一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法

摘要

本发明公开了一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，以洋葱鳞茎内表皮等植物表皮作为支架材料，具有无毒、免疫原性小，生物相容性好，透明度高，具有一定的机械强度，可塑性好，价格低廉，易取材等优点，细胞在植物表皮上的增殖速度与现有支架材料相近，且角膜上皮细胞能够在植物表皮上形成上皮样结构，细胞排列紧密，说明植物表皮为细胞提供了良好的增殖和分化基础，优于现有的组织工程支架材料。

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法。

背景技术

组织工程材料是组织工程的基础，构建组织工程的支架材料可以为细胞提供增殖和分化的基础，支架材料的特性决定了构建成的组织的形态。近年来，人们一直在寻找具有良好生物相容性、机械性能较好、透光性强的适合作为构建组织工程角膜的支架材料。目前使用的支架材料主要有生物、人工合成、复合材料，另外还有免支架的培养方法。使用最成熟的材料为羊膜，但羊膜的使用存在处理不当和传播疾病的风险；胶原是应用眼表重建的天然可降解材料，但其稳定性差、降解快限制了它的发展；壳聚糖是另一种天然支架材料，由于壳聚糖大分子具有稳定的环状结构，存在较强的氢键相互作用，溶解性差，所以在组织工程支架材料中应用也较少。人工合成的高分子材料如聚乳酸(PLA)和聚羟基乙酸(PGA)具有良好的生物相容性，可以发生非酶性水解，但是亲水性较差，体内代谢过程不完全清楚，可引起炎症反应、局部酸性产物堆积等，要作为组织工程角膜的支架材料，还需要深入研究。总之，目前的生物材料组织相容性好，但是可塑性不佳；人工合成材料的机械性能好，但会有细胞毒性；复合材料集合了生物材料和人工合成材料的优点，但其产生的新特性尚需进一步研究。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种以植物表皮作为组织工程支架材料的细胞培养方法，从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，将细胞接种于铺展开的该植物表皮上进行培养。所述植物表皮可以来源于多种植物，只要易于分离成单层细胞结构的膜状，且具有一定的物理强度及韧性，符合组织工程材料的要求即可。例如百合科葱属植物，多具有鳞茎，如洋葱、大葱等，较易分离得到符合要求的表皮。

一实施例中：从植物上分离出膜状的具有单层细胞结构的植物表皮，消毒灭菌；然后将植物表皮铺展固定在已去除了膜的细胞培养小室底部，得到植物表皮支架；将细胞接种于该植物表皮支架上进行培养。

一实施例中：将所述植物表皮支架置于培养基中，将细胞接种于该植物表皮支架上，进行培养；在细胞融合率小于100％时，采用浸没培养法，每隔1～3天换液；当细胞融合率至100％时，改用气液界面培养法培养。

一实施例中：所述气液界面培养法为：将植物表皮支架置于培养孔板中，在每个植物表皮支架中加入培养基，另在培养孔板中每孔加入培养基，并使植物表皮处于气液界面处；每隔1～3天换液。

一实施例中：所述细胞接种量为3～8×10⁴个/cm²。

一实施例中：所述细胞为角膜上皮细胞。

一实施例中：所述角膜上皮细胞为原代角膜上皮细胞，其制备方法如下：

a)冲洗干净待取材的动物结膜囊，取角膜，漂洗后放入培养基中；除去角膜上带有的结膜及巩膜部分；

b)将步骤a)得到的角膜浸没于含有1.5～2.5mg/mL Dispase II的培养基中，0～5℃下消化12～18h，以分离出角膜上皮片；

c)消化结束后，分离角膜上皮片，并将其用0.2～0.3％胰酶在35～38℃消化10～25min，终止消化，混合均匀，离心，去除上清，沉淀用培养基混合均匀，得到角膜上皮细胞液，用于接种在所述植物表皮支架上。

