泡盛曲霉菌株及其在农业害虫防治领域的用途

摘要

本发明涉及泡盛曲霉菌株及其在农业害虫防治领域的用途，属于生物农药技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种可应用在生物治蝗中的泡盛曲霉菌株。该泡盛曲霉菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.13363。本发明的泡盛曲霉菌株及其代谢物，能够杀灭蝗虫，对东亚飞蝗具有较强的致死作用，在生物农药领域有广泛的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及泡盛曲霉菌株及其在农业害虫防治领域的用途，属于生物农药技术领域。

背景技术

蝗虫，俗称“蚂蚱”，属直翅目，包括蚱总科(Tetrigoidea)、蜢总科(Eumastacoidea)、蝗总科(Locustoidea)的种类，全世界有超过10,000种，我国有1000余种，分布于全世界的热带、温带的草地和沙漠地区。蝗虫主要包括飞蝗和土蝗。在我国飞蝗有东亚飞蝗(Locusta migratoria manilensis(Meyen))、亚洲飞蝗(Locusta migratoriamigratoria(Linnaeus))和西藏飞蝗(Locusta migratoria tibitensis Chen)3种，其中东亚飞蝗在我国分布范围最广，为害最严重，是造成我国蝗灾的最主要飞蝗种类。

多年来草原蝗虫一直采用化学农药防治，对迅速控制蝗害的发生、扩散起到了积极作用。但化学农药治蝗存在成本高、用量大、安全性差等弊端，且大量使用易造成人畜中毒、污染草原、杀灭蝗虫天敌从而危害草原生态环境，破坏生态平衡。因此生物防治技术是目前草原灾害综合治理的积极有效的措施。生物治蝗是使用生物药剂，通过保护和利用蝗虫自然天敌或释放人工培育出来的专对蝗虫的寄生性天敌的方法来控制蝗虫的危害，如施用对蝗虫有极强杀伤力的蝗虫微孢子虫、绿僵菌等。生物治蝗不但可以有效控制蝗害，而且不杀伤天敌、对环境友好、对人畜安全，具有十分广阔的应用前景。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种泡盛曲霉菌株，该真菌可应用在生物治蝗中。

本发明泡盛曲霉菌株，命名为scuhtp-T9，拉丁命名为Aspergillus awamori，为从四川甘孜州和乌鲁木齐大河北山采集距离地表3～6cm的土样中分离得到新菌株。该菌株已于2017年01月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13363，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的孢子。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物的乙醇提取物。

优选的，该乙醇提取物采用如下方法制备得到：将泡盛曲霉的真菌发酵液过滤、离心，获得上清液；然后加入乙醇，室温冷浸20～30h后，40～60℃搅拌浸提5～8h后抽滤，得到提取液，浓缩成膏状，即得乙醇提取物。

作为优选方案，室温冷浸24h，50℃搅拌浸提6h后抽滤。

进一步的，所述真菌发酵液优选通过将泡盛曲霉在26℃振荡培养7～14天获得。

本发明还提供一种杀虫剂，含有上述的泡盛曲霉菌株、上述的泡盛曲霉菌株的孢子、上述泡盛曲霉菌株的代谢产物、上述泡盛曲霉菌株的代谢产物的乙醇提取物中的至少一种。

优选的，所述杀虫剂用于杀灭蝗虫。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株或上述泡盛曲霉菌株的孢子在杀灭蝗虫中的应用。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物在杀灭蝗虫中的应用。

本发明的泡盛曲霉菌株及其代谢物，能够杀灭蝗虫，对东亚飞蝗具有较强的致死作用，在生物农药领域有广泛的应用前景。

附图说明

图1为泡盛曲霉菌株的菌株形态学照片。

具体实施方式

本发明泡盛曲霉菌株，拉丁命名为Aspergillus awamori，是从四川甘孜州和乌鲁木齐大河北山采集距离地表3～6cm的土样中分离得到新菌株。该菌株已于2017年01月03日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.13363，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本发明泡盛曲霉，培养初期的菌落为淡黄色，中央带黄色，后转为黑褐色，棉絮状，无渗出液，菌落背面为黄色。

采用18S rDNA序列测序，结果在GenBack数据库中进行同源性比对，菌株与Aspergillus awamori亲源关系最近，结合形态生理生化活性分析，初步鉴定该菌株为Aspergillus awamori泡盛曲霉，真菌界，真菌门，半知菌亚门，半知菌纲，壳霉目，杯霉科。

