实时监控乳状液相分离过程的核磁共振空间分辨谱方法

摘要

实时监控乳状液相分离过程的核磁共振空间分辨谱方法，涉及核磁共振波谱学检测方法。用等体积的水和油加一定量的乳化剂并用涡旋振荡器进行充分震荡混合；转移到核磁管中，在核磁共振波谱仪上导入事先编译好的快速空间分辨NMR谱脉冲序列；设置脉冲序列参数和采样参数，进行数据采集；最后当采样完成后，进行相关的数据后处理，提取不同空间位置的高分辨

说明书

技术领域

本发明涉及核磁共振(Nuclear Magnetic Resonance，NMR)波谱学检测方法，尤其是涉及实时监控乳状液相分离过程的核磁共振空间分辨谱方法。

背景技术

乳状液是由两种不混溶液体制成的亚稳态胶体，一种液体在表面活性剂的存在下分散在另一种液体中。由于增强亲脂性成分的溶解性和生物活性的优点，O/W乳状液已广泛用于各种领域，包括食品(Lobato-Calleros等人，2008；Relkin，Shukat，Peyronel，和Meneau，2014)和制药工业等(Kabri，Arab-Tehrany，Belhaj，&Linder，2011；Onuki，Kida，Funatani，Hayashi，&Takayama，&Zhong，2015)。了解乳状液的形成过程对于理解乳液的稳定性和相分离进程具有重要意义。研究乳状液结构和动力学的传统方法包括光散射(van Gruijthuijsen，Rufier，Phou，Obiols-Rabasa，&Stradner，2012；Warisnoicharoen，Lansley，&Lawrence，2000)显微镜，(Vakarelski等，2010)电导率测量(Charin，Farias，Tavares，&Nele，2016)和流变技术(Alam&Aramaki，2008)等。这些方法可提供包括乳液中液滴尺寸分布，乳液形态，乳液稳定性及乳液流变性的相关信息。长久以来，核磁共振光谱一直作为一个强大且通用的方法在分子水平上对化学和生物代谢各领域进行分析(Johns，2009)。对于乳状液来说，NMR是一种非侵入的方法，通过脉冲梯度场技术(PFG)可量化分子自扩散从而测量得到乳状液的液滴尺寸分布，这种方法能够处理非常高浓度的乳状液的液滴测量问题(Vermeir等人，2016)，而这种精细的测量用其他方法无法做到。除了乳液的液滴尺寸分布测量，一维氢谱(¹H>

近年来，一种新颖的基于体素选择的磁共振波谱方法(magnetic resonance spectroscopy,MRS)方法被用于获得水-笨系统的空间分辨核磁共振一维谱(Lambert，Hergenroder，Suter和Deckert，2009)。其中，Z方向上的高强度梯度场达到1特斯拉每米，所检测的体素厚度达到1μm，步长为50nm，为在液-液界面处进行高空间分辨谱的探测提供可能性。然而，大多数液态NMR光谱仪装配的反式或宽带探头仅具有沿着z轴的梯度场用于选择相干路径和测量自扩散系数。因此，有研究报道了可用于常规化学实验室的标准液体NMR设备上的空间分辨谱方法，从而确保其广泛应用于各种化学系统(Mantel，Bayle，Hediger，Berthon，&Bardet，2010；Martin，Chingas，&McDougal，2012)。最近，韦等人报道了一种基于称为1D PHASICS(Partial Homogeneity Assisted Inhomogeneity Correction Spectroscopy)的局部均匀的高分辨核磁共振谱方法。(Wei，Lin，Chen，Lin，&Chen，2014)。由于信号来自于一系列尺寸足够小的小体素利用回波平面光谱成像(EPSI)检测模块，仅仅在几秒钟内1D PHASICS即可同时获得沿Z轴梯度场方向的不同小体素的高分辨率一维NMR氢谱。与单体素定域谱相比，1D PHASICS方法能够利用高速率转换下的振荡梯度同时完成覆盖沿着梯度方向的整个有效样本长度的多体素谱信息的采集。

发明内容

本发明的目的在于提供能适用于检测乳状液形成和稳定过程中物质的迁移和含量变化的实时监控乳状液相分离过程的核磁共振空间分辨谱方法。

本发明包括以下步骤：

1)制备待测样品，通过混合等体积的有机相和乳化剂水溶液制备乳状液，震荡后，转移到NMR管中，再置于NMR波谱仪中；

在步骤1)中，所述有机相可采用芝麻油；所述乳化剂水溶液的制备方法是：先将乳化剂分散在水相中并在室温下用涡流旋转直至完全溶解，即得乳化剂水溶液。实验中可改变乳化剂比例，以研究不同含量的乳化剂对乳状液系统形成的影响。为了避免潜在的辐射阻尼效应，样品的水相由H₂O和D₂O组成，H₂O与D₂O的体积比可为10％︰90％；样品的水油体积比按照1︰1配制，乳化剂的相对含量较低，不足以使水油完全乳化；所述震荡可用涡旋器震荡5min；所述NMR管可采用5mm的标准NMR管。

