管阻力，增加脑血流量，改善微循环，并有对抗血小板聚集作用。故可用于治疗缺血性脑血管疾病，如脑血栓形成、脑栓塞、脑溢血等所致瘫痪后遗症病人，具有较好疗效，对病程在6个月以内的疗效比6个月以上者好。

然而，丹参和灯盏花也有各自的副作用。实践证明，丹参对胃肠有刺激作用，如长期服用丹参，可引起不同程度的纳呆、泛酸等症。丹参不可和阿司匹林一起服用。灯盏花类药品在临床上的应用效果显著，民间利用历史悠久，具有广泛的社会基础，加上毒副作用小，深受用户欢迎，被列为国家重点发展的中草药品种和中医治疗心脑血管疾病，但使用中出现皮疹，乏力，口干等副作用。因此，正确使用中药，利用其有效成分，去除引起不良反应的其他成分，实现中药现代化，是中药发展和走向国际的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一种由丹参与灯盏花药物活性成分组成的中药复方制剂及其制备方法，用于制备治疗脑缺血药物的医疗用途。

本发明的的目的是这样实现的：一种用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂，其特征在于：其药物活性成分由丹参酮IIA和灯盏花乙素混合而成；

所述的丹参酮IIA结构式为：

所述的灯盏花乙素的结构式为：

本发明的目的还可以下述方式实现：药物活性成分丹参酮IIA与灯盏花乙素的质量比为3︰5。

药物活性成分丹参酮IIA与灯盏花乙素按照人体重量推算用药量配比范围为：丹参酮IIA：0.3mg/kg‐7.5mg/kg，灯盏花乙素为0.5mg/kg‐12.5mg/kg。

所述的用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂为口服制剂或注射剂。

所述的口服制剂为片剂或胶囊。

所述的注射剂为静脉滴注制剂。

本发明用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂的制备方法，其特征在于：药物活性成分丹参酮IIA和灯盏花乙素由市场购买或原料药材提取获得，然后按照质量比为3︰5的比例混合，依常规加辅料制备成片剂或胶囊或注射剂；用法用量：片剂、胶囊，规格为30mg/片(粒)，成人每次1-2片，每日3次；注射剂：静脉滴注，每日总量控制在100mg-200mg之间。

本发明用于治疗脑缺血的中药单体复方配伍制剂在制备缺血性脑病、脑出血后康复、脑血栓后康复和缓解心肌缺血、脑缺血药物中均可应用。

本发明公开了丹参酮IIA和灯盏花乙素组合物和配伍方法在制备治疗脑缺血药物中的用途，本发明中丹参酮IIA和灯盏花乙素组合物按比例配伍能显著保护小鼠脑缺血损伤。运用小鼠大脑中动脉结扎模型、原代皮层神经元神经毒和氧化损伤模型，利用Morris水迷宫实验、NMDA兴奋性神经毒性实验和双氧水氧化损伤实验，发现丹参酮IIA和灯盏花乙素组合物可显著提高大脑中动脉结扎模型小鼠的空间记忆能力，改善运动功能，并减少脑组织损伤面积，促进神经元功能恢复，降低氧化损伤；体外细胞学模型进一步发现，丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍可以显著减轻氧化应激损伤和NMDA引起的兴奋性神经毒性作用。表明利用丹参酮IIA和灯盏花乙素组合物比例配伍，有利于发挥中药单体组方的多效性，即符合中医理论，又体现了中药多部位、多靶点的作用机制，效果明显、安全。本发明具有治疗缺血性脑损伤疗效高、服量小、应用方便等特点。

附图说明

图1.原代神经元细胞活力实验

(A)原代神经元培养NMDA兴奋性神经毒性模型；(B)原代神经元培养双氧水(H₂O₂)氧化损伤模型。丹参酮I(Tanshinone-I)，丹参酮IIA(Tanshinone-IIA)，丹酚酸(Salvianolic>$P<0.05,^$$P<0.01vs>2O₂模型。

