一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、制备方法、试剂盒及检测方法

摘要

本发明公开了一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、制备方法、试剂盒及检测方法。本发明的微阵列芯片的组成上，选用了7类应激反应标志物，可以明确不同刺激条件下细胞应激反应应对的内部细胞蛋白表达的变化，实现快速筛选与评价；本发明选用醛基化修饰的玻片作为固体载体，使特异性抗体结合更稳定，活性更高；能够有效排除光谱芯片测试的假阳性和假阴性，交叉反应测试显示芯片的指标测试灵敏度高、特异性好；本发明的微阵列芯片制备方法简便，检测快速，整个流程只需2d完成；灵敏度高；特异性好，并且制作成本较低，有广阔的产业化前景。

说明书

技术领域

本发明涉及芯片检测领域，更具体地，涉及一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、制备方法、试剂盒及检测方法。

背景技术

细胞应激是原核或真核细胞遭受各种明显的环境变化或遭遇射线，活性氧等导致大分子损伤时，产生的一系列适应性变化，最终导致基因表达的改变，增强细胞抗损伤能力和在不利条件下的生存能力。目前，常见的细胞应激过程主要有细胞凋亡、细胞自噬、细胞增殖、细胞迁移、细胞干性、蛋白翻译等。

针对不同的外界刺激会产生不同的细胞应激反应，主要体现在细胞内蛋白表达差异上。例如对细胞进行饥饿处理，细胞为了应对无营养摄入情况，内底物蛋白会被核糖体双层膜包裹，接着自噬小泡的外膜与溶酶体膜或者液泡膜融合，释放出包裹底物蛋白的泡状结构到溶酶体或者液泡中，最终将其降解。在这一过程中，LC3和p62等蛋白会发生明显的降解，这也成为细胞自噬发生的标志性蛋白。

当前科研研究中，针对不同研究方向大家一般只关注对应的一到两个细胞应激过程，缺少对外界刺激细胞应激全面、准确、快速的检测手段。一般情况下，开展分子机制及细胞分子生物学仍然普遍采用WB、Elisa、免疫组化等常规蛋白表达测试手段，但是这些手段测试过程繁琐、技术复杂、试剂昂贵。

为了高通量地针对细胞应激条件下蛋白进行定性或定量的分析的问题，蛋白芯片的开发非常必要。然而蛋白芯片的开发存在不少需要克服的难点：1、蛋白芯片的基础是抗原抗体亲和反应，在抗体固定于载体表面时，其特异性和亲和力受到限制，往往出现特异性低，结合不稳定的情况；2、不同的蛋白质在临床样品中的丰度不同，抗体抗原反应的亲和力不同，样品稀释不当，很容易出现假阴性的情况；3、蛋白质之间存在着交叉反应，严重影响检测结果的准确度，随着检测抗体数量的增加，需要克服交叉反应的难度越大。只有克服以上难点，才能制备出特异性好，交叉反应小，准确率高的蛋白芯片，从而避免假阳性和假阴性的出现。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片；

本发明的另一目的在于提供一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片的制备方法；

本发明的另一目的在于提供一种检测细胞应激反应中蛋白表达的试剂盒；

本发明的另一目的在于提供一种细胞应激反应中蛋白表达的检测方法；

本发明所采取的技术方案是：

一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片，其包括固体载体及列阵式固定在固体载体上的应激反应标志物的独立地特异性抗体；所述的应激反应标志物为下述各类标志蛋白的一类或多类：细胞增殖标志蛋白、细胞凋亡标志蛋白、细胞自噬标志蛋白、细胞迁移标志蛋白、蛋白质翻译标志蛋白、细胞干性标志蛋白、细胞应激标志蛋白。

作为上述微阵列芯片的优选，应激反应标志物为下述各类标志蛋白的一类或多类，各类标志蛋白含有多个独立地标志蛋白，其中：

细胞增殖标志蛋白为PCNA、Ki67、CyclinD1；

细胞凋亡标志蛋白为PRAP、Caspase3、Caspase9、Caspase8、Caspase12、Bcl-2、Bad；

细胞自噬标志蛋白为LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、Atg3、Atg5、Atg7、Atg12；

细胞迁移标志蛋白为FAK、cofilin、profilin、CDC42、α-Tubulin；

蛋白质翻译标志蛋白为eIF2B、eIF4EBP1、p70S6K、mTOR、eIF4E、S6RP；

细胞干性标志蛋白为Oct3/4、SSEA-3/4/1、SOX2、Nanog、CD34、ABCG2、STRO-1、Nestin、PSA-NCAM、Sca-1、CD44、CD166、CD133；

