检测蛋白质乙酰化水平的蛋白芯片及试剂盒

摘要

本发明公开一种蛋白芯片及试剂盒，可以检测蛋白质翻译后乙酰化水平，所述蛋白芯片包括68种特异性抗体，所述试剂盒包含该点制有68种特异性抗体的蛋白芯片，还包括抗乙酰化赖氨酸抗体、HRP标记的检测二抗、生物素标记的酪胺、信号扩增缓冲液、30％H

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白芯片及试剂盒，特别是涉及一种能够检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片以及包含该蛋白芯片的试剂盒及检测方法。

背景技术

随着在上世纪60年代Phillips、Allfrey等科学家对组蛋白乙酰化的首次发现，在过去的50年中，人类对蛋白质乙酰化的了解有了长足的进步。蛋白质乙酰化修饰分为两种，一种为蛋白翻译时N端的乙酰化修饰，对蛋白的合成、定位以及稳定性都有影响。另一种为蛋白翻译后在赖氨酸残基ε-氨基上的乙酰化修饰，在乙酰基转移酶(HAT)催化下，乙酰辅酶A的乙酰基团被转移到目的蛋白的赖氨酸，这一过程同时也受到组蛋白去乙酰化酶(HDAC)的可逆调节。乙酰化是蛋白质翻译后修饰的重要组成部分，组蛋白乙酰化可以促使染色体打开超螺旋结构，促进基因转录。通过蛋白质组学的研究发现，除了组蛋白外，在细胞质和线粒体中均存在大量的蛋白质乙酰化，参与到了RNA剪切、细胞周期、DNA复制、转录、细胞核转运等多种生物过程中。另外大量中间代谢酶都能够被乙酰化修饰，其动态调节过程对控制细胞代谢具有重要作用。乙酰化水平的调节失控能够导致多种疾病，多种转录因子的乙酰化水平(包括P53、STAT3、HIF-1α等)都影响着癌症的发生和发展，目前已有多种以HDAC为靶点的临床药物如SAHA(伏立诺他)被用于癌症相关疾病的治疗。因此，如何高效的检测出样本中蛋白质的乙酰化水平在科研、医疗诊断和医药开发领域都有重要意义。

尽管赖氨酸乙酰化作为一种常见的翻译后修饰具有重要作用，但是由于相对较低的丰度水平，乙酰化水平的检测需要在总蛋白中对乙酰化蛋白进行富集。然而乙酰化抗体对乙酰化蛋白的亲和性较低，不能满足直接对乙酰化蛋白进行富集，而是需要将蛋白消化成肽段后，再使用抗体富集乙酰化肽段，经过质谱分析的手段来检测。众所周知的是，质谱分析需要对样本进行片段化处理，这个预处理过程非常复杂，需要耗费大量的时间和人力，成本高昂，同时质谱分析对样本的需求量也较高，而临床上的少量样本也限制了质谱技术的运用。

蛋白芯片是一种高通量的蛋白功能分析技术，是近年发展起来的一项生物检测技术。利用这项技术，通过将大量抗体或抗原密集地点制在固相载体上，具有可同时检测多种蛋白质且样本需求量小的特点，对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义。但是，目前尚没有关于用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片及试剂盒等相关技术的公开。

本案发明人依据在蛋白芯片领域的多年研究经验，开发出了一种蛋白芯片，能够用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平，同时还公开了该蛋白芯片的制备方法、应用、试剂盒及检测方法等相关技术，发明人开发的上述技术填补了用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的蛋白芯片领域的技术空白。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一在于，提供一种蛋白芯片，能够同时检测样品中多个蛋白质翻译后乙酰化修饰水平。

本发明所要解决的技术问题之二在于，提供所述蛋白芯片的应用。

本发明所要解决的技术问题之三在于，提供一种试剂盒，包含所述蛋白芯片，能够检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平。

本发明所要解决的技术问题之四在于，提供所述试剂盒用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的检测方法。