图2.单体配伍对脑损伤的抑制作用

(A)TTC染色显示各组脑梗死区域，红色为正常脑组织，白色为梗死脑组织。(B)各组梗死脑组织体积(脑体积％)定量。(C)各组动物神经学评分定量。丹参酮IIA(Tanshinone-IIA)，灯盏花乙素(Scutellarin)n＝6，平均值±标准差，^#P<0.05，^##P<0.01与MCAO模型组比较。

图3.单体配伍对学习记忆以及运动功能的影响

(A)小鼠在Morris水迷宫训练寻找平台潜伏期。(B)各组小鼠在平台象限停留时间。(C)各组动物在滚棒上停留时间(总时间为3min)。丹参酮IIA(Tanshinone-IIA)，灯盏花乙素(Scutellarin)。n＝6，平均值±标准差，*P<0.05，**P<0.05，与Sham比较；^#P<0.05，^##P<0.01与MCAO模型组比较。

图4.单体配伍对脑损伤边缘区谷氨酸NMDA受体表达的影响

(A)Western-blot条带示例。(B)各组NR2A亚型表达水平。(C)各组NR2B亚型表达水平。(D)各组NR2B Ser1303位点磷酸化水平。(E)各组NR2B Tyr1472位点磷酸化水平。。丹参酮IIA(Tanshinone-IIA)，灯盏花乙素(Scutellarin)。n＝6，平均值±标准差，*P<0.05，**P<0.05，与Sham比较；^#P<0.05，^##P<0.01与MCAO模型组比较。

具体实施方式

本发明基于丹参与灯盏花在中药复方制剂中的效应分析和主要成分作用分析，确立单体复方组成及配伍比例。

(一)实验方法与材料

1.动物：成年小鼠

孕14～15天C57BL/6小鼠，清洁级，健康雄性C57BL/6小鼠，均由第四军医大学实验动物中心提供。在第四军医大学药理学教研室动物房饲养，温度23±2℃，湿度50％±10％，12h昼夜周期，动物自由进食、饮水。实验前小鼠需适应环境一周，所有行为学实验安排在白天进行(上午9:00-12:00和下午14:00-18:00)。与动物相关的所有实验均由第四军医大学伦理委员会审核通过。

2.原代神经元培养

小鼠大脑皮层神经元的培养参照本实验室前期方法并作适当调整[43]，孕13～15天C57BL/6小鼠脱颈椎处死，无菌条件下取出胚胎，放入装有预冷D-Hank’s平衡盐液的平皿中，在显微镜下剥离硬脑膜并取出大脑，剔除血管膜，分离并取出大脑皮层，加入终浓度为0.25％胰蛋白酶消化液消化10分钟，随后用弯头滴管吸出皮层组织，转移到装有预冷的DMEM培养液的离心管内，漂洗三次，终止消化，最后轻轻吹打细胞数次制备单细胞混悬液，200目筛网过滤并计数。调整细胞密度分别按1×10⁶/孔种入6孔板内，5×10⁴/孔种入96孔板内，2×10⁵/孔种入预先铺有玻片24孔板内，所有的培养板预先包被有终浓度为50μg/ml的多聚-D-赖氨酸(PLL)。孵箱中培养24h后全量换为Neurobasal培养液(Neurobasal+2％B27+1％双抗)。以后每隔两天半量换液一次，换液前应将培养液在37℃环境中充分复温，减少冷刺激。培养到7～10天细胞用于实验。

3.MTT实验

无菌条件下，移去培养基，用无Mg²⁺的细胞外液(ECS)洗两遍，先用药物处理神经元15min，再加入NMDA(200μM)和双氧水((100μM)，此时药物与NMDA和双氧水同时作用于细胞。30min后每个孔用ECS洗两遍，每孔加90μl原培养液继续培养24小时，随后每孔加入终浓度为5mg/ml的MTT溶液10μl，继续孵育4-6小时。小心吸弃培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜(DMSO)，迅速用自动酶标仪(波长490nm)测试光密度(OD)值。

