星毛冠盖藤中香豆素类成分的含量测定方法

摘要

本发明公开了一种星毛冠盖藤中香豆素类成分的含量测定方法，其含量检测采用高效液相色谱法进行，对香豆素类成分茵芋苷、7‑羟基香豆素、7‑羟基‑8‑甲氧基香豆素进行含量检测，采用的色谱条件为色谱柱：C18（5μm，250×4.6mm）；检测波长：320nm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10μL。本测定方法操作简单、准确度高、重复性好。

说明书

技术领域

本发明属于中药技术领域，具体涉及一种星毛冠盖藤中香豆素类成分的含量测定方法。

背景技术

从目前抗肿瘤药物研究发展的趋势来看，国内外在寻找抗肿瘤药物的这方面已经做了不少的研究工作，也取得了一定的成果，已经寻找并开发出了一些具有较好抗肿瘤作用的药物，但是总的来说研究开发出高效、不良反应较小的药物数量不多，尚不能满足临床上肿瘤患者的需求。同时，尚未能开发出对于治疗肿瘤具有特效的药物。利用现有的医药研究技术，加大对具有抗肿瘤作用的天然产物进行筛选，力争能开发出高效、低毒的抗肿瘤药物，不光是广大肿瘤患者的迫切需求，也是广大医药研究工作者的重点攻关方向之一。我们应加大对民间秘方、验方的筛选研究工作，从中寻找出具有更好疗效，甚至具有特效的抗肿瘤药物。

星毛冠盖藤（Pileostegia tomentella Hand.Mazz.）为绣球花科冠盖藤属植物，其药材名为消瘤藤，《中华本草》、《广西药用植物名录》、《广西植物志》均将其收载，但只作为同属植物冠盖藤的替代品，记录其具有祛风除湿，散瘀止痛，消肿解毒的功效，目前国内外尚无任何关于星毛冠盖藤药理活性的相关文献报道。消瘤藤为目前全国唯一一所国家事业性、公益性、非营利性的瑶医药特色医院--广西金秀瑶族自治县瑶医医院肿瘤科用于治疗各种肿瘤的主药。虽然抗肿瘤疗效显著，但其主要依靠民间验方，缺乏科学规范的用药指导。

目前关于星毛冠盖藤的研究主要在粗物质的提取、分离方面，如经检索，有以下文献对其进行了研究：

文献一：作者肖冰梅、佘朋桂、李咏梅等在2012年13期《中国实验方剂学杂志》，发表文章《星毛冠盖藤的质量研究》，研究采用2010年版《中国药典》方法对星毛冠盖藤进行了水分、灰分及浸出物含量检测，考察提取方法及提取时间对浸出物含量的影响；以70%乙醇回流提取总黄酮，芦丁为对照品采用紫外分光光度法进行含量测定。结果：水分含量为10.8%，总灰分为5.2%,酸不溶灰分为1.2%，水溶性浸出物含量以回流方法提取40 min最高，提取率达13.45%，醇溶性浸出物以回流方法提取60 min最高，提取率为11.09%；总黄酮含量为0.39%，回收率102.7%,RSD 1.76%。

文献二：作者王云卿、马国需、梁琼平等在2016年24期《中草药》杂志，发表的《瑶药“肿瘤藤”星毛冠盖藤)的化学成分研究》，用各种色谱方法对星毛冠盖藤藤茎90%甲醇提取物进行分离纯化，结合波谱技术与化学方法进行结构鉴定。结果从星毛冠盖藤藤茎的90%甲醇提取物中分离鉴定了16个化合物，分别鉴定为落干酸(1)、4-O-α-L-阿拉伯呋喃糖基-(1→6)-β-D-吡喃葡糖苷(4S)-4-羟基-β-紫罗兰酮(2)、间苯二酚(3)、祖师麻乙素(4)、茵芋苷(5)、伞形花内酯(6)、断马钱子苷半缩醛内酯(7)、邻苯二甲酸二乙酯(8)、裂环马钱素(9)、裂环马钱素二缩醛(10)、当药苷(11)、foliasalacioside B(12)、苄基-O-β-D-呋喃芹糖基-(1″→6′)-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)、麦芽糖(14)、葡萄糖(15)、胡萝卜苷(16)。