为解决上述技术问题之一，本发明提供的蛋白芯片，包括基片和阵列式分布的捕获抗体，所述捕获抗体包括但不限于以下68种特异性抗体：AML1,AMPK,APE,AR,α-Tubulin,β-Catenin,Bcl-6,Beclin,BRAF,MYB,c-Myc,CREB,CTBP2,DEK,E2F1,E2F2,E2F3,EGFR,Her2,Her4,ER,EKLF,FEN1,FOXO1,FOXO3,FOXO4,GATA1,GATA2,GATA3,GATA4,GR,HIF-1α,HMGA1,HMGB1,HSP90,IRF2,IRS1,KRAS,Ku70,MDM2,MEF2A,NEIL2,NFκB,Notch1,P21,P53,P65,PGC1,PTEN,RB1,KPNA2,RUNX2,SMAD2,SMAD4,SMAD7,SOX4,SOX9,SREBP1,SRY,STAT1,STAT2,STAT3,TDG,VEGF,WRN,β-Actin,GAPDH,BSA。

所述捕获抗体为以下68种特异性抗体：AML1,AMPK,APE,AR,α-Tubulin,β-Catenin,Bcl-6,Beclin,BRAF,MYB,c-Myc,CREB,CTBP2,DEK,E2F1,E2F2,E2F3,EGFR,Her2,Her4,ER,EKLF,FEN1,FOXO1,FOXO3,FOXO4,GATA1,GATA2,GATA3,GATA4,GR,HIF-1α,HMGA1,HMGB1,HSP90,IRF2,IRS1,KRAS,Ku70,MDM2,MEF2A,NEIL2,NFκB,Notch1,P21,P53,P65,PGC1,PTEN,RB1,KPNA2,RUNX2,SMAD2,SMAD4,SMAD7,SOX4,SOX9,SREBP1,SRY,STAT1,STAT2,STAT3,TDG,VEGF,WRN,β-Actin,GAPDH,BSA。

所述基片包括经修饰、或者改性后的玻璃载片、塑料载片、膜片等可以用于蛋白点制的材质。

所述蛋白芯片，还包括阳性对照和阴性对照，所述阳性对照为生物素标记的BSA(BSA-生物素)和乙酰化BSA(Ac-BSA)，所述阴性对照为BSA(牛血清白蛋白)、mouse IgG和rabbitnormal IgG。

所述蛋白芯片，是分别将所述捕获抗体、阳性对照和阴性对照点制于所述基片上制成的。

所述阳性对照、阴性对照和每一种捕获抗体在芯片上均点制3个重复点。

上述68种特异性抗体是经过精心挑选的。为实现高效率的同时检测多种蛋白质的乙酰化水平，发明人对大量的可能发生蛋白质乙酰化的抗体进行了深入研究，筛选出了上述68种可发生明显乙酰化修饰、反应特异性好、检测信号明显且信号与抗原浓度呈较好的线性关系的特异性抗体，本发明公开的68种特异性抗体可以很好的用于蛋白质乙酰化修饰水平的检测，其检测结果可以从整体上反应检测样品的蛋白质乙酰化修饰水平。同时依托上述68种特异性抗体，可以针对不同实验的需要，增加并点制潜在的能够发生蛋白质乙酰化或需要检验蛋白质乙酰化修饰水平是否发生变化的其他不同的抗体，能够满足个性化定制的要求。

为解决上述技术问题之二，本发明还公开所述蛋白芯片用于制备检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的装置的应用。本发明的蛋白芯片可用于制备检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的装置，例如试剂盒等，满足在科研、医疗诊断和医药开发等领域的使用需求。

为解决上述技术问题之三，本发明提供的试剂盒，包括所述的蛋白芯片。

所述试剂盒，还包括抗乙酰化赖氨酸抗体、HRP(辣根过氧化物酶)标记的检测二抗、生物素标记的酪胺、信号扩增缓冲液、30％H₂O₂、荧光偶联链霉亲和素、蛋白裂解液、NHS-生物素、蛋白标记缓冲液、标记终止缓冲液和超滤管。

