一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法

摘要

本发明公开了一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，包括如下步骤：（1）提取含有目的基因的入门载体质粒；（2）将含有目的基因的入门载体质粒分别和含有萤火虫荧光素酶基因N端、C端的双元表达载体进行LR重组反应，提取质粒；（3）将LR反应后得到的含有目的基因和萤火虫荧光素酶基因片段的重组质粒转化农杆菌，制备转化液；（4）取继代培养1个月的月季无菌苗转移到上述所得转化液中，真空渗透3～5分钟，然后用无菌水清洗后将月季苗放回到继代培养基中培养；（5）取上述转化后月季苗均匀喷洒荧光素后放置CCD荧光照相系统的暗室中拍照，鉴定是否存在蛋白互作。本发明简便易行、设备要求不高、假阳性率低。

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用农杆菌介导的月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

鉴定蛋白质之间的相互作用是研究基因功能的重要手段。目前，国内申请公开或者授权的相关专利主要是基于酵母杂交体系(公开号CN106434734A)、双分子荧光互补技术(公开号CN102168102B)或者生物发光共振能量转移(BRET)技术(公开号CN103616502B)。由于脱离了植物体的真实环境，用酵母杂交体系鉴定蛋白互作容易造成假阳性；双分子荧光互补和生物发光共振能量转移技术都需要借助于激光共聚焦显微镜，设备昂贵、操作技术要求高、难以普及。蔷薇科植物月季蛋白互作的研究目前没有成熟的体系可以借鉴，因此，本发明提供了一种基于月季瞬时表达系统的蛋白互作鉴定方法，该方法利用萤火虫荧光素酶双端互补技术，借助于电耦合(CCD)荧光照相机检测信号，方法简便，设备廉价，假阳性率低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，该种方法简便易行、设备要求不高、假阳性率低，可以扩展应用到蔷薇科的其他植物。

为解决上述技术问题，本发明提供一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，其特征是，包括如下步骤：

(1)克隆待鉴定的基因A和B的编码区到Gateway技术兼容的入门载体上，转化大肠杆菌，在LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒；

(2)将上述得到含有目的基因的入门载体质粒分别和含有萤火虫荧光素酶基因N端、C端的双元表达载体进行LR重组反应，反应产物转化大肠杆菌后在LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒；

(3)将上述LR反应后得到的含有目的基因和萤火虫荧光素酶基因片段的重组质粒转化农杆菌，在LB固体培养基上筛选阳性克隆，挑取菌落PCR鉴定后的阳性单克隆摇菌到对数增长期，即OD₆₀₀＝0.5，所得菌液离心后沉淀用含5％的蔗糖的MS营养液重新悬浮，然后将含有A、B两种不同目的基因的悬浮液等比例混合，调整OD₆₀₀＝0.2，即为转化液；

(4)取继代培养1个月的月季无菌苗转移到上述所得转化液中，真空渗透3～5分钟，然后用无菌水清洗后将月季苗放回到继代培养基中培养；

(5)取上述转化后月季苗均匀喷洒荧光素后放置CCD荧光照相系统的暗室中拍照，鉴定是否存在蛋白互作。

进一步地，上述步骤(1)中，所述待鉴定的基因A和B的编码区不含终止密码子。

进一步地，上述步骤(1)中，所述入门载体为pENTR-D-TOPO，大肠杆菌为DH5α，LB固体培养基含有卡那霉素抗性，卡那霉素的浓度为50mg/L。

进一步地，上述步骤(2)中，所述双元表达载体为PMK7-nL-WG2、PMK7-cL-WG2，大肠杆菌为DH5α，LB固体培养基含有奇霉素抗性，奇霉素的浓度为100mg/L。

进一步地，上述步骤(3)中，所述农杆菌为GV3101，LB固体培养基含有奇霉素、利福平和庆大霉素抗性，奇霉素的浓度为100mg/L，利福平的浓度为50mg/L，庆大霉素的浓度为20mg/L。

进一步地，上述步骤(4)中，所述真空渗透用注射剂器实施，具体方法是选取灭菌后的50ml医用注射器，加入不超过15ml的含有月季苗的转化液，赶出空气后密封，反复拉动推柄，直到月季叶片变为深绿、充分浸湿为止。