一实施例中：所述培养基为SHEM培养基。

一实施例中：所述植物表皮为洋葱鳞茎内表皮。

一实施例中：所述细胞为原代角膜基质细胞、乳腺癌细胞、小鼠成纤维细胞、人角膜上皮细胞系、人脐静脉内皮细胞系。

本发明的方法应在严格的无菌条件下进行。

本技术方案与背景技术相比，它具有如下优点：

1.从植物上分离得到的膜状的具有单层细胞结构的植物表皮是一层轻薄半透明的膜，仅一层细胞结构，由短而结实的细胞紧致地排列在晶格中形成，以洋葱鳞茎内表皮为例，通过撕取即可获得，容易分离得到。将洋葱鳞茎内表皮等植物表皮作为组织工程的支架材料，具有无毒、免疫原性小，生物相容性好，透明度高，具有一定的机械强度，可塑性好，价格低廉，易取材等优点。

2.本发明的方法尤其适合用于组织工程，首先，植物表皮材料具有一定的物理强度及韧性，有利于各种类型细胞(如原代角膜上皮细胞、原代角膜基质细胞、人角膜上皮细胞系等)在上面的培养，细胞在植物表皮上的增殖速度与在现有材料上的增殖速度相近。其次在培养细胞层面上，不仅适用各种类型细胞，更有利于上皮细胞复层化的生长，形成的上皮样结构细胞排列紧密，说明洋葱鳞茎内表皮等植物表皮能够为细胞提供良好的增殖和分化基础，为构建组织工程角膜奠定基础。最后，以洋葱鳞茎内表皮为例，其厚度为20～30μm左右，作为组织工程角膜上皮重建的支架材料，其透明性较好，可用于眼表重建的动物实验。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

图1为本发明的洋葱表皮支架制备过程示意图。

图2为本发明的洋葱表皮支架在干湿两种状态下的透明度示意图。

图3为本发明实施例1中兔原代角膜上皮细胞在洋葱表皮支架和PET两种载体上不同培养时间的细胞增殖情况示意图。

图4为本发明实施例1中兔原代角膜上皮细胞在洋葱表皮支架和PET两种载体上的生长情况比较示意图，采用扫描电镜(SEM)拍摄。

图5为本发明实施例1中兔原代角膜上皮细胞在洋葱表皮支架和PET两种载体上用气液界面培养5天后的HE染色示意图。

图6为本发明实施例2和实施例3中在洋葱表皮支架和普通培养皿上的细胞培养情况对比示意图。

图7为本发明实施例4至5中不同类型、不同种属来源的细胞在洋葱表皮支架和普通培养皿上的细胞生长情况对比示意图。

具体实施方式

下面通过实施例具体说明本发明的内容：

实施例1：兔原代角膜上皮细胞培养

本实施例之中，采用的培养基及试剂如下：

SHEM培养基：在DMEM/F12培养基500mL中加入5％FBS(胎牛血清)，0.5g/mL氢化可的松，1％ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒溶液)，0.5％DMSO(二甲基亚砜)，10ng/mL human EGF(人表皮生长因子)，1％PS(P即Penicillin青霉素，S即Streptomycin链霉素，青霉素和链霉素各自浓度为1％)。

Dispase(中性蛋白酶)II消化液：市售，工作浓度2U/mL。

10×PBS：NaCl 20g，KCl 2g，Na₂HPO₄·12H₂O>2PO₄>

本实施例之中，选用洋葱鳞茎内表皮，以洋葱鳞茎内表皮作为支架材料的兔原代角膜上皮细胞培养方法如下：

1)如图1a所示，首先将洋葱外表干的部分剥离舍弃，留下新鲜部分；然后在超净工作台上，用手术刀片将洋葱鳞茎分成如图1b的块状结构；如图1c用镊子轻轻挑起一边，将鳞茎内表皮剥离下来，在10cm²的培养皿中(如图1d)用75％酒精浸泡过夜做消毒灭菌处理；然后选用市售细胞培养小室(Millipore公司的Millicell>

2)兔子处死后，眼周局部碘伏充分消毒，严格进行无菌操作；予以含5％PS的1×PBS溶液冲洗结膜囊3次，用眼科剪剪取角膜，迅速放入含5％PS的1×PBS溶液中快速漂洗，然后放入含5％PS的SHEM培养基中；在无菌超净台中显微镜下，用眼科剪剪去角膜上带有的结膜及巩膜部分，操作过程中应尽量避免触碰角膜缘上皮，减少对干细胞的损伤；