为解决上述技术问题之四，本发明提供的所述试剂盒用于检测蛋白质翻译后乙酰化修饰水平的检测方法如下(其检测流程如图1所示)：

1、样品的准备

①检测样品：取细胞或组织样本，加入蛋白裂解液，充分反应后离心，收集上清液并进行定量，即得到检测样品(用于检测乙酰化信号)；

②本底样品：取部分检测样品，加入蛋白标记缓冲液混匀，加入NHS-生物素进行标记，再加入标记终止缓冲液终止标记，然后加入1xPBS(磷酸缓冲盐溶液)，放入超滤管，经离心后取超滤液保存，即得到本底样品(用于检测蛋白本底信号)。

2、蛋白芯片杂交

①先将蛋白芯片用BSA封闭，然后取用等量的检测样品和本底样品，在蛋白芯片的两个反应室中分别加入所取用的检测样品和本底样品，将其与蛋白芯片进行杂交孵育，清洗；

②检测组：在反应室中继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，孵育，清洗，加入HRP标记的检测二抗，孵育，清洗，加入信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺反应，最后再加入荧光偶联链霉亲和素，放置，清洗，甩干；

③本底组：在反应室中加入荧光偶联链霉亲和素，放置，清洗，甩干。

3、数据采集分析

使用芯片扫描仪读取检测组和本底组的荧光信号，用Genepix Pro 6.0软件对获得的荧光信号进行分析，采集每个捕获抗体点上的荧光信号中位值并以此计算出重复点的平均值和CV值。反应室中加入未标记的蛋白样品及抗乙酰化赖氨酸抗体的，其扫描得到的信号即为乙酰化信号，而反应室中加入生物素标记的蛋白样品的，其扫描得到的信号即为蛋白本底信号。样品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信号/本底信号的比值来表示，该比值越大则说明样品蛋白的乙酰化水平越高。

样本间乙酰化水平的差异根据乙酰化信号/本底信号的比值来加以分析。

本发明首次提供了一种能够同时检测样品中多个蛋白质乙酰化修饰水平的蛋白芯片及试剂盒，相较于现有技术中采用质谱分析检测蛋白质乙酰化水平的方法，本发明无需对蛋白质进行复杂的酶切纯化等预处理过程，可以解决目前检测蛋白质乙酰化修饰费时费力的问题，而且可同时检测样品中的多种蛋白质，检测更加全面，检测效率高，且样品需求量小，对于高通量基因表达的研究具有非常重要的意义，同时依托此平台，可以针对不同实验的需要点制不同的抗体，能够满足个性化定制的要求。

附图说明

图1是乙酰化蛋白芯片操作流程图。

图2蛋白芯片检测TSA诱导细胞的乙酰化变化。

图3蛋白芯片检测P300过表达细胞的乙酰化变化。

具体实施方式

下面将结合实验数据及附图对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例一

蛋白芯片的制备方法如下：

将68种特异性抗体用PBS-15％甘油稀释至0.5μg/μl，使用芯片点制平台将抗体逐一点制到芯片上。每个点直径200μm，点与点间距500μm；使用生物素标记的BSA(BSA-生物素)、乙酰化BSA(Ac-BSA)作为阳性对照，使用BSA、mouse IgG、rabbit normal IgG作为阴性对照；按照一定顺序放入384孔板中，使用芯片点样仪进行芯片点制，阳参、阴参和捕获抗体均点制3个重复点，制备成蛋白质芯片。所述68种特异性抗体为：AML1,AMPK,APE,AR,α-Tubulin,β-Catenin,Bcl-6,Beclin,BRAF,MYB,c-Myc,CREB,CTBP2,DEK,E2F1,E2F2,E2F3,EGFR,Her2,Her4,ER,EKLF,FEN1,FOXO1,FOXO3,FOXO4,GATA1,GATA2,GATA3,GATA4,GR,HIF-1α,HMGA1,HMGB1,HSP90,IRF2,IRS1,KRAS,Ku70,MDM2,MEF2A,NEIL2,NFκB,Notch1,P21,P53,P65,PGC1,PTEN,RB1,KPNA2,RUNX2,SMAD2,SMAD4,SMAD7,SOX4,SOX9,SREBP1,SRY,STAT1,STAT2,STAT3,TDG,VEGF,WRN,β-Actin,GAPDH,BSA。