细胞应激标志蛋白为HIF1、HIF2、P53、ATF4、HSP70、HSP90、ROS、Nrf2、ATF6。

作为上述微阵列芯片的优选，固体载体为醛基化修饰的玻片。

作为上述微阵列芯片的优选，微阵列芯片的固体载体上还列阵式固定有阳性对照蛋白的特异性抗体和/或阴性对照蛋白的特异性抗体。

一种制备检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片的方法，包括如下步骤：

按点间距离为300～400μm，点样量为350～450pL，将浓度为300～500μg/mL的特异性抗体溶液以列阵式点样于醛基化修饰的玻片上，室温干燥后，固定，封闭，孵育后，获得微阵列芯片。

作为上述方法的优选，醛基化修饰的方法是：将清洗干净的玻片用含4.0～6.0％(V/V)氨基甲氧基硅烷的乙醇溶液处理20～40min，干燥，再用含1.5～3.5％(V/V)戊二醛的PBS溶液处理50～70min，干燥，获得醛基化修饰的玻片。

一种检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片的试剂盒，含有上述微阵列芯片。

作为上述试剂盒的优选，还含有细胞裂解液、组织裂解液、稀释液、洗液、酶标二抗、发光底物中的一种或多种。

作为上述试剂盒的优选，所述稀释液为蛋白稳定剂；

和/或洗液为中性缓冲液；

和/或酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的二抗；

和/或发光底物为荧光素555。

细胞应激反应中蛋白表达的检测方法，包括如下步骤：

将待检细胞样品进行裂解，获得蛋白裂解液，点样于权利要求1～4任一项所述的微阵列芯片上，孵育，清洗；再加入酶标二抗，孵育，清洗；再加入发光底物，孵育，清洗；读取荧光信号，以阳性对照蛋白为内参，以内参为标准进行归一化处理，获得半定量检测结果。

本发明的有益效果是：

(1)本发明的微阵列芯片的组成上，选用了7类共计50个应激反应标志物，可同时检测包括细胞增殖、细胞凋亡、细胞迁移、细胞自噬、蛋白质翻译、细胞干性、细胞应激这些方面的蛋白表达，可以明确不同刺激条件下细胞应激反应应对的内部细胞蛋白表达的变化，从而实现快速筛选和评价，为广大科研人员提供更多的方向选择性；

(2)本发明的微阵列芯片选用醛基化修饰的玻片作为固体载体，采用氨基甲氧基硅烷和戊二醛先后进行氨基化和醛基化修饰，在玻片表面形成活化的醛基，与蛋白质的氨基缩合反应，形成共价键，使特异性抗体结合更稳定，活性更高。

(3)本发明经过微阵列点样设计，点样浓度的优选，二抗-发光底物多分子体系的构建等优化，制备成指标多、通量高、速率快的微阵列芯片，一次性能检测300个样品，且点样量低，仅需100μL，并且能够有效排除光谱芯片测试的假阳性和假阴性，提高检测的准确度，通过大量样本分析发现准确率大于82％；克服了WesternBlot、Elisa、免疫组化等检测指标单一的弊端，此外交叉反应测试显示芯片的指标测试灵敏度高、特异性好；

(4)本发明的微阵列芯片制备方法简便，检测快速，整个流程只需2天完成，并且制作成本较低，有广阔的产业化前景。

(5)本发明通过玻片的表面修饰、改善，制备得到一种新型的芯片，可以大大提高蛋白指标的吸附能力与亲和力。

附图说明

图1：肺癌细胞A549对顺铂刺激条件下凋亡标志蛋白表达量归一化处理结果，图中，A：WesternBlot测试结果；B：本发明微阵列芯片的测试结果；

图2：肝癌细胞Hep G2饥饿处理条件下自噬标志蛋白表达量归一化处理结果，图中，A：WesternBlot测试结果；B：本发明微阵列芯片的测试结果。

具体实施方式

以下实施例用以说明本发明，但不用来限制本发明范围。在不背离本发明精神和实质情况下，对本发明的方法、步骤、条件所做的修改或者替换，均属于本发明的范围。

本发明涉及的试剂的配方如下：

PBS溶液：3.58g Na₂HPO₄、0.25g>2PO₄、8g>

封闭液：0.1g BSA、100mL PBS；

1％PBST溶液：5mL Tween20、500mL PBS；

5％BSA溶液：5g BSA、100mL PBS。

荧光素555，购于Streptavidin,HiLyte Fluor^TM555>

辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，购于Jackson ImmunoResearch

实施例1、检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片的制备方法

(1)醛基化修饰的玻片的制备

用去离子水800mL加热到95℃，加入约洗衣粉5g，将新玻片浸泡在洗衣粉水中3h；取出玻片，用1mM的KOH去离子水溶液中浸泡1h；取出玻片，用去离子水清洗3次，每次5min，晾干，得到清洗干净的玻片；

将清洗干净的玻片用含5％氨基甲氧基硅烷(V/V)的乙醇溶液浸泡30min；取出玻片，用丙酮洗3次，每次5min；再用去离子水清洗3次，每次5min，氮气吹干，获得氨基化修饰的玻片；

