一种提升PHA合成菌产出段菌种排放量的方法

摘要

本发明公开了一种提升PHA合成菌产出段菌种排放量的方法，所述方法以PHA合成菌产出段SBR反应器排出的PHA合成菌为菌源，进行底物分段补加实现PHA合成菌的扩大培养，再进入第三阶段完成PHA的合成进而大幅度提升工艺整体的PHA产量和容积产率。本发明引入的“碳源储存/内源生长”扩大培养模式承担了较高的工艺负荷，可以使产PHA菌群的筛选段能在较低的底物负荷范围实现稳定可控的运行，解决了工艺稳定运行与高产PHA的矛盾，能够有效推进混菌PHA合成的规模化应用。将本发明提出的“碳源储存/内源生长”扩大培养模式嵌入传统的三段式工艺之后可以显著提升工艺整体的PHA产量，其最大PHA产率约为原工艺的80倍。

说明书

技术领域

本发明属于生物可降解塑料合成和废物资源回收技术领域，涉及一种基于混合菌群扩大培养的高产聚羟基烷酸酯工艺。

背景技术

聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate，PHA）是一种生物聚酯，它是微生物在胞内合成的一种储存能量的物质，用来抵御不平衡的外在环境压力。PHA在物理性能上类似于传统的热塑性塑料，因此它可替代传统的化学合成塑料，减轻日益严重的“白色污染”问题。目前，生物合成可降解塑料（PHA）的商业化推广以纯菌发酵为主，但是相对较高的原料费用、消毒成本及微生物分离纯化费用限制了PHA的规模化应用。而混和菌群产PHA工艺作为一种完全开放式的发酵工艺，无需底物灭菌和严格的杂菌污染防范，并且可以利用废弃碳源，在废水产酸调控技术的基础上正成为技术研究的热点。

混合菌群三阶段PHA合成工艺普遍分为以下三个阶段：

1）底物产酸段：复杂有机底物发酵成小分子有机酸；

2）PHA合成菌产出段：以小分子有机酸作碳源在序批式生物反应器（Sequence BatchReactor，SBR）中驯化PHA合成菌，SBR稳定运行后定期排放驯化好的PHA合成菌种，这时排放的PHA合成菌有PHA合成能力但体内PHA含量低，可以在高有机负荷及好氧条件下在体内积累PHA；

3）PHA合成段：以小分子有机酸为底物，以第二阶段排放的PHA合成菌为菌泥，好氧条件下分批投加有机酸底物，完成PHA合成菌内的PHA合成。

上述三个阶段中，第二阶段尤为关键，因为只有SBR完成PHA合成菌的驯化，并可稳定地、尽量多的排放PHA合成菌，第三阶段才能利用有机酸底物合成更多的PHA。第二阶段的驯化普遍采用好氧条件下的“饱食—饥饿”（Feast-Famine，FF）模式，即在好氧反应条件下随反应进程而为混合菌群营造一种“营养丰富-营养匮乏”生长条件。基于FF的三段式混合菌群工艺，可以实现PHA合成菌的筛选，这种菌在第三阶段有较高的PHA含量，已经取得了接近于纯菌发酵PHA含量的水平，但是为了维持PHA合成菌可以在第二阶段稳定排放，菌群驯化阶段（第二段）的有机负荷需要控制在较低的范围内，这直接导致了用于PHA合成的混合菌群产量过低，进而限制了工艺总体PHA产量的提升。相较于已普遍投入商业化运营的纯菌PHA合成工艺，具备资源效益和环境效益的混合菌群工艺的规模化应用却迟滞不前，较低的PHA产率是其中一个关键原因。因此改进第二阶段即PHA合成菌驯化段的运行模式，保持SBR的稳定并提升PHA合成菌排放量，将显著提升PHA总产量，这对混合菌群PHA合成的规模化应用产生重要的推进作用。

发明内容

本发明为了改变PHA合成菌产出段菌种输出量低的缺陷，提供了一种提升PHA合成菌产出段菌种排放量的方法，该方法以PHA合成菌产出段SBR反应器排出的PHA合成菌为菌源，进行底物分段补加实现PHA合成菌的扩大培养，再进入第三阶段完成PHA的合成进而大幅度提升工艺整体的PHA产量和容积产率。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种提升PHA合成菌产出段菌种排放量的方法，包括如下步骤：