4.小鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)实验

动物在接受MCAO术前，连续灌胃给药3天(每日2次，于AM9:00和PM5:00各灌胃一次)，于第四日上午最后一次给药后1小时，将模型组和芝麻素组小鼠采用大脑中动脉栓塞(MCAO)的方法制成脑缺血再灌注损伤模型。用水合氯醛(300mg/kg)对小鼠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，颈部消毒，手术显微镜下，沿着颈部正中线切口，逐层分离皮下和肌肉组织，充分暴露颈总动脉后，小心游离颈总动脉至分叉处，将颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)结扎，用动脉夹夹闭颈内动脉(ICA)。用眼科剪在颈总动脉近心端剪一切口，将线栓(直径0.2mm，长度20mm)经切口沿颈总动脉轻柔插入颈内动脉大约10mm左右，遇到轻微阻力即可停止，表明线栓头端恰好位于中动脉起始端，已经将同侧大脑中动脉阻塞。留5mm线头于体表，缝合肌肉和皮肤，将动物放回饲养笼内，手术中和术后用电烤灯保温。再灌注于缺血后2小时进行，将线栓轻拉至颈内动脉起始处，此时大脑中动脉血供恢复。假手术对照组操作和MCAO模型组基本相同，只是不需要插入线栓。术后继续给药2次。

5.神经功能评分及脑梗死体积测定

神经功能评分于再灌注24小时后进行，参考Longa法5分制评分标准：未见神经损伤缺陷为0分；前肢弯曲，不能完全伸直为1分；行走时向左侧转圈为2分；站立不稳，向左侧倾倒为3分；不能独立行走同时伴有意识障碍者为4分。0分和4分者予以排除，不能用于实验。神经功能评分后，部分动物(每组6只)迅速取出鼠脑，用冰生理盐水冲洗，置于-20℃冰箱20分钟，于脑槽中取冠状面均匀切成2mm厚的切片6片，迅速放入37℃预热的2％的2，3，5—氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中染色30分钟。每5分钟翻动一次脑片。随后用10％福尔马林溶液固定过夜，用数码相机拍照。正常区组织为红色，脑梗死区组织为白色。用图像处理软件photoshop CS3计算梗死体积，每个梗死面积之和乘以脑片厚度(2mm)为总的梗死体积。

6.Morris水迷宫

神经功能评分后，部分动物(每组10只)继续给药7天，然后停止给药，恢复3周，于术后1个月采用Morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力。本实验所用水迷宫是一个圆形电镀的水缸，池内水深45cm，池壁涂成黑色。因为小鼠为黑色，池水中加入奶粉使其变为乳白色。整个实验过程房内光线、温度、池内温度都保持恒定不变。将水池划分为四个象限，假设目标象限为第一象限，在目标象限距离池壁35cm处放置一个白色的站台，直径为8cm，距离水面约为2cm。在实验过程中，站台的位置不变。不同颜色及形状的标记物贴在池壁内。摄像机安装在迷宫的上方。小鼠的运动轨迹可以被实时同步记录。实验中的视屏分析和处理采用的是上海吉量软件科技有限公司研制开发的系统。该系统可以提供动物的上台潜伏期、穿台次数、游泳路程、游泳速度和靶象限活动时间百分比等多个指标。具体实验步骤如下，大体分为两步：

①空间学习实验：实验前，先将小鼠放置在站台上，让其适应20s。然后选择一个除目标象限之外的象限，沿池壁将小鼠慢慢放入池水中，每一次入水点的位置与平台的距离要基本一致。小鼠登台5s即算登台成功，停止记录。每次记录时间设为60s。如果1min后，小鼠还没有登上站台，同样停止记录，然后引导其登台并让其停留20s。实验后，要将动物擦拭干净后放入鼠笼。重复上述步骤，每只小鼠每次实验的间隔至少30min，以保证小鼠有充足的时间恢复体力，减少游泳带来的应激。通过软件记录下小鼠游泳总路程、速度、上台潜伏期等指标，用来评价其空间学习能力。同样实验，连续重复测试5天。

