利用石蜡切片和扫描电镜对同一样品进行观察的方法

摘要

本发明公开了一种利用石蜡切片和扫描电镜对同一样品进行观察的方法，其为对样品石蜡包埋后进行组织切片，切片进行到样品对称轴，或根据观察组织切片结果来确定，然后将剩余的已经包埋好的样品蜡块经过脱蜡处理后再进行电镜扫描，获得样品切面的电镜扫描结果。本发明充分利用一份样品，不仅可以观察到样品内部的各种细胞形态，而且获得样品的电镜扫描结果，同时可以观察到组织的外部轮廓以及之中细微结构的高倍率、高分辨的三维像，这对研究植物形态发育将十分有利。

说明书

技术领域

本发明属于生物实验技术领域，具体涉及一种利用石蜡切片和扫描电镜对同一样品进行观察的方法。

背景技术

植物组织的石蜡切片和电镜扫描观察技术已经趋于成熟，而对一份样品的两种观察方法还并不常见。

石蜡切片是通过将生物组织切成薄片，然后通过光学显微镜观察获得组织切面轮廓以及组织中各种细胞的形态，所得的图像具有广视野、粗线条、大轮廓的特点，但是由于石蜡切片的图像为平面图像且光学显微镜放大的倍数有限(最大放大倍数1000倍)，很难对植物组织的整体形态、三维立体形态和亚细胞结构做观察。扫描电镜技术则能很好的弥补这一不足。扫描电镜技术通常是获得组织的外部形态，其结果具有很强的立体感，能获得三维结构图像，且分辨率极高，对植物组织和亚细胞结构的准确分辨十分有利。然而电镜扫描只能观察到组织表面的形态，对于组织内部的形态不能进行观察。

现有的技术方案是寻找两个发育状态相当的样品，分别用石蜡切片与扫描电镜来处理，以获得这两种观察结果。另一种方法是对已经做成石蜡切片的蜡带脱蜡处理后进行电镜扫描观察。然而，若是寻找两个发育状态相当的样品来进行处理，那么问题是不可能存在两个完全一致的样品，获得的只能是近似一致的结果，且对材料的浪费较大。若是利用对蜡带脱蜡进行处理，缺点在于只能获得切面的扫描图像，而不能看到石蜡切片的结果；同时因样片已经进行切片，所以无法获得植物组织的三维轮廓。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种利用石蜡切片和扫描电镜对同一样品进行观察的方法。

本发明提供的利用石蜡切片和扫描电镜对同一样品进行观察的方法，其为对样品石蜡包埋后进行组织切片，切片进行到样品对称轴，或根据观察组织切片结果来确定，然后将剩余的已经包埋好的样品蜡块经过脱蜡处理后再进行电镜扫描，获得样品切面的电镜扫描结果。

其中，所述的脱蜡处理为：将剩余样品置于二甲苯或叔丁醇中，浸泡二甲苯的样品置于40℃的恒温箱中，浸泡叔丁醇的样品置于60℃恒温箱中，3小时换新溶液，重复3次，第三次过夜；

将置于二甲苯中退蜡的样品转移到1/2二甲苯+1/2乙醇(100％)混合液中在40℃的恒温箱浸泡3小时，置于叔丁醇中退蜡的样品转移到1/2叔丁醇+1/2乙醇(100％)混合液中在40℃的恒温箱浸泡3小时，之后两种样品都需换成100％乙醇浸泡3小时，重复100％乙醇浸泡3小时，再将样品浸入乙酸异戊酯中；

将处理完的材料置于临界点干燥仪中进行临界点干燥。

本发明充分利用一份样品，不仅可以观察到样品内部的各种细胞形态，而且获得样品的电镜扫描结果，同时可以观察到组织的外部轮廓以及之中细微结构的高倍率、高分辨的三维像，这对研究植物形态发育将十分有利。