2)将参考样品置于核磁共振谱仪中，匀场后用常规一维脉冲序列采样一张一维谱，获得谱线的线宽，线宽值反映了磁场环境均匀性情况；

在步骤2)中，所述核磁共振谱仪可采用500MHz Varian NMR核磁共振谱仪；所述将参考样品置于核磁共振谱仪中之前先用常规溶液样品匀场，使磁场尽量均匀。

3)在核磁共振波谱仪上导入事先编译好的1D PHASICS序列，根据实验需要，设置实验参数以达到兼顾分辨率和信噪比的最佳效果；

在步骤3)中，所述1D PHASICS序列按时序包括一个激发脉冲和一个回波平面谱成像模块，所述回波平面谱成像模块可以单次扫描下获得整个梯度覆盖下采样区间内的完整空间信息，所以1D PHASICS序列能够提供样品不同空间位置的谱峰信息，回波平面谱成像模块前的补偿梯度G_s起移动回波中心的作用；

所述实验参数包括直接维谱宽SW、频率编码强度Ga、单一正或负频率编码梯度下的采样时间Ta、重复采样次数Na、间接维采样点数Np₁；Ga可控制采样区域的范围，重复采样次数Na可控制实验结果的灵敏度，改变间接维采样点数可改变一维谱的表观空间分辨率。实验中，样品的有效采样长度L＝SW/γG_a；表观空间分辨率Δ_z＝L/N_P1，根据实验所需，调整上述参数。

4)替换样品为震荡后的乳状液样品，进行数据采样；

在步骤4)中，所述数据采样时，采集单次所有层面空间分辨谱的时间需要1min左右。

5)重复步骤4)，直到乳状液系统分层过程稳定；

在步骤5)中，所述直到乳状液系统分层过程稳定的时间可为120min；所述重复步骤4)是指1D PHASICS序列的单次采样为1min，实验中可每min都进行采样，以实时动态监测乳化层形成后到系统分层稳定的整个过程。

6)将采集到的原始FID数据用Matlab软件(Version R2014a)对FID进行数据重排、傅里叶变换，得到高分辨的二维谱图；

在步骤6)中，所述二维谱图由一系列来自不同体素的一维谱信号堆叠而成。

7)提取出二维谱中每一层的一维谱，对每条一维谱进行分峰拟合和积分，得到积分数据，再将积分数据导入Origin软件(Version Pro8)，按照时间空间规律对数据进行分类整理；

在步骤7)中，所述每条一维谱来源于层厚为Δ_z的体素内的物质；由于1D>

所述按照时间空间规律对数据进行分类整理，是将获得的积分数据作为定量分析的依据导入Origin软件(Version Pro8)，将数据点画在横坐标为时间(min)，纵坐标为信号强度(即积分值)的坐标轴上；将同一层面上不同时间的积分点连接成一条曲线，即可得到该层面上油物质随时间变化的规律以及在空间上的变化规律。

8)实验结果分析。

在步骤8)中，所述实验结果分析的具体方法可为：分析不同空间位置上信号强度的演化规律，得到系统的分层相对稳定时间和乳化层厚度，其中分层相对稳定时间可以由趋势图直观读取出，而由于每条曲线所代表的谱图信息来自空间位置一个体素内，乳化层厚度可通过乳化层区域的曲线条数与空间分辨率计算得出。

在本发明中，通过研究在乳化剂存在下水油乳状液的形成和稳定分层过程，探索了利用高分辨率的空间分辨谱方法——1D PHASICS脉冲序列在分子水平上研究不均匀的多相乳状液系统的可行性。因此本发明可获得以下有益效果：

1)与传统的研究乳状液性质的方法相比，本发明的NMR方法具有可重复性、非侵入性等优点，得到的结果展示了乳状液分层相对稳定时间和在空间上的物质变化趋势，我们可以从中得到乳状液达到分层稳定状态所需的时间和稳定后乳化层的厚度。

2)通过对不同乳化剂含量的样品进行对比实验，我们可以得到乳化剂浓度对于乳化过程的影响。通过对不同水油体系样品进行对比实验，我们可以得到不同种类的油在乳化性质上的异同。

3)本发明所采用的核磁共振脉冲序列为1D PHASICS序列，该序列可以在仅配备有z轴梯度探头的高分辨NMR谱仪上实施。不同于依赖选择性激发的方法，1D PHASICS方法通过加入EPSI快速采样模块，实现单次采样即可获得全部空间信息。采样时间短，适合对动态过程或化学反应进行研究。

附图说明

图1为1D PHASICS脉冲序列。在图1中，RF轴上的脉冲是非选择性90°脉冲；Ga为频率编码强度；Ta为单一正或负频率编码梯度下的采样时间；Na为采样重复次数；Gz轴上的补偿梯度Gs用于移动回波中心。