文献三：作者：李咏梅、佘朋桂和肖冰梅在《药物研究》中发表《星毛冠盖藤不同药用部位的高效液相色谱分析》，研究通过对星毛冠盖藤不同药用部位70%乙醇提取，使用不同比例甲醇和乙腈系统等度洗脱，使用高效液相色谱法对药用各部位均有较好的分离效果，结论表明：仅茎枝含有芦丁。

文献四：作者：谢金攀、谢裕安、杨帆、梁琼平和庞赵生等在《中药方剂》杂志发表《星毛冠盖藤中总黄酮超声乙醇浸提工艺的优化》，研究发现最优方案为：在40℃水浴，超声功率100W的条件下，加入20倍量65%乙醇，室温下浸泡星毛冠盖藤3h，超声提取50min，可以达到最佳效果。

可以看出，以上研究并未对抗肿瘤成分香豆素类物质进行相关研究，而对星毛冠盖藤中的香豆素类成分进行含量测定，有助于进一步科学的开发该药材。

发明内容

本发明的目的是针对以上问题，提供一种星毛冠盖藤中香豆素类成分的含量测定方法，以此进一步科学、系统开发星毛冠盖藤中抗肿瘤活性成分，为资源利用和临床应用提供科学依据。

研究表明，茵芋苷具有治疗肾功能不全方面的活性，7-羟基香豆素对人膀胱癌细胞系E-J细胞株增殖具有抑制作用。相关文献：[1] 薛清春.远志属植物瓜子金根的化学成分研究及茵芋苷的合成研究[D].北京：中国协和医科大学，2009；[2] 杨秀伟，徐波，冉福香，等.11种香豆素类化合物对人膀胱癌细胞系E-J细胞株生长抑制活性的筛选[J].结合医学学报，2007，5(1)：56-60

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明星毛冠盖藤中香豆素类成分的含量检测方法，采用高效液相色谱法同时测定星毛冠盖藤中茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量，具体方法如下：

（1）色谱条件与系统适用性试验。

所述色谱条件为：色谱柱：C18（5μm，250×4.6mm）；检测波长：320nm；流动相：流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱；柱温：25℃；流速：1.0 ml/min；进样量：10μL。

所述梯度洗脱程序为：0~30min，流动相A的体积分数从5%线性到变化到40%；30~31min，流动相A的体积分数从40%线性变化到5%，31~40min，流动相A的体积分数保持在5%。具体洗脱程序见表1：

（2）对照品溶液的制备：精密称取茵芋苷对照品、7-羟基香豆素对照品和7-羟基-8-甲氧基香豆素对照品，加甲醇超声溶解并制备成对照品溶液，浓度分别为：茵芋苷0.1032mg/ml，7-羟基香豆素0.1022mg/ml和7-羟基-8-甲氧基香豆素0.1112mg/ml。

（3）供试品溶液的制备：精密称取星毛冠盖藤药材粉末1g，置于150ml锥形瓶中，精密加入80%的甲醇(v/v)25ml，称定重量，加热回流提取60min，用80%甲醇(v/v)补足减失的重量，溶液过滤，精密量取续滤液2ml置10ml量瓶中，用80%甲醇(v/v)定容至刻度，摇匀，即得供试品溶液。

（4）测定供试品溶液中茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量：采用对照品溶液绘制进样量—色谱峰面积的标准曲线，测定星毛冠盖藤中三种成分的色谱峰面积，并利用标准曲线计算出茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量即可。

所述步骤（1）系统性试验研究如下：

一、线性关系考察

分别精密吸取混合对照品溶液各0.1、0.2、0.5、1、2、5ml置10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度。按步骤(1)所述色谱条件测定，进样10μL，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，经线性回归处理得茵芋苷的回归方程为：Y=20.30956X+2.12117，r=0.9999，线性范围为0.0103～1.032μg；7-羟基香豆素的回归方程为：Y=53.22705X+21.84810，r=0.9999，线性范围为0.0102～1.022μg；7-羟基-8-甲氧基香豆素的回归方程为：Y=39.41803X+5.75058，r=0.9999，线性范围为0.0111～1.112μg。