上述68中特异性抗体是经过精心挑选的，可以针对不同实验的需要，依托实施例一的蛋白芯片，点制具有针对性的不同的抗体，并用于检测样品的蛋白质乙酰化水平，能够满足个性化定制的要求。

实施例二：

基于实施例一的蛋白芯片的试剂盒的检测方法：

1、样品的准备

①检测样品：取10⁶–5x>6细胞或10–40mg组织样本，加入100–200μl蛋白裂解液，在4℃下放置30分钟并不时振荡，然后在4℃下10000g离心15分钟，收集上清液并进行定量，即得到检测样品(用于检测乙酰化信号)；

②本底样品：取100μg检测样品，加入蛋白标记缓冲液混匀至50μl，加入2μl NHS-生物素在室温下反应2小时进行标记，再加入1.6μl标记终止缓冲液于室温反应30分钟终止标记，然后加入450μl 1xPBS，放入超滤管，经4℃10000g离心30分钟后取超滤液于-20℃保存，即得到空白样品(用于检测蛋白本底信号)。

2、蛋白芯片杂交

①先将蛋白芯片用1％BSA室温封闭1h，然后取用等量的检测样品和空白样品，在蛋白芯片的两个反应室中分别加入所取用的检测样品和空白样品，将其与蛋白芯片在37℃进行杂交孵育1.5小时后清洗；

②检测组：在反应室中继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，37℃孵育1小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育1小时，PBST清洗后，加入含有0.0015％H₂O₂信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺室温反应10分钟，最后再加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；

③本底组：在反应室中加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；

所有清洗过程都使用PBST清洗3次，每次5分钟。

3、数据采集分析

使用芯片扫描仪读取检测组和空白组的荧光信号，用Genepix Pro 6.0软件对获得的荧光信号进行分析，采集每个捕获抗体点上的中位值并以此计算出重复点的平均值和CV值。反应室中加入未标记的蛋白样品及抗乙酰化赖氨酸抗体的，其扫描得到的信号即为乙酰化信号，而反应室中加入生物素标记的蛋白样品的，其扫描得到的信号即为蛋白本底信号。检测样品蛋白的乙酰化水平用乙酰化信号/本底信号的比值来表示，该比值越大则说明样品蛋白的乙酰化水平越高，不同样本之间乙酰化水平的差异可以通过比较不同样本的乙酰化信号/本底信号的比值来加以分析。

实施例三

TSA(Trichostatin A)处理细胞模型

1、实验原理

TSA(Trichostatin A)是一种可逆的HDAC(histone deacetylase，组蛋白去乙酰化酶)抑制剂，通过抑制蛋白去乙酰基团的过程，提高细胞中的乙酰化水平。用DMSO和TSA分别处理样本，DMSO处理为对照样本，用本发明的蛋白芯片及试剂盒检测经TSA处理后对比经DMSO处理后的细胞中乙酰化水平的变化，以说明本发明的检测效果。

2、样本制备

胃癌细胞MKN45在含10％FBS(fetal calf serum，胎牛血清)的RAPI 1640培养基中培养至70％的密度，分别用DMSO和3μM TSA处理18小时后收集细胞蛋白。