②空间记忆实验：间隔两天，在第8天和第9天，撤去站台，任意象限将小鼠沿池壁慢慢放入池水中，记录90s小鼠的游泳轨迹，同样将小鼠擦干放回笼中。通过记录轨迹曲线，来测量小鼠在目标象限的活动时间百分比和穿台次数，来评估小鼠的空间记忆能力。

7.Rotarod滚轮实验

Morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力神经功能评分后，采用Rotarod滚轮装置，分别于脑缺血后第40天进行转棒实验训练。小鼠按8转/min转速训练3次，每次5min，两次训练之间间隔20min作为疲劳恢复时间。术后第43天，所有小鼠均按转速16转/min进行测试，记录小鼠在转棒仪上连续行走的时间。

8.Western-blot

神经功能评分后，部分动物(每组6只)迅速取出鼠脑，取半暗带周围脑组织用PBS漂洗后，加入预冷的RIPA裂解液(含适量蛋白酶抑制剂cocktail和1mM PMSF)，于冰上用超声波细胞粉碎机匀浆5次(25Hz，3s/次，间隔5s)，最终液体至清亮。4℃，12000rpm离心20min，收集上清液于新的1.5ml离心管中；取少量上清用BCA法蛋白定量，绘制标准曲线，确定上样体积；剩余上清中加入1/4体积的5×上样缓冲液沸水煮8min，使蛋白变性。采用SDS-PAGE分离蛋白，先后配制9％分离胶和3％浓缩胶，待凝胶后，加入500ml电泳缓冲液(含1.51g Tris，7.4g Glycine，0.5g SDS)；取蛋白样品各30μg经加样孔上样，先80V电泳0.5h，然后调至120V继续电泳约1.5h，待溴酚蓝到达分离胶底部时，即停止电泳；PVDF膜用甲醇预处理2min，加入1L转移缓冲液(含200ml甲醇，14.4g Glycine，3.03g Tris)，将凝胶和PVDF膜以“黑胶白膜”的朝向放置，恒压100V，转移2h。转膜结束后，按照蛋白marker裁剪所需的目的蛋白条带，置于5％脱脂奶粉中封闭，室温缓慢摇动2-4h；PBST漂洗多余奶粉后，将条带封入塑料袋中，加入用PBST稀释的一抗，置于4℃孵育过夜；次日取出塑料袋，室温复温0.5h，然后PBST洗膜3次，每次10min，再将条带封入用PBST稀释的二抗中，室温孵育2h；PBST漂洗3次后，再用PBS漂洗10min，将ECL发光液A和B按1:1混合后，均匀滴加到膜上，迅速置于发光仪内曝光，照相。抗体NR1和NR2B抗体购自美国Millipore公司；NR2A,NR2B,NR2B-P-Ser1303,NR2B-P-Tyr1472抗体购自英国Abcam公司。

9.氧化损伤指标测定

具体实验步骤请参照试剂盒说明书。损伤侧缺血边缘区脑组织组织匀浆，12000rpm离心20min，上清液按照试剂盒，通过分光光度仪用化学比色法测定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平。

(二)结果

1.丹参中主要活性成分的确立

根据文献报道，丹参有效成分主要包括丹参酮I、丹参酮IIA、隐丹参酮和丹酚酸等。其中丹参酮IIA含量相对较高，约为药材的0.1～0.9％，一直作为有效成分的质量控制指标。丹参注射液和丹参滴丸分别以水溶性成分和脂溶性成分为主。依据丹参酮扩张血管、改善微循环、抗氧化等多方面作用，我们前期筛选研究的选用原代神经元培养NMDA兴奋性神经毒性模型和双氧水(H₂O₂)氧化损伤模型，我们分别对丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸三个单体成分进行了研究。在NMDA兴奋性神经毒性模型中发现上述三种单体对NMDA引起的兴奋性神经毒性均有一定的抑制作用。NMDA处理后神经元活力显著降低，盐水对照组神经元活力仅为46.2％，阳性对照药物NMDA受体NR2B阻断剂Ro25-6981(0.3μM)可显著抑制NMDA引起的神经元损伤(神经元活力增至96.3％)。经药物处理后神经元活力均不同程度增加，具体为：三个浓度丹参酮I使神经元活力升至52.3％，63.2％和66.5％；三个浓度丹参酮IIA使神经元活力升至66.6％，74.5％和81.1％；三个浓度丹酚酸使神经元活力升为50.2％，60.4％和68.5％(图1A)。可见丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸三个单体成分对抗NMDA兴奋性神经毒性作用在同等浓度时以丹参酮IIA作用最强。