图2为120min时，泊洛沙姆188含量为0.35g/L的芝麻油-水体系乳状液在相对稳定的分层状态下的二维谱图。

图3为120min时，泊洛沙姆188含量为0.35g/L的芝麻油-水体系乳状液样品从二维谱中逐层提取出的部分一维谱，根据不同的空间位置从上而下排列。

图4为泊洛沙姆188含量为0.35g/L的芝麻油样品在整个检测过程中各个层面的油含量的变化趋势，其中，油含量曲线根据空间位置的不同，从上往下编号为1至40，空间分辨率为0.40mm。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本实施例适用于使用快速核磁共振空间分辨方法监控油-水体系的乳状液形成到油、水及乳化层分层稳定的过程，检测这一过程中物质的变化：

(1)本实验所用的芝麻油均购自当地超市并且直接使用未经任何预处理。泊洛沙姆188和丙酮(99.5％纯度)购自当地化学产品零售商(Jilin GmbH，Xiamen，China)并直接使用而无需进一步纯化。D₂O(99.8％)是Norell(USA)的产品。D₂O和蒸馏水制备乳液。200μL的D₂O和1800μL的蒸馏水配置成为水相，将泊洛沙姆188按0.35g/L的比例分散在水相中并在室温下用涡流旋转以确保完全溶解。取2000μL芝麻油，与水相混合，在室温下用涡旋旋转5min，使样品充分震荡成为乳状液。取550μL充分震荡，后转移到5mm的标准NMR管中，放入NMR谱仪之前再次振动。

(2)样品检测

本实验使用的仪器为500MHz Varian NMR核磁共振谱仪，脉冲序列为1D PHASICS序列，采样温度为298K，直接维采样点数为600，间接维采样点数为80。

在正式实验之前，使用稳定的参考样品进行匀场以提供相对均匀的场。将已经制备好的溶液样品核磁管置于500MHz Varian NMR核磁共振谱仪用常规一维脉冲序列采样一张一维谱，获得谱线的线宽，为谱宽参数设置提供依据，同时线宽值反映了磁场环境均匀性情况。

打开1D PHASICS序列，根据实验需要，设置实验参数。对本实验来说，实验参数包括直接维谱宽SW＝500kHz，频率编码强度Ga＝36.6G/cm，单一正或负频率编码梯度下的采样时间Ta＝320μs，重复采样次数(直接维采样点数)Na＝600，间接维采样点数Np₁＝80。根据以上实验参数，可以计算出样品有效长度L＝32mm；表观空间分辨率Δ_z＝0.40mm。

从2D图提取的每个1D NMR光谱包含厚度为0.40mm的每个体素内样品的信息。单次1D PHASICS采样为1min，每一分钟都进行采集，以监测乳化层形成后到系统分层稳定的整个过程。

(3)实验数据处理

采集到的原始数据用Matlab软件(Version R2014a)对谱图进行数据重排、傅里叶变换，得到高分辨的二维谱图，如图2。二维图由一系列来自不同体素的一维谱信号堆叠而成，将部分一维谱逐条提取出来，如图3，每条一维谱包含了层厚为Δ_z的体素内的物质。通过选择合适的参数对来自油的亚甲基基团(1.30ppm处)的谱峰进行高斯拟合，可以绘制出其单峰曲线。然后通过对拟合曲线进行积分获得定量分析的数据。将数据导入Origin软件(Version>

(4)实验结果处理分析

图2为120min时样品的二维谱图，从二维图中可以发现，芝麻油样品的二维谱的下半部分显示水信号，上半部分显示油信号，在界面处，水油信号同时存在。将二维谱图与120min时样品实物进行对比，可知当样品处于相对稳定的状态时，分成了三个不同的相，包括顶部的油相，中间的乳化层，底部的水相。这表明稳定的过程中过量的油和水已经从乳状液中分离出来。图3中，从二维谱中提取的几个1D NMR谱也体现了油物质的峰强度的在空间上自上往下呈减少的趋势，水峰强度呈递增的趋势。然而，由于三相之间的模糊边界，乳化层的精确厚度不能从样品外观或二维谱中直接获得。

而通过对积分数据的收集，分析不同空间位置上信号强度的演化规律，可得到系统的的相对分层稳定时间和乳化层厚度。其中相对分层稳定可以由趋势图直观的读取出，样品在40min左右达到较稳定的相分离状态。从曲线图(图4)中可以发现分层稳定后，曲线分别在上部、中部和下部三个区域各自重叠通过分析可得，分别对应油相，乳化层，水相。而由于每条曲线所代表的空间位置信息来自一个体素内，乳化层厚度可通过乳化层区域的曲线条数与表观空间分辨率计算得出。经过计算，样品的乳化层厚度约为3.2mm。

综上所述，利用1D PHASICS序列可以对乳状液系统从形成到稳定分层过程进行监测。得到的高分辨的核磁共振空间分辨谱，为研究乳化剂含量对乳状液系统从形成到稳定分层的影响提供了依据，除了上述实例外，该方法也可用于研究不同水油体系形成的乳状液的乳化性质，得到不同油类的乳化性能的相关结论。

本发明例举的实施例旨在更进一步阐述这种应用核磁共振空间分辨谱技术监控乳状液系统从形成到稳定分层过程的具体操作，而不对本发明的范围构成任何限制。