一株在高盐条件下降解烷烃的盐东方菌菌株及其培养方法

摘要

本发明公开了一株盐东方菌菌株(Halorientalis sp.)IM1011，保藏编号为CGMCC No.13754，具有在高盐条件下降解石油污染物的能力，在含盐采出水的处理领域具有潜在的应用价值。

说明书

技术领域

本发明涉及石油微生物领域，尤其涉及一种在高盐条件下降解烷烃的盐东方菌菌株。

背景技术

在石油开采过程中会产生大量的采出水(Produced water)，即使相当部分回注产油层和含盐层，但是仍有相当体积的采出水需要排放，基于物理、化学方法去除石油污染物而达到排放标准是普遍采取的方法。生物法如活性污泥法以其成本低廉和环境友好的优点广泛应用于水处理工艺中，科学家也很早就开展石油污染物的微生物处理的研究。地质环境的差异，有些采出水除含有石油污染物外，还含有较高盐度(100-400,000mg/L，海水盐度是35,000mg/L)。石油污染物本就属于较难生物降解的化合物，而盐分(尤其是较高浓度的盐分)会显著抑制微生物的代谢活性，进一步增加了处理难度。很多海洋细菌(如Alcanivorax属)和耐盐细菌(如Marinobacter属)通过代谢合成或从胞外转入水溶性溶质进而在胞内累积，来维持胞内的渗透压，在0-3M NaCl的条件下具有较好的降解石油污染物的能力，在低盐度和中盐度采出水的处理中具有潜在的应用前景；而极端嗜盐古菌普遍采取在极端高盐条件下最节能的“盐泵入”策略，在3-5M NaCl的条件下，均能够维持正常的菌体生长和代谢能力。

近年来，已有多株能够在高盐条件下降解石油污染物的极端嗜盐古菌被分离到。早在1990年，科学家从盐沼分离到一株能够降解烷烃的极端嗜盐古菌EH4，在最适盐度3.5MNaCl条件下培养30天，十四烷烃，十六烷烃和二十烷烃的降解率分别为88％，66％和64％。截至目前，已有多株降解烷烃的极端嗜盐古菌被分离到，分属于Haloarcula属，Haloferax属，Halobacterium属和Halococcus属等，他们都能在不小于3M NaCl的条件下降解烷烃，且对钾离子和镁离子的优化可以进一步提高石油污染物的降解率。混合菌的批次培养实验显示，在3.9M NaCl条件下酸水解酪素和光照可以显著提高石油污染物的去除率；而且在添加细菌特异的抗生素(不抑制或杀死古菌)后降解效率反而提高，暗示了极端嗜盐古菌在烷烃降解过程中发挥的重要作用。Haloferax sp.MSNC 14菌株还具有降解多环芳烃菲的能力，并可以产生表面活性剂，利于烷烃等水溶性较差的石油污染物的溶解和吸收。

在高盐条件下降解芳香族化合物的极端嗜盐古菌同样受到科学家的关注。早在1994年科学家就分离到一株能够在高盐条件下降解多种芳香族化合物(如对甲基苯甲酸，苯丙酸，肉桂酸和苯甲酸等)的极端嗜盐古菌Haloferax sp.D1227。巴西科学家对从玻利维亚、智利、波多黎各、沙特阿拉伯和约旦五个国家的高盐样品中分离到的44株能够以对羟基苯甲酸为唯一碳源生长的极端嗜盐古菌的代谢和遗传多样性以及分布规律进行分析，结果显示极端嗜盐古菌可能普遍具有对羟基苯甲酸的降解能力。对其中10株Haloferax属菌株的深入研究表明，很多菌株能够在高达20％NaCl的培养基中以单环芳香族化合物的混合物(苯甲酸、对羟基苯甲酸和水杨酸)和多环芳香族化合物的混合物(萘、蒽、菲、芘、苯并[a]蒽)为碳源生长，而且可以降解这些芳香族化合物；将这些极端嗜盐古菌添加到石油开采的含油含盐废水中，可以明显降低COD(化学需氧量，是有机物相对含量的综合指标之一)，且远好于过氧化氢单独处理。随后又有多篇极端嗜盐古菌降解芳香族化合物的报道，包括在174g/L NaCl条件下能够降解对羟基苯甲酸的Haloarcula sp.D1和在20％NaCl条件下具有苯酚降解能力的A235(与Haloarcula菌株近缘)。

到目前为止，已有多株能够在高盐条件下降解石油污染物的极端嗜盐古菌被分离获得，主要集中在Haloferax属和Haloarcula属，但是通过非培养的方式对石油污染的高盐样品进行分析，结果显示Halomicrobium属，Halorussus属和Halorientalis属的菌株是极端嗜盐古菌的主要类群，暗示可能有降解效率更高的极端嗜盐古菌尚未被分离和报道。

发明内容

本发明提供一株盐东方菌菌株(Halorientalis sp.)IM1011，该菌株已于2017年3月15日保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13754。此菌株具有在高盐条件下降解烷烃的能力，在高盐采出水的生物处理领域具有潜在的应用前景。

本发明提供的盐东方菌菌株分离自天津长芦塘沽盐场，此盐场靠近大港油田，可能会富集有大量具有烷烃降解能力的嗜盐菌。分离方法是在以十六烷烃为唯一碳源的总盐度高达20％的合成培养基中，富集培养三周后，涂布在相同培养基固体平板上；经两次划线获得单克隆，实验室内部编号为IM1011。