将氨基化修饰的玻片用含2.5％戊二醛(V/V)的PBS溶液浸泡1h；取出玻片，用PBS洗3次，每次5min；再用去离子水清洗3次，每次5min，氮气吹干，获得醛基化修饰的玻片。

(2)芯片的点印

将应激反应标志物独立地特异性抗体(Sigma-Aldrich,USA)及阳性对照蛋白的特异性抗体及阴性对照蛋白的特异性抗体分别用PBS稀释至400μg/mL，吸取每个蛋白样品30μL加入到384孔板中，其中，三个正极分别是：200倍稀释的荧光素555、400倍稀释的荧光素555、800倍稀释的荧光素555，负极为PBS。用用点样仪(Nano-PlottertmNP 2.1)将独立地特异性抗体点样至准备好的醛基化修饰的玻片上，点样量为400pL，点间距离为400μm，矩阵情况如表1所示，点样操作完成后，将玻片置于室温干燥。

上述应激反应标志物为下述7类标志蛋白，其中：

细胞增殖标志蛋白为PCNA、Ki67、CyclinD1；

细胞凋亡标志蛋白为PRAP、Caspase 3、Caspase 9、Caspase 8、Caspase12、Bcl-2、Bad；

细胞自噬标志蛋白为LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、Atg3、Atg5、Atg7、Atg12；

细胞迁移标志蛋白为FAK、cofilin、profilin、CDC42、α-Tubulin；

蛋白质翻译标志蛋白为eIF2B、eIF4EBP1、p70S6K、mTOR、eIF4E、S6RP；

细胞干性标志蛋白为Oct3/4、SSEA-3/4/1、SOX2、Nanog、CD34、ABCG2、STRO-1、Nestin、PSA-NCAM、Sca-1、CD44、CD166、CD133；

细胞应激标志蛋白为HIF1、HIF2、P53、ATF4、HSP70、HSP90、ROS、Nrf2、ATF6。

阳性对照蛋白为GADPH、beta-actin；

阴性对照蛋白为BSA，Blue，biotin-protein；

每张芯片都有阴阳极作对照。

表1、微列阵芯片点样列阵分布示意表

Positive 1Casp3P62CDC42Positive 8STRO-1CD133Nrf2Positive 2Caps9Atg3α-TubulinOct3/4Positive 11Positive 14ATF6Positive 3Caps8Atg5Positive 7SSEA-3/4/1NestinHIF1Positive 15NegativeCasp12Atg7eIF2BSOX2Positive 12HIF2PCNABcl-2Atg12eIF4EBP1NanogPSA-NCAMP53Ki67BadPositive 6p70S6KPositive 9Sca-1ATF4CyclinD1Positive 5FAKmTORCD34Positive 13HSP70Positive 4LC3-1cofilineIF4EPositive 10CD44HSP90PARPLC3-2profilinS6RPABCG2CD166ROS

(3)微阵列芯片的后处理

将干燥好的玻片用16孔玻片孵化器固定，每孔加入100μL封闭液，孵育封闭30min；封闭完成后，除掉封闭液，甩干，即完成微阵列芯片的制备。

实施例2、检测细胞应激反应中蛋白表达的试剂盒的制备

一种检测细胞应激反应中蛋白表达的试剂盒，包括如下组分：(1)检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片、(2)细胞裂解液、(3)组织裂解液、(4)稀释液、(5)洗液、(6)酶标二抗、(7)发光底物；各组分的选择及作用如下：

(1)检测细胞应激反应中蛋白表达的微阵列芯片：优选为实施例1的微阵列芯片；

(2)细胞裂解液：含有Loading buffer，蛋白酶抑制剂，购于北京碧云天生物技术有限公司；

(3)组织裂解液，含有Loading buffer和pmsf，购于北京碧云天生物技术有限公司；

(4)稀释液：是蛋白稳定剂，本实施例为5％BSA溶液；作用是稀释待测蛋白至可检测浓度范围；

(5)洗液：是中性缓冲液，本实施例为1％PBST溶液，作用是在固体载体表面孵育蛋白样品及酶标二抗后，需用洗液清洗掉固体载体表面未结合的抗体和酶标二抗；

(6)酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的二抗，本实施例为辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG；作用是细胞蛋白中的应激蛋白可与固体载体上的一抗结合，二抗可与一抗结合；