3)将步骤2)得到的兔角膜浸没于含有2mg/mL Dispase II消化液、1％PS的SHEM培养基中，封口膜密封培养皿，4℃下消化14～16h，以分离出角膜上皮片；

4)消化结束后，无菌条件下分离角膜上皮片，并将其置于0.25％Tripsin(胰酶)-EDTA中，37℃消化15～20min，随后用血清终止消化，吹打混合均匀后离心，去除上清，沉淀再加SHEM培养基吹打混合均匀，得到角膜上皮细胞液；

5)将步骤4)得到的角膜上皮细胞液按照4～8×10⁴个/cm²接种于步骤1)得到的洋葱表皮支架上，进行培养；

6)在细胞培养初期即细胞融合率小于100％时，采用浸没培养法，每隔2天换液；当细胞生长至完全融合状态即融合率至100％时，改用气液界面培养法(air-lifting)以促使角膜上皮细胞复层化生长。其中，气液界面培养法为：将洋葱表皮支架置于12孔培养板中，在每个洋葱表皮支架中加入50μL SHEM培养基，另在12孔培养板中每孔加入1mL SHEM培养基，并使洋葱表皮支架内的洋葱鳞茎内表皮处于气液界面处(即洋葱鳞茎内表皮与洋葱表皮支架外的培养板孔内培养基的液面齐平)；每天换液，继续培养3～5天左右。

培养过程中利用相差显微镜对细胞形态进行观察拍照，详细记录细胞生长过程。同时以同样品牌和型号但未去除聚对苯二甲酸乙二醇酯膜的细胞培养小室(PET组)以及普通培养皿作为对照。

如图3所示，为本实施例中兔原代角膜上皮细胞在洋葱表皮支架和PET两种载体上不同培养时间的细胞增殖情况示意图。前三天，洋葱表皮组与PET组的细胞基本完全贴壁生长，因PET组中的细胞培养小室已被广泛应用于共培养实验、趋化实验、细胞迁移、细胞侵袭以及药物转运实验等，其内的PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)膜是一种已广泛用于细胞的不同条件培养的高分子聚合材料，其表面已经过很好的处理，所以就贴壁率而言PET组相对较好，但在5天时洋葱表皮组的细胞增殖速度与PET组相比更快。

如图4所示，待细胞融合率达到90％～100％时，扫描电镜下观察洋葱内表皮组与PET组两种载体上兔角膜上皮细胞生长情况。从形态上看，从图中可以看出在洋葱内表皮上生长的细胞立体感及细胞形态较PET膜上细胞更好，在PET膜上的细胞铺的比较平；从微观形态上看，可以看出在洋葱内表皮上生长的兔角膜上皮细胞的微绒毛数量明显多于PET膜上细胞形成的，且微绒毛排列更好。细胞表面微绒毛的主要作用是通过增大细胞表面，扩大吸收面积，参与细胞的吸收功能。因此，可以说洋葱内表皮组的细胞生长情况更好。

如图5所示，洋葱内表皮组与PET组均先采用浸没培养法，待兔角膜上皮细胞长满后再改用气液界面培养法培养3～5天左右，收样包埋，冷冻切片后苏木素-伊红染色(HE)。从图5中可以看出，在洋葱鳞茎内表皮上形成的结构较贴近上皮样结构，细胞排列紧密；而在PET膜上形成的结构相对较疏松，虽然也有细胞复层，但是效果不太理想。

实施例2：兔原代角膜基质细胞培养

本实施例之中，采用的培养基及培养条件如下：

培养基：DMEM(basic)，10％FBS，1％PS；培养条件：37℃，5％CO₂培养箱。

本实施例之中，洋葱表皮支架的制备方法同实施例1中步骤1)。

如图6中左侧所示，为本实施例中兔原代角膜基质细胞(Rabbit Corneal StromaCells P0)在洋葱表皮支架和普通培养皿上的细胞培养情况对比示意图。培养4～6d后，在洋葱表皮上生长的原代兔角膜基质细胞可以很好的维持角膜基质细胞形态，与培养皿上的细胞相比形态上无明显差别，但细胞融合率较大。