二、精密度试验

精密吸取星毛冠盖藤供试品溶液10μL，连续进样6次，测定峰面积，结果见表2，茵芋苷平均峰面积值为946.80，RSD为0.13%，7-羟基香豆素平均峰面积值为331.25，RSD为0.06%，7-羟基-8甲氧基香豆素平均峰面积值为110.27，RSD为0.09%，表明仪器精密度良好。

三、重复性试验

取同一批药材粉末6份，每份1g，精密测定，按最终确定提取方法进行制备，测定峰面积并计算星毛冠盖藤中茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量，茵芋苷平均含量为4.86mg/g，RSD为1.61 %，7-羟基香豆素平均含量为0.57mg/g，RSD为1.51%，7-羟基-8甲氧基香豆素平均含量为0.22mg/g，RSD为1.50%。表明本法重复性良好，结果见表3。

四、稳定性试验

取供试品溶液，每次精密吸取10μL，分别于1，2，4，6，12 h进样，测定其峰面积值并计算含量，结果见表4，在24h内测定药材的峰面积并计算茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量，茵芋苷平均含量为4.83mg/g，RSD为1.01 %，7-羟基香豆素平均含量为0.57mg/g，RSD为1.58%，7-羟基-8甲氧基香豆素平均含量为0.22mg/g，RSD为0.79%。表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

五、加样回收试验

精密称定已测定含量( 每g中含茵芋苷4.86mg、7-羟基香豆素0.57mg、7-羟基-8-甲氧基香豆素0.22mg) 的药材粉末6份，每份约0.5g，精密称定，另精密称取茵芋苷对照品22.69mg，7-羟基香豆素对照品2.70mg，7-羟基-8-甲氧基香豆素对照品1.21mg，置200mL量瓶中，加适量80%甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。分别在上述6份药材中加入混合对照品储备液25mL，按供试品制备方法制备，分别进样10ul，记录茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的峰面积并计算回收率，结果见表5、6、7。

本发明的有益效果是：

本发明对星毛冠盖藤中香豆素类成分：茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量测定方法，分别对对照品溶液及供试品溶液在本发明色谱条件下进行以上成分的色谱分析，并通过成分的峰面积响应值的线性关系、精密度、稳定性、重复性及加样回收率等方面的测定，从而掌握星毛冠盖藤中香豆素类成分含量的测定方法。本测定方法操作简单、准确度高、重复性好，值得在星毛冠盖藤中香豆素类成分含量测定方面推广应用，为进一步开发该药材资源提供了科学依据。

附图说明：

附图1：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱程序图。图1中曲线，1、茵芋苷， 3、7-羟基香豆素， 4、7-羟基-8甲氧基香豆素。

附图2：茵芋苷标准曲线图。

附图3：7-羟基香豆素标准曲线图。

附图4：7-羟基-8-甲氧基香豆素标准曲线图。

附图5：对照品和供试品的HPLC色谱图。图5中：对照品和供试品HPLC色谱图（A.混合对照品色谱 B.星毛冠盖藤样品色谱图。

具体实施方式

实施例1

采用HPLC法同时测定星毛冠盖藤中茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量：

1、所用材料、仪器和试药如下：

1.1取广西金秀瑶族自治县金秀镇、桐木镇、三角乡和大樟乡4批星毛冠盖藤药材粉末进行香豆素类成分含量测定。

1.2实验仪器

Agilent1206高效液相色谱仪配DAD检测器（美国安捷伦科技有限公司）AG-204电子分析天平（METTLER TOLEDO）；HH-S₆数显恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；MilliporeSimplicity-UV超纯水器(美国密里博)。

1.3试药

茵芋苷对照品（上海源叶生物科技有限公司，批号R14M7F11135，含量以98%计），7-羟基香豆素（中国药品生物制品检定所，批号111739-200501），7-羟基-8-甲氧基香豆素由广西中医药研究院提供，含量经归一化法测定为100%；液相用水为超纯水，甲醇、乙腈（Fisher，色谱纯），磷酸（国药集团化学试剂有限公司，优级纯），提取用甲醇（国药集团化学试剂有限公司，分析纯），水为纯净水。