3、试验方法

a、取10⁶经DMSO和TSA处理的MKN45细胞，加入100μl蛋白裂解液4℃裂解30min，10000g离心15min后收集上清，测定浓度，分别取其中100μg蛋白进行生物素标记，用于检测蛋白本底信号，其余用于检测乙酰化信号；

b、取出蛋白芯片用1％BSA室温封闭1h，分别取等量的DMSO处理组和TSA处理组的检测样品和本底样品加入到芯片的不同两个反应室中，在37℃进行杂交孵育1.5小时后清洗；

c、在检测组反应室中，继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，37℃孵育1小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育1小时，PBST清洗后，加入含有0.0015％H₂O₂信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺室温反应10分钟，最后再加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；在本底组反应室中加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；

d、使用芯片扫描仪读取DMSO处理组和TSA处理组样本荧光信号，用Genepix Pro 6.0软件对其进行分析，比较DMSO处理和TSA处理组两组样本之间乙酰化信号/本底信号比值的差异。

4、实验结果

MKN45细胞经过TSA处理，通过WB可以发现乙酰化水平明显提高(图2a)。我们以此TSA诱导的细胞为模型，用本发明来检测对照样本(Control组)和TSA处理样本间的乙酰化差异，通过比对发现GATA1和Histone(组蛋白)蛋白的乙酰化水平有相对明显的上升，分别上调了1.6倍和3.1倍(图2b、2c)。实验结果与预期相符，说明本发明的蛋白芯片及试剂盒可以很好的用于检测蛋白质乙酰化修饰水平。

实施例4

P300过表达细胞模型检测

1、实验原理

P300是一种乙酰基转移酶(HAT)，其底物包括几乎所有组蛋白以及大量的非组蛋白，通过过表达P300可以从另一个方面检测细胞乙酰化水平的变化，从而对蛋白芯片加以验证。

2、样本制备

胃癌细胞AGS在含10％FBS的RAPI 1640培养基中培养至70％的密度，使用Lipofectamine2000分别转染GFP(Green Fluorescent Protein，绿色荧光蛋白)和P300质粒，转染48小时后分别收集细胞RNA和蛋白质。RNA经反转录后用以检测细胞过表达P300水平，蛋白用以和本发明杂交检测乙酰化水平。

3、试验方法

a、RNA提取、反转录与定量：

分别取10⁵空白和过表达P300的MKN45细胞，加入1ml>

b、蛋白质收集、芯片杂交检测：

b1.取10⁵空白和过表达P300的MKN45细胞，加入裂解液4℃裂解30min，10000g离心15min后收集上清，进行生物素标记，用于检测蛋白本底信号，其余用于检测乙酰化信号；

b2.取出蛋白芯片，分别取等量检测样品和本底样品加入到芯片的反应室中，在37℃进行杂交孵育1.5小时后清洗；

b3.在检测组反应室中，继续加入抗乙酰化赖氨酸抗体，37℃孵育1小时，PBST清洗，加入HRP标记的检测二抗，室温孵育1小时，PBST清洗后，加入含有0.0015％H₂O₂信号扩增缓冲液和生物素标记的酪胺，室温反应10分钟，最后再加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；在本底组反应室中加入0.1μg/ml荧光偶联链霉亲和素，室温放置30min，清洗，甩干；

b4.使用芯片扫描仪读取空白细胞和过表达P300细胞样本的荧光信号，用Genepix Pro6.0软件对其进行分析，比较空白细胞和过表达P300细胞之间乙酰化信号/本底信号比值的差异。

4、实验结果

细胞转染P300质粒48小时后P300mRNA显著上升(图3a)，用蛋白芯片检测后，发现与对照样本(Control组)相比，P300过表达细胞模型的包括Histone、GATA1、EKLF、Tubulin(微管蛋白)等多个蛋白都发生了乙酰化水平上调(图3b、3c),其中GATA1和Tubulin均上调了1.6倍，Histone和EKLF上调了1.3倍。实验结果与预期相符，说明本发明的蛋白芯片及试剂盒可以很好的用于检测蛋白质乙酰化修饰水平。

综上所述，上述各实施例及附图仅为本发明的部分较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。