实施例3：乳腺癌细胞培养

本实施例之中，采用的培养基及培养条件如下：

培养基：DMEM(basic)，10％FBS，1％PS；培养条件：37℃，5％CO₂培养箱。

本实施例之中，洋葱表皮支架的制备方法同实施例1中步骤1)。

乳腺癌细胞MDA-MB-231按照上述条件，采用常规细胞培养方法培养、消化后制得细胞悬液，然后以5～8×10⁴个/cm²接种于洋葱表皮支架上，按照实施例1中步骤6)的方法进行培养。同时以在普通培养皿中培养的细胞作为对照。

培养1～2天后，结果如图6中右侧所示，洋葱表皮支架组与普通培养皿组相比，细胞形态并无改变，表明洋葱表皮支架可以维持乳腺癌MDA-MB-231的细胞基本形态，且在洋葱内表皮上生长良好。

实施例4：小鼠成纤维细胞培养

本实施例之中，采用的培养基及培养条件如下：

培养基：DMEM(basic)，10％FBS，1％PS；培养条件：37℃，5％CO₂培养箱。

本实施例之中，洋葱表皮支架的制备方法同实施例1中步骤1)。

小鼠成纤维细胞3T3按照上述条件，采用常规细胞培养方法培养、消化后制得细胞悬液，然后以4～8×10⁴个/cm²接种于洋葱表皮支架上，按照实施例1中步骤6)的方法进行培养。同时以在普通培养皿中培养的细胞作为对照。

培养1～2天后，结果如图7所示，小鼠成纤维细胞3T3能够在洋葱表皮支架上生长，且洋葱表皮支架组与普通培养皿组相比，细胞形态、细胞贴壁率及细胞融合率基本无差别改变，生长良好。

实施例5：人角膜上皮细胞系培养

本实施例之中，采用的培养基及培养条件如下：

培养基：DMEM-F12(Gibco)，6％FBS，8ng/mL hEGF，1％PS；培养条件：37℃，5％CO₂培养箱。

本实施例之中，洋葱表皮支架的制备方法同实施例1中步骤1)。

人角膜上皮细胞系HCE细胞按照上述条件，采用常规细胞培养方法培养、消化后制得细胞悬液，然后以3～6×10⁴个/cm²接种于洋葱表皮支架上，按照实施例1中步骤6)的方法进行培养。同时以在普通培养皿中培养的细胞作为对照。

培养1～2天后，结果如图7所示，人角膜上皮细胞系HCE细胞能够在洋葱表皮支架上生长，且洋葱表皮支架组与普通培养皿组相比，细胞形态、细胞贴壁率及细胞融合率基本无差别改变，生长良好。

实施例6：人脐静脉内皮细胞系培养

本实施例之中，采用的培养基及培养条件如下：

培养基：DMEM-high glucose(Gibco)，15％FBS，1％PS；培养条件：37℃，5％CO₂培养箱。

本实施例之中，洋葱表皮支架的制备方法同实施例1中步骤1)。

人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞按照上述条件，采用常规细胞培养方法培养、消化后制得细胞悬液，然后以3～6×10⁴个/cm²接种于洋葱表皮支架上，按照实施例1中步骤6)的方法进行培养。同时以在普通培养皿中培养的细胞作为对照。

培养1～2天后，结果如图7所示，人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞能够在洋葱表皮支架上生长，且洋葱表皮支架组与普通培养皿组相比，细胞形态、细胞贴壁率及细胞融合率基本无差别改变，生长良好。

本发明实施例之中，仅以洋葱鳞茎内表皮为代表，但并不以此为限。植物来源的表皮结构，如大葱叶表皮、大葱葱段内表皮等，只要有一定的物理强度及韧性，符合组织工程材料的其他要求，均可作为一种新的组织工程材料用于细胞的培养及其他方面。

以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。