附图说明

图1所示为白玉兰种子石蜡切片光镜图像/200倍。

图2所示为石蜡切片后剩余样品经叔丁醇退蜡6h后的电镜扫描图像/200倍。

图3所示为同一样品经两种观察方法所得图像对比，左侧为电镜扫描的图像结果，右侧为石蜡切片的光学图像结果，图中的红框内为同一细胞/200倍。

图4所示为白玉兰种子石蜡切片图像/40倍。

图5所示为白玉兰种子石蜡切片图像/100倍。

图6所示为白玉兰种子石蜡切片图像/200倍。

图7所示为白玉兰种子石蜡切片图像/400倍。

图8所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图4为同一样品)叔丁醇退蜡3h/40倍。

图9所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图5为同一样品)二甲苯退蜡6h/100倍。

图10所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图6为同一样品)叔丁醇退蜡9h/200倍。

图11所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图7为同一样品)二甲苯退蜡3h/400倍。

图12所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图7为同一样品)二甲苯退蜡3h/1000倍。

图13所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图7为同一样品)二甲苯退蜡3h/2000倍。

图14所示为石蜡切片剩余样品的电镜扫描图像(与图7为同一样品)二甲苯退蜡3h/4000倍。

具体实施方式

以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1石蜡切片的制作

材料为白玉兰种子

1)固定：用FAA固定液(70％酒精：甲醛：冰乙酸＝90:5:5)，常温下固定24h。

2)脱水系列溶液浸泡，各试剂浸泡一天，按下表1-6的顺序。

3)浸蜡

恒温箱温度调至60℃，将样品置于玻璃瓶内，加入适量蜡屑，少量叔丁醇，加盖，两天后开盖，使叔丁醇挥发，浸蜡一周。

4)包埋

将液体蜡倒入铝盒内，置于展片机上防止凝固，展片机温度设定为60℃，将浸蜡一周的材料放入液体蜡中，在室温下缓慢凝固时用烧热的镊子上下挑动，使样品位于蜡块中央，表面凝固后将其置于冰袋上，3～5min后置于与冰袋同盆的水中。

5)修块、粘块

用小刀划蜡块表面，用手掰开，保证每个蜡块中仅有一个样品，再用小刀将蜡块边缘修整齐。取少量蜡屑熔化后倾倒在小木块的一面，将蜡块粘贴于其上，待冷却后将其置于切片机上修蜡块为梯形。

6)切片

在载玻片毛玻璃部分做好标记，同面光滑部分均匀涂少量蛋白贴剂，再滴适量蒸馏水，在切片机上将蜡块切为8～10μm的蜡带，取适当长度将其排列在载玻片上。在展片机上展片后用吸水纸吸去蒸馏水，然后在光学显微镜下至于40倍放大情况下镜检，根据镜检结果来控制样片切片的进度，直到切面位于样品对称线时停止切片，然后将展好的片子置于40℃烘箱中经行干燥，时间最好两天后，确保样品完全黏附于载玻片上。

7)染色

采用番红固绿对染。

8)封片

中性树脂封片。

9)石蜡切片的观察

将组织切片置于光学显微镜下观察并拍照。

结果见附图1，图3-7。

实施例2脱蜡方法与电镜扫描

浸泡式脱蜡：

1、脱蜡--试剂：二甲苯或叔丁醇

将石蜡切片剩余的样品分为2组，一组用二甲苯浸泡，置于40℃恒温箱内；另一组用叔丁醇浸泡，置于60℃恒温箱内，浸泡的时间设定为3小时，6小时和9小时，每个时间段两个样品重复三次。

2、过渡到乙酸异戊酯

3、临界点干燥

将材料置于临界点干燥仪中进行临界点干燥

4、电镜扫描

结果见附图2-3，图8-14。

在观察电镜扫描图像时发现许多细胞空腔，细胞内容物丢失较多，且细胞收缩的比例较大。依据比例尺对不同处理下的细胞收缩率(细胞原有长度/细胞变形后长度)进行了测量，结果如下：

表1

表1为利用叔丁醇(40℃)和二甲苯(60℃)下对样品进行退蜡处理3h，6h和9h的细胞收缩率表。其中二甲苯随着处理时间的增长，收缩比率增大。而叔丁醇是3小时的细胞收缩最小，6小时的最大，9小时处于3小时和6小时之间。但就总的效果是，处理时间为3小时的细胞收缩率是最小的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。