经测定，该极端嗜盐古菌有两个16S rRNA基因，rrnA基因(序列1)与Halorientalis persicus D108^T和Halorientalis>T的同源性分别为98.40％和98.12％，而rrnB(序列2)基因与Halorientalis>T(＝D108^T)和Halorientalis>T(＝TNN28^T)的同源性分别为98.43％和96.93％，其与Halorientalis属的模式菌株的16S>

本发明提供的盐东方菌菌株(Halorientalis sp.)IM1011可以在20-25％高盐条件下降解烷烃，以十六烷烃为例，初始浓度为5克/升，培养3周后降解率高达54％，在含盐采出水的处理领域具有潜在应用价值。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1进化树分析菌株的分类地位。

图2IM1011降解十六烷烃(Hexadecane)的气相色谱图(Dodecane为内标)。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

盐东方菌的分离、制备、培养

本发明提供的盐东方菌分离自天津长芦塘沽盐场的样品，分离方法是在以十六烷烃为唯一碳源的总盐度20％的合成培养基中，富集培养三周后，涂布在相同培养基固体平板上；经两次划线获得单克隆，实验室内部编号为IM1011。

经测定，该菌株有两个16S rRNA基因，rrnA基因(序列1)与Halorientalispersicus D108^T和Halorientalis>T的同源性分别为98.40％和98.12％，而rrnB(序列2)基因与Halorientalis>T(＝D108^T)和Halorientalis>T(＝TNN28^T)的同源性分别为98.43％和96.93％，其与Halorientalis属的模式菌株的16S>

本发明提供盐东方菌菌株(Halorientalis sp.)IM1011可以在高达20％盐度的条件下以十六烷烃为唯一碳源生长，培养基成分为：氯化钠160克/升，六水合氯化镁20克/升，七水合硫酸镁24克/升，氯化钙0.5克/升，氯化钾5克/升，碳酸氢钠0.2克/升，溴化钠0.6克/升，氯化铵2克/升，磷酸氢二钾0.2克/升，柠檬铁铵0.008克/升，微量元素溶液(SL-6)1毫升/升,维生素溶液(vitamin 10)3毫升/升，缓冲剂(PIPES)8克/升，十六烷烃5克/升，pH7.0。

实施例2

盐东方菌菌株具有十六烷烃降解能力

在添加了10克/升酵母提取物和7.5克/升酸水解酪素的MSM培养基(氯化钠210克/升，六水合氯化镁20克/升，七水合硫酸镁24克/升，氯化钙0.5克/升，氯化钾5克/升，碳酸氢钠0.2克/升，溴化钠0.6克/升，氯化铵2克/升，磷酸氢二钾0.2克/升，柠檬铁铵0.008克/升，微量元素溶液(SL-6)1毫升/升,维生素溶液(vitamin 10)3毫升/升，缓冲剂(PIPES)8克/升，pH 7.0)中活化培养菌体，生长至对数后期以4％的接种量接种于50毫升MSM培养基中，以5克/升十六烷烃为唯一碳源，在250毫升的三角瓶中培养；以不接种菌体的相同培养基作为对照。180转/分，37度培养24天后，在培养基中添加十二烷烃作为内标，用10毫升正己烷萃取培养基中的烷烃，萃取三次，将三份正己烷样品混合。取1微升混合液，通过配备DB-1气相色谱柱和FID检测器的Agilent Technology 6820气相色谱仪分析残留烷烃的含量。样品气化程序为40度1分钟；由40度提高至140度，5度/分；由140度提高至280度，10度/分。进样器和检测器的温度设定为280度。

以烷烃的特征峰的面积作为其定量指标，图2显示内标十二烷烃特征峰面积的差异并不明显，而目标污染物十六烷烃经Halorientalis sp.IM1011处理后显著降低。

对降解率进行定量分析，H_T为IM1011处理后残留的十六烷烃含量(十六烷烃含量需经内标归一化)，H_C为对照，降解率(％)＝(H_C-H_T)/H_C。经计算，降解率为54％。

实施例3

降解效率的优化提高

十六烷烃属于较难生物降解的石油污染物，以十六烷烃直接培养菌体不仅生长速率较低，而且会额外引入污染物。通过对菌体利用碳源的情况进行研究，发现该菌以乙酸为碳源可以良好生长。

通过调整乙酸浓度、培养方式等对菌体生长条件进行优化。在添加了酵母提取物和酸水解酪素的MSM培养基中活化培养菌体，生长至对数后期以4％的接种量接种于50毫升MSM培养基中，以2克/升乙酸作碳源，在250毫升的三角瓶中培养6天；然后再添加5克/升十六烷烃，继续培养。7天后，十六烷烃降解率将近60％；14天后，十六烷烃降解率大于70％。不仅提高了十六烷烃的降解率，而且缩短了处理时间。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株在高盐条件下降解烷烃的盐东方菌菌株及其培养方法

<160> 2

<210> 1

<211> 1474

<212> DNA

<213> 盐东方菌 Halorientalis sp.

<400> 1

attccggttg atcctgccgg aggccattgc tatcggagtc cgatttagcc atgctagtcg 60

cacgagttca ggctcgtggc agatagctca gtaacacgtg gccaaactgc cctatggatg 120

gagacaacct cgggaaactg aggctaatct ccaatacagc tcccatgttg gagtgcagag 180

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<213> 盐东方菌 Halorientalis sp.

<400> 2

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