此外，原代神经元培养双氧水(H₂O₂)氧化损伤模型中，双氧水处理后神经元活力显著降低，盐水对照组神经元活力仅为38.4％，阳性对照药物Catechin(5μM)可显著抑制双氧水引起的神经元损伤(神经元活力增至64.3％)。经药物处理后神经元活力均不同程度增加，具体为：三个浓度丹参酮I使神经元活力升至42.4％，48.5％，52.8％；三个浓度丹参酮IIA使神经元活力升至46.5％，56.7％和67.5％；三个浓度丹酚酸使神经元活力升为46.0％，52.1％和57.1(图1B)。可见丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸三个单体成分对抗双氧水氧化损伤作用在同等浓度时以丹参酮IIA作用最强。

丹参酮IIA：樱红色针状结晶，不溶或微溶于水，易溶于二甲基亚砜、乙醇、丙酮、乙醚和苯等有机溶剂。结构式为：

2.灯盏花中主要成分的确立

灯盏花素是灯盏花伸进过保护作用的重要成分，主要包括灯盏花乙素(4′-羟基黄芩素-7-o-葡萄糖醛酸苷醛酸苷)和灯盏甲素(芹菜素-7-o-葡萄糖醛酸苷)。临床上主要用于治疗脑血栓形成及脑栓死等所致完全性及不完全性瘫痪，由于其抗氧化作用较强，因此我们仍选用原代神经元培养NMDA兴奋性神经毒性模型和双氧水(H₂O₂)氧化损伤模型评价灯盏花主要成分的神经保护作用。NMDA兴奋性神经毒性模型中，三个浓度灯盏花乙素使神经元活力升至58.5％，68.5％和73.3％；三个浓度灯盏甲素使神经元活力升至50.2％，58.7％和62.3％(图1A)。可见灯盏花乙素单体成分对抗NMDA兴奋性神经毒性作用在同等浓度时作用最强。

在原代神经元培养双氧水氧化损伤模型中，三个浓度灯盏花乙素使神经元活力升至45.1％，64.5％，72.5％；三个浓度灯盏甲素使神经元活力升至44.1％，48.4％和52.5％(图1B)。可见灯盏花乙素和灯盏甲素两个单体成分对抗双氧水氧化损伤作用在同等浓度时以灯盏花乙素作用最强。

灯盏花乙素：为淡黄色至黄色粉末，有一定吸湿性；无臭，无味或味微咸。在甲醇、吡啶、稀碱溶液中溶解，在热水、乙醇、乙酸乙酯中略溶，在水、乙醚、三氯甲烷、苯、丙酮等有机溶剂中几乎不溶。结构式为：

3.细胞学正交实验确立单体复方组成

根据上述实验结果，分别选择各自药物的最佳实验浓度(见图2)。将丹参中丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸三种单体作为因素1，灯盏花中灯盏花乙素和灯盏甲素两种单体作为因素2，采用析因设计原理，分别进行两种成分的配伍；并利用两种细胞学损伤模型即原代神经元培养模型NMDA兴奋性神经毒性模型和原代神经元双氧水氧化损伤模型，来评价单体复方配伍的最佳效应。根据上述浓度梯度实验，确定各单体物质的最佳作用浓度。