色谱条件选择

2.1检测波长的选择

取混合对照品适量，进样，用DAD检测器在210～400nm波长范围扫描，结果显示茵芋苷最大吸收波长为318nm，7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素最大吸收波长为322nm，测定中要选择一个能同时最大检出3种成分，故在最大吸收波长±2nm处选择320nm为测定波长。

2.2流动相条件选择

分别比较甲醇-0.2%磷酸水溶液（15:85）、乙腈-0.2%磷酸水溶液（15:85）、乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，结果显示，用甲醇-0.2%磷酸水溶液系统峰展宽，宜用乙腈-0.2%磷酸水溶液系统，但三种成分极性相差较大，用等度洗脱用时较长，故改用梯度洗脱，7-羟基香豆素和7-羟基-8-甲氧基香豆素极性相近，洗脱程序分离度不好，调整洗脱程序，以乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱程序效果最好。

2.3色谱条件的确定

色谱柱：C18（5μm，250×4.6mm）；

检测波长：320nm；

流动相：乙腈-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，洗脱程序见表3；

柱温：25℃；

流速：1.0ml/min；

进样量：10μL。

标准曲线的配制

3.1供试品溶液的制备

精密称取茵芋苷对照品10.53mg， 7-羟基香豆素对照品10.22mg、7-羟基-8-甲氧基香豆素对照品11.12mg，分别置10ml量瓶中，加适量甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，再分别精密量取三种对照品贮备液1.0ml，置10ml量瓶中，用甲醇定容，即得混合对照品溶液（每1ml溶液中含茵芋苷0.1032mg，7-羟基香豆素0.1022mg，7-羟基-8-甲氧基香豆素0.1112mg）。

分别精密吸取混合对照品溶液各0.1、0.2、0.5、1、2、5ml置10ml容量瓶，用甲醇定容至刻度。按2.3项色谱条件测定，进样10μL，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，经线性回归处理得茵芋苷的回归方程为：Y=20.30956X+2.12117，r=0.9999，线性范围为0.0103～1.032μg；7-羟基香豆素的回归方程为：Y=53.22705X+21.84810，r=0.9999，线性范围为0.0102～1.022μg；7-羟基-8-甲氧基香豆素的回归方程为：Y=39.41803X+5.75058，r=0.9999，线性范围为0.0111～1.112μg。

单因素实验

4.1 提取方法考察

取星毛冠盖藤粉末2份，每份约2g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，分别采用加热回流、超声两种提取方法提取1h，溶液过滤，续滤液用0.45μm的滤膜过滤至样品瓶中，按上述的色谱条件进行HPLC分析。结果显示，回流提取效果更佳，故选回流。

4.2 溶剂浓度考察

取星毛冠盖藤粉末6份，每份约2g，精密称定，置于锥形瓶中，分别精密加入5%、20%、50%、80%、95%、100%甲醇各25ml，加热回流提取1h，溶液过滤，续滤液用0.45μm的滤膜过滤至样品瓶中，按上述的色谱条件进行HPLC分析。实验结果显示，80%甲醇的提取消瘤藤成分的提取率最高，最后选定80%甲醇提取。

4.3 提取时间考察

取星毛冠盖藤药材粉末4份，每份约1g，精密称定，置于锥形瓶中，分别精密加入80%甲醇各25ml，分别加热回流提取15min、30min、60min、120min，溶液过滤，续滤液用0.45μm的滤膜过滤至样品瓶中，按上述的色谱条件进行HPLC分析，实验结果显示，加热回流60min提取消瘤藤成分的提取率最高，故选加热回流60min。

提取方法的确定

取星毛冠盖藤药材粉末约1g，精密称定，置于150ml锥形瓶中，精密加入80%甲醇25ml，称定重量，加热回流提取60min，用80%甲醇补足减失的重量，溶液过滤，精密量取续滤液2ml置10ml量瓶中，用80%甲醇定容至刻度，摇匀，即得。

样品含量测定

测定供试品溶液中茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量：采用对照品溶液绘制进样量—色谱峰面积的标准曲线，测定星毛冠盖藤中三种成分的色谱峰面积，利用标准曲线计算出茵芋苷、7-羟基香豆素、7-羟基-8-甲氧基香豆素的含量，结果见表8。