进一步地，上述步骤(4)中，用无菌水清洗3遍后将月季苗放回到继代培养基中培养2～3天。

进一步地，上述步骤(5)中，所述荧光素的浓度为1mM，拍照曝光时间为10分钟。

进一步地，上述步骤(5)中，鉴定是否存在蛋白互作的方法为：拍照时连拍3张，如果第2张和第3张的月季苗都有荧光信号说明A、B蛋白存在互作，如果没有信号则不存在蛋白互作。

本发明所达到的有益效果：本发明简便易行、设备要求不高、假阳性率低。本发明采用活体月季无菌苗为转化材料，材料易得，繁殖周期短；克服了异源转化可能造成的基因共抑制现象，最大限度地模拟的植物体内的真实环境，所得结果可靠性高。

附图说明

图1是PHYB和PIF3两种基因共转化月季苗后的CCD荧光照片，第1、2、3张照片都有荧光信号，所以两个基因编码蛋白之间存在互作；

图2是CO和PIF3两种基因共转化月季苗后的CCD荧光照片，第2、3张照片都没有荧光信号，所以两个基因编码蛋白之间不存在互作。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，包括如下步骤：

I克隆月季PHYB和PIF3基因的编码区(不含终止密码子)到Gateway技术兼容的入门载体pENTR-D-TOPO上，转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒。

II将上述得到含有目的基因的入门载体pENTR-D-TOPO-PHYB和pENTR-D-TOPO-PIF3质粒分别和含有萤火虫荧光素酶基因N端、C端的双元表达载体PMK7-nL-WG2、PMK7-cL-WG2进行LR重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α后在含有100mg/L奇霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒。

III将上述LR反应后得到的含有目的基因和萤火虫荧光素酶基因片段的重组质粒转化农杆菌GV3101，在含有100mg/L的奇霉素、50mg/L利福平和20mg/L庆大霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，挑取菌落PCR鉴定后的阳性单克隆摇菌到OD₆₀₀＝0.5。所得菌液离心后沉淀用含5％的蔗糖的MS营养液重新悬浮，然后将含有PHYB和PIF3两种不同目的基因的悬浮液等比例混合，调整OD₆₀₀＝0.2，即为转化液。

IV取继代1个月左右的月季无菌苗转移到上述所得转化液中，转移到无菌注射器中真空渗透5分钟，然后用无菌水清洗3遍后将月季苗放回到继代培养基中培养3天备用。

V取上述转化后月季苗均匀喷洒1mM的荧光素后放置CCD荧光照相系统的暗室中拍照，曝光时间为10min，连拍3张。如图1所示，除第一张照片有荧光信号外，第2和3张的月季苗都有荧光信号，说明PHYB和PIF3两种基因编码的蛋白存在互作。

实施例2

一种利用月季瞬时表达系统鉴定蛋白互作的方法，包括如下步骤：

I克隆月季CO和PIF3基因的编码区(不含终止密码子)到Gateway技术兼容的入门载体pENTR-D-TOPO上，转化大肠杆菌DH5α，在含有50mg/L的卡那霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒。

II将上述得到含有目的基因的入门载体pENTR-D-TOPO-CO和pENTR-D-TOPO-PIF3质粒分别和含有萤火虫荧光素酶基因N端、C端的双元表达载体PMK7-nL-WG2、PMK7-cL-WG2进行LR重组反应，反应产物转化大肠杆菌DH5α后在含有100mg/L奇霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定后摇菌提取质粒。

III将上述LR反应后得到的含有目的基因和萤火虫荧光素酶基因片段的重组质粒转化农杆菌GV3101，在含有100mg/L的奇霉素、50mg/L利福平和20mg/L庆大霉素抗性的LB固体培养基上筛选阳性克隆，挑取菌落PCR鉴定后的阳性单克隆摇菌到OD₆₀₀＝0.5。所得菌液离心后沉淀用含5％的蔗糖的MS营养液重新悬浮，然后将含有CO和PIF3两种不同目的基因的悬浮液等比例混合，调整OD₆₀₀＝0.2，即为转化液。

IV取继代1个月左右的月季无菌苗转移到上述所得转化液中，转移到无菌注射器中真空渗透4分钟，然后用无菌水清洗3遍后将月季苗放回到继代培养基中培养3天备用。

V取上述转化后月季苗均匀喷洒1mM的荧光素后放置CCD荧光照相系统的暗室中拍照，曝光时间为10min，连拍3张。如图2所示，第一张照片有叶绿体自发荧光信号，而第2和3张的月季苗都没有荧光信号，说明CO和PIF3两种基因编码的蛋白不存在互作。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。