本发明泡盛曲霉菌株，可以通过下述方法筛选得到：

1、菌源采自四川甘孜州和乌鲁木齐大河北山采集距离地表3～6cm的26份土样中；培养基选用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，无水葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml；

2、准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。配制成一系列浓度梯度土壤稀释液，再各吸取1ml用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，26℃在真菌培养箱中培养5-10天。多次分离纯化后获得单菌落。

3、菌株的鉴定

1)菌体形态鉴定:将菌株在PDA固体培养基上进行划线培养，并将盖玻片以45°角插入培养基中，培养7d后获得生长有菌丝体的盖玻片，将其用2.5％的戊二醛溶液固定后，PBS缓冲液进行洗涤，梯度脱水并经CO₂临界点干燥，表面喷金后，用日立H-7650扫描电子显微镜观察其菌体形态并照相。其图片见图1。

2)真菌ITS(非转录序列)分析：18S rDNA序列的扩增采用：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，以真菌总DNA为模板，反应程序如下：95℃变性5min；95℃30sec；55℃30sec；72℃1min；35个循环；72℃10min；4℃保存。得到的18S rDNA序列登陆GenBack，进行blast比对。经过对比发现：根据blast结果，T9与Aspergillus awamori亲源关系最近，结合形态生理生化活性分析，初步鉴定菌株为Aspergillus awamori。

本发明所述泡盛曲霉菌株的ITS序列为：TCCGAGGTCACCTGGAAGAATGGTTGGAAAACGTCGGCAGGCGCCGGCCAATCCTACAGAGCATGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGATCGGACGCGGTGCCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCCCCCCGGAGAGGGGGACGGCGACCCAACACACAAGCCGGGCTTGAGGGCAGCAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATACCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACATTAGTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAACTGATTGCATTCAATCAACTCAGACTGCACGCTTTCAGACAGTGTTCGTGTTGGGGTCTCCGGCGGGCACGGGCCCGGGGGGCAGAGGCGCCCCCCCGGCGGCCGACAAGCGGCGGGCCCGCCGAAGCAACAGGGTACAATAGACACGGATGGGAGGTTGGCCCAA。

本发明还提供本发明上述泡盛曲霉菌株的孢子。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物的乙醇提取物。

优选的，该乙醇提取物采用如下方法制备得到：将泡盛曲霉的真菌发酵液过滤、离心，获得上清液；然后加入乙醇，室温冷浸20～30h后，40～60℃搅拌浸提5～8h后抽滤，得到提取液，浓缩成膏状，即得乙醇提取物。

作为优选方案，室温冷浸24h，50℃搅拌浸提6h后抽滤。

进一步的，所述真菌发酵液优选通过将泡盛曲霉在26℃振荡培养7～14天获得。

具体的，该代谢产物的乙醇提取物可优选通过如下方法获得：将分离得到的真菌接种到500ml含有250ml无菌液体PDA培养基中，165r/min，26℃摇床振荡培养7～14天获得真菌发酵液80L。使用滤纸过滤和4℃，10000转/分钟离心获得发酵液上清液。按照发酵液和溶剂1：3(W/V)的比例加入无水醇，室温冷浸24h后抽滤，得到深褐色乙醇提取液，如此浸提3次，合并乙醇提取液经旋转蒸发仪浓缩后制备得深褐色膏状乙醇粗提物。

本发明还提供一种杀虫剂，含有上述的泡盛曲霉、上述泡盛曲霉的孢子、上述泡盛曲霉的代谢产物、上述泡盛曲霉的代谢产物的乙醇提取物中的至少一种。

优选的，所述杀虫剂用于杀灭蝗虫。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株或上述泡盛曲霉菌株的孢子在杀灭蝗虫中的应用。

本发明还提供上述泡盛曲霉菌株的代谢产物在杀灭蝗虫中的应用。

下面结合实施例对本发明的具体实施方式做进一步的描述，并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。

实施例1泡盛曲霉的分离筛选及鉴定

1、培养基

马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)：马铃薯200g，无水葡萄糖20g，琼脂粉20g，蒸馏水1000ml。