(7)发光底物：本实施例为荧光素555，其作用是二抗上的标记物可与发光底物反应，从而发出可检测的光；

上述试剂盒能够快速、方便地检测细胞增殖、凋亡、自噬、增殖、迁移、蛋白质翻译、干性、应激相关标志蛋白表达的情况，通过大量样本分析发现准确率大于82％。

实施例3、细胞应激反应中蛋白表达的检测方法

细胞应激反应中蛋白表达的检测方法，包括如下步骤：

(1)利用组织裂解液和/或细胞裂解液，将待样品进行裂解，获得蛋白裂解液，用稀释液稀释至合适的检测浓度；

(2)在微阵列芯片上每孔加入100μL稀释的蛋白裂解液，常温孵育4h，去掉未反应蛋白裂解液样品，用洗液和PBS溶液分别清洗5次，甩干；

(3)在微阵列芯片上每孔加入100μL，1000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG，常温孵育4h，去掉未反应的酶标二抗溶液，用洗液、PBS分别清洗5次，甩干；

(4)在微阵列芯片上每孔加入100μL的1000倍稀释的荧光素555，避光孵育1h。去掉多余荧光素555，用洗液、PBS分别清洗5次，甩干；

(5)将玻片加载到扫描仪(LuxScanTM10K-B)内，设置扫描参数：Power＝100％、PMT＝550，读取荧光信号。

(6)以阳性对照蛋白为内参，以内参为单位进行归一化处理，获得半定量检测结果。

实施例4、本发明体系中增殖和凋亡、自噬标志蛋白指标交叉反应测试

由于交叉反应涉及的蛋白比较多，仅展示具有代表性的增殖和凋亡、自噬蛋白抗体的交叉反应测试结果，测试方法如下：抗体对时间的交叉反应的测试。不同抗体芯片首先与单个抗原(浓度150ng/mL)孵育培养，按照实施例3的洗片标准进行洗片。与每种抗原对应的检测抗体反应，经Cy3-链霉亲和素孵育，芯片扫描后读数。以每种抗原的捕获抗体为横轴，以加入抗原和对应检测抗体为纵轴绘图。

表2、增殖和凋亡标志蛋白抗体交叉反应的结果

抗体/抗原PCNAKi67CyclinD1PARPCasp3Caps9Caps8Casp12Bcl-2BadPCNA34512123132142999293153241215Ki6721428754270345298330321361353321CyclinD119220138134230258294201249251301PARP18310229423415284222304320341329Casp320115327111931289348602503559542Caps919818326314013234129421321298342Caps828115223113916221941093320184156Casp1224118222115616223930229120223234Bcl-219915329017213521231031032194169Bad21013230113014225122430134130123

表3、自噬标志蛋白抗体交叉反应的结果

抗体/抗原LC3-1LC3-2P62CDC42Atg3Atg5Atg7Atg7LC3-129021313430394403443242209LC3-243030120351372443393402432P6239239037120352282342309302CDC4232033132132102269376234332Atg342434235245234021403441345Atg539240236244229329210362346Atg734045342345623534540212432Atg1232134234246330928534938921

统计结果如表2和表3所示，每种抗体对可以特异地识别自己的检测抗原而与其他的抗原没有交叉反应。

实施例5、顺铂刺激条件下凋亡标志蛋白的检测

利用实施例3的检测方法及WesternBlot检测方法，将1.5μM顺铂刺激12h后的肺癌A549细胞样品进行检测，均以未刺激的肺癌A549细胞样品为对照。应激蛋白芯片结果数据用分析软件Gene Pro 6.0 software进行荧光信号读取，读取得到各个指标的处理前后的荧光信号值，以阳性对照蛋白GAPDH为内参，以内参为标准进行归一化处理，用Grapa6.0软件进行结果分析(t检验)。

结果示意如图1所示，图中A为本发明方法检测结果，图中B为WesternBlot检测结果，由于该细胞样本中Bcl-12指标表达较低，图中不做展示，与未刺激的对照组相比，两种检测方法均显示凋亡通路标志蛋白PARP下调，而标志蛋白Casp3、Casp8、Casp9、Caspase12、Bad则上调，并且本发明方法与WesternBlot检测结果差异不大，可以准确的反应应激反应蛋白的变化。

实施例6、饥饿处理条件下自噬标志蛋白的检测

利用实施例3的检测方法及WesternBlot检测方法，将饥饿处理12h后的肝癌Hep G2细胞样品进行检测，均以未饥饿处理的肝癌Hep G2细胞样品为对照。应激蛋白芯片结果数据用分析软件Gene Pro 6.0 software进行荧光信号读取，读取得到各个指标的处理前后的荧光信号值，以内参GAPDH为标准进行归一化处理，用Grapa6.0软件进行结果分析(t检验)。

结果示意如图2所示，图中A为本发明方法检测结果，图中B为WesternBlot检测结果，由于该细胞样本中其余4个指标表达较低，图中不做展示，与未刺激的对照组相比，两种检测方法均显示细胞自噬标志蛋白LC3-1、p62P下调，而标志蛋白LC3-Ⅱ则上调，并且本发明方法与WesternBlot检测结果差异不大，可以准确的反应应激反应蛋白的变化。