(1)首先利用NMDA兴奋性神经毒性模型评价单体配伍的协同作用。2因素(丹参有效成分，灯盏花有效成分)析因试验设计(完全交叉分组试验设计)发现，单独使用丹参有效成分丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸，三个单体成分均可显著抑制神经元死亡，升高细胞存活率，分别为52.3％,74.5％和68.4％，与盐水对照组模型组(42.5％)相比有显著差异。同样，单独使用灯盏花乙素和灯盏甲素也显著升高神经元存活率至68.5％和62.3％。析因试验单变量方差分析结果表明：丹参有效成分或灯盏花有效成分单因素主效应均显著(p<0.05)，表明单独使用丹参有效成分或灯盏花有效成分，均有一定的神经保护作用；单因素主效应对比发现，丹参有效成分保护作用大于灯盏花有效成分(均方：0.604vs 0.308)。同时发现，两因素之间交互作用显著(p<0.05)，表明丹参有效成分和灯盏花有效成分联合使用具有协同效应。最佳剂量组合为丹参酮IIA(5μM)和灯盏花乙素(5μM)，神经元生存率达到89.7％。

表1单体配伍对NMDA兴奋性神经毒的抑制作用(细胞存活率％，平均值±标准差)

采用SPSS统计软件进行处理，组间比较用one‐way ANOVA方差分析的统计方法；多组见间两两比较用Post‐Hoc‐Tests LSD法。*P<0.05，**P<0.01与生理盐水组比较；^$P<0.05，^$$P<0.01配伍组与其中任意一组分比较。

(2)其次利用原代神经元双氧水氧化损伤模型评价单体配伍的协同作用。配伍同上表。单独使用丹参有效成分丹参酮I、丹参酮IIA和丹酚酸，三个单体成分均可显著抑制神经元死亡，升高细胞存活率，分别为48.5％,56.7％和57.2％，与盐水对照组模型组(37.9％)相比有显著差异。同样，单独使用灯盏花乙素和灯盏甲素也显著升高神经元存活率至65.5％和53.2％。析因试验单变量方差分析结果表明：丹参有效成分或灯盏花有效成分单因素主效应均显著(p<0.05)，表明单独使用丹参有效成分或灯盏花有效成分，均有一定的神经保护作用；单因素主效应对比发现，丹参有效成分保护作用与灯盏花有效成分相当(均方：0.487vs0.517)。同时发现，两因素之间交互作用显著(p<0.05)，表明丹参有效成分和灯盏花有效成分联合使用具有协同效应。最佳剂量组合为丹参酮IIA(5μM)和灯盏花乙素(5μM)，神经元生存率达到78.9％。

表2单体配伍对双氧水致神经元氧化损伤的抑制作用(细胞存活率％，平均值±标准差)

采用SPSS统计软件进行处理，组间比较用one‐way ANOVA方差分析的统计方法；多组见间两两比较用Post‐Hoc‐Tests LSD法。*P<0.05，**P<0.01与生理盐水组比较；^$P<0.05，^$$P<0.01配伍组与其中任意一组分比较。

4.丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍改善脑缺血损伤

(1)丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍改善神经功能缺失与脑损伤

大脑中动脉栓塞(MCAO)是一个普遍接受的脑损伤模型。脑缺血再灌注损伤的发生是一个多种因素和机制共同参与的复杂的病理生理过程。在急性脑损伤过程中，氧自由基导致的氧化损伤包括了许多分子和细胞的损伤，比如蛋白质、脂质体、DNA、线粒体和细胞膜结构以及随之发生的细胞凋亡和坏死。根据最佳剂量组合为丹参酮IIA(5μM)和灯盏花乙素(5μM)，以及分子量丹参酮IIA(分子量294.34)和灯盏花乙素(分子量462.36)推算，动物实验配伍剂量分别设定为丹参酮IIA 1.5mg/kg和灯盏花乙素2.5mg/kg。实验设为5组，即假手术对照组、MCAO模型组、丹参酮IIA 1.5mg/kg组、灯盏花乙素2.5mg/kg组、配伍组(丹参酮IIA 1.5mg/kg和灯盏花乙素2.5mg/kg)。实验结果表明，再灌注24小时候，除了假手术组，实验动物均出现了不同程度的神经功能缺失和脑梗死，与假手术组相比，MCAO显著增加了小鼠的脑梗死体积(39.64±0.78％)和神经功能评分(3.4±0.09)，丹参酮IIA 1.5mg/kg组、灯盏花乙素2.5mg/kg组和配伍组预处理可减少MCAO手术引起的脑梗死体积增加(图2A,2B)和神经功能缺失(图2C)。其中以二者配伍疗效最佳。