2、菌株的筛选及纯化

(1)菌种来源

菌源采自四川甘孜州和乌鲁木齐大河北山采集距离地表3～6cm的26份土样中。

(2)菌株的分离纯化

准确称取土样10g，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，振荡约20min，使土样与水充分混匀，将细胞分散。配制成一系列浓度梯度土壤稀释液，再各吸取1ml用无菌玻璃涂棒将菌液在平板上涂抹均匀，26℃在真菌培养箱中培养5～10天。多次分离纯化后获得单菌落。

3、菌株的鉴定

(1)形态学鉴定

将菌株在PDA固体培养基上进行划线培养，并将盖玻片以45°角插入培养基中，培养7d后获得生长有菌丝体的盖玻片，将其用2.5％的戊二醛溶液固定后，PBS缓冲液进行洗涤，梯度脱水并经CO₂临界点干燥，表面喷金后，用日立H-7650扫描电子显微镜观察其菌体形态并照相。其照片见图1。

2)真菌ITS(非转录序列)分析

18S rDNA序列的扩增采用：ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，以真菌总DNA为模板，反应程序如下：95℃变性5min；95℃30sec；55℃30sec；72℃1min；35个循环；72℃10min；4℃保存。PCR由北京六合华大基因科技有限公司完成。得到的18S rDNA序列登陆GenBack，进行blast比对。经过对比发现：根据blast结果，T9与Aspergillus awamori亲源关系最近，结合形态生理生化活性分析，初步鉴定菌株为Aspergillus awamori。

实施例2泡盛曲霉真菌发酵液及泡盛曲霉代谢产物的制备

将分离得到的真菌接种到500ml含有250ml无菌液体PDA培养基中，165r/min，26℃摇床振荡培养7～14天获得真菌发酵液80L。

使用滤纸过滤和4℃，10000转/分钟离心获得发酵液上清液。按照发酵液和溶剂1：3(W/V)的比例加入95％乙醇，室温冷浸24h后，50℃水浴搅拌浸提6h后抽滤，得到深褐色乙醇提取液，如此浸提3次，合并乙醇提取液经旋转蒸发仪浓缩后制备得深褐色膏状乙醇粗提物，即泡盛曲霉代谢产物。

试验例1泡盛曲霉真菌孢子杀虫活性测定

用无菌刮片将菌株分生孢子粉刮入0.05％吐温-80无菌水中，配成浓度为3×10⁹孢子/mL的孢悬液，并稀释成3×10⁸、3×10⁷、3×10⁶、3×10⁵、3×10⁴、3×10³孢子/mL浓度梯度，以蝗虫的3龄若虫为试虫，采用浸草法，喂养草料放入供试孢子悬液内浸3s，取出晾干后放入饲养笼中将15头接种后的若虫放入纱笼(25cm×25cm×30cm)内，置于光照培养箱(中饲养，培养箱温度设定为30℃、相对湿度为90％。每个组合处理以0.05％吐温-80无菌水为阴性对照。每天定时观察各处理若虫的感染反应，记录死亡虫数，并对死亡虫体进行保湿培养(28℃，RH90％)，连续观察8d。每处理复3次。按公式计算试虫的死亡率、校正死亡率和致死中浓度(LC₅₀)。其结果见表1和表2。

死亡率(％)＝死亡数/供试虫数×100％；

校正死亡率(％)＝(处理组死亡率±阴性对照组死亡率)/(100±阴性对照组死亡率)×100％。

表1

表2

试验例2代谢产物杀虫活性测定

使用实施例2制备的乙醇粗提物，溶解在0.05％吐温-80无菌水中制得不同浓度的提取液，以3龄蝗蝻为试虫，采用浸草法，喂养草料放入提取液内浸3s，取出晾干后放入饲养笼中将15头接种后的若虫放入纱笼(25cm×25cm×30cm)内，置于光照培养箱中饲养，培养箱温度设定为30℃、相对湿度为90％。每个组合处理以0.05％吐温-80无菌水为阴性对照，以溴氰菊酯药剂为阳性对照。每天定时观察各处理若虫的感染反应，记录死亡虫数，并对死亡虫体进行保湿培养(28℃，RH90％)，连续观察3d。每处理复3次。

按公式计算试虫的死亡率、校正死亡率和致死中浓度(LC₅₀)。其结果见表3和表4。

死亡率(％)＝死亡数/供试虫数×100％；

校正死亡率(％)＝(处理组死亡率±阴性对照组死亡率)/(100±阴性对照组死亡率)×100％。

表3

表4