(2)丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍改善学习记忆与运动功能

小鼠MCAO术神经功能评分后，部分动物(每组10只)继续给药7天，然后停止给药，恢复3周，于术后1个月采用Morris水迷宫法评估动物的空间和学习记忆能力。实验结果表明，MCAO小鼠现空间学习与记忆能力明显降低，丹参酮IIA 1.5mg/kg组、灯盏花乙素2.5mg/kg组和配伍组治疗可减少MCAO手术引起的学习与记忆损伤(图3A,3B)，并恢复其运动能力(图3C)，其中以二者配伍疗效最佳。

5.药理作用机制研究

为进一步探讨丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍发挥协同神经保护作用的分子机制，首先分别采用Western-blot检测二者配伍组合对介导兴奋性神经毒性作用的谷氨酸离子型NMDA受体表达及磷酸化的影响。如图4所示，再灌注24小时候，取梗死边缘区脑组织进行Western-blot，发现缺血损伤显著增加NMDA受体NR2B亚型的表达，而NR2A亚型表达无显著变化；进一步研究发现，缺血损伤也使NR2B受体磷酸化也显著增强。丹参酮IIA 1.5mg/kg组、灯盏花乙素2.5mg/kg组和配伍组治疗可减少NMDA受体NR2B亚型的表达和其磷酸化水平(图4)。其中以二者配伍作用最强大。

缺血脑组织发生明显氧化损伤，丹参酮IIA1.5mg/kg组、灯盏花乙素2.5mg/kg组和配伍组治疗可显著减少损伤脑组织中氧化损伤产物丙二醛(MDA)含量，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)水平(表3)。其中以二者配伍作用最强大。

表3.单体配伍对脑组织抗氧化指标的影响(平均值±标准差)

采用SPSS统计软件进行处理，组间比较用one‐way ANOVA方差分析的统计

方法；多组见间两两比较用Post‐Hoc‐Tests LSD法。*P<0.05，**P<0.01与假

手术组比较；^$P<0.05，^$$P<0.01与MCAO组比较。

(三)配伍制剂与给药方法

1.配伍比例与推荐剂量

根据小鼠实验结果丹参酮IIA1.5mg/kg和灯盏花乙素2.5mg/kg配伍比例，即：丹参酮IIA/灯盏花乙素为3/5，该比例为质量份之比。如果换算为摩尔比，则为1:1。比例有效范围：丹参酮IIA：0.3mg/kg-7.5mg/kg，灯盏花乙素为0.5mg/kg-12.5mg/kg。根据小鼠/人(70公斤)体表面积换算，推荐组方临床人用量为30mg/70kg(按照3/5比例计算，其中丹参酮IIA11.25mg/70kg和灯盏花乙素18.75mg/70kg)。

2.制剂类型

(1)口服制剂：可为片剂、胶囊，规格为30mg/片，建议每次1-2片，每日3次。

(2)注射剂：静脉滴注，每日总量控制在100mg-200mg之间。

(四)安全性考察

急性毒性：采用Bliss法小鼠灌胃检测急性毒性，未测得LD50。根据有效剂量推算，在400mg/kg(为小鼠有效剂量的100倍)时未见任何毒副作用。

(五)结论

本发明利用细胞学和整体动物研究，采用析因设计发现丹参与灯盏花中有效成分丹参酮IIA和灯盏花乙素配伍组合，具有显著的协同作用，并最大程度发挥神经保护作用，未见明显毒副作用。其作用机制与抑制兴奋性神经毒性作用和抗氧化损伤有关。