一、建立菌泥扩培系统：所述菌泥扩培系统由N个菌泥扩培反应器组成，每个菌泥扩培反应器的运行沿时间分为n个重复的批次，每个批次分为n-1和n-2两段；

二、在步骤一中的每个菌泥扩培反应器启动时，将一定量取自三段式混菌PHA工艺PHA合成菌产出段中的菌泥置于菌泥扩培反应器内，采用“碳源储存/内源生长”扩培模式，即：在n-1段补加适量的底物A，控制底物A与微生物的质量比例不高于6.4 g COD/g VSS/d，之后向混合液曝气，监控反应体系的溶解氧水平，使其不低于3 mg/L；当体系内溶解氧水平达到饱和状态时，停止曝气进入静沉阶段，排掉一定体积的上清液进入本批次的n-2段；向原菌泥扩培反应器中补加与排掉上清液相同体积的底物B，向混合液曝气并监控反应体系的溶解氧水平，使其不低于3 mg/L；待体系中铵根离子消耗完毕之后，反应停止进入静沉阶段，排掉上清液进入下一批次的运行：进底物A→曝气→静沉→排水→进底物B→曝气→静沉→排水；如此循环并梯度增加碳源补加量，直至生物总量/扩培初始的生物总量处于40~60g/g之间。

本发明与现有混菌PHA相比，具有如下优点：

1、本发明提出的“碳源储存/内源生长”扩大培养模式可以在实现产PHA生物量大幅增殖的同时有效保持菌群的PHA合成能力（图3）；

2、将本发明提出的“碳源储存/内源生长”扩大培养模式嵌入传统的三段式工艺之后可以显著提升工艺整体的PHA产量，其最大PHA产率约为原工艺的80倍（图4）；

3、从工艺整体来看，本发明引入的“碳源储存/内源生长”扩大培养模式承担了较高的工艺负荷，可以使产PHA菌群的筛选段能在较低的底物负荷范围实现稳定可控的运行，解决了工艺稳定运行与高产PHA的矛盾，能够有效推进混菌PHA合成的规模化应用；

4、本发明中用到的碳源可以是缺氮或无氮的高浓度有机废弃碳源，诸如糖蜜废水酸化液、造纸废水酸化液以及粗甘油（生物柴油副产品），在利用废弃碳源实现资源回收的同时，也能够通过削减生化需氧量带来一定的环境效益。

附图说明

图1为本发明中菌泥扩培反应器的运行模式图；

图2为将扩大培养模式嵌入传统三段式PHA合成工艺示意图；

图3为反映扩大培养过程中生物量扩增情况与混合菌群PHA合成能力的沿程变化的具体实例，黑色粗实线表示扩培批次反应器有效工作容积，黑色实心正方形表示混合菌群的胞内最大PHA合成比例，黑色空心圆圈表示混合菌群生物量；

图4为本发明中连续产出PHA的扩大培养工艺段运行模式示意及实际运行中工艺PHA产量对比，以生产周期11天为例，C1代表第一个菌泥扩培批次反应器，以此类推；

图中，纵坐标的PHA产率值根据实际运行结果计算得到。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。

本发明提供了一种提升PHA合成菌产出段菌种排放量的方法，具体步骤如下：

一、建立菌泥扩培系统：所述菌泥扩培系统由N个菌泥扩培反应器组成，如图1所示，每个菌泥扩培反应器的运行沿时间分为n个重复的批次（批次1，批次2……，批次n），每个批次沿时间分为两段（n-1和n-2），对应地使用到两种底物，底物A：主要是以不含氮元素或限氮的以小分子有机酸（乙酸、丙酸、丁酸、戊酸）或甘油为主的碳源；底物B：为不含碳源的菌种营养液，菌种营养液中N、P元素与底物A中碳源的相对比例应满足以下条件：COD（碳源）/ N/ P =100 / （6~10） / （1~1.5）（质量比），同时应补加镁、钙和微量元素以满足微生物的生长需求。

二、在步骤一中的每个菌泥扩培反应器启动时，将一定量取自三段式混菌PHA工艺PHA合成菌产出段中的菌泥置于反应器内，采用“碳源储存/内源生长”扩培模式，即：在第一批次1-1段中补加适量的底物A，控制底物A与微生物的质量比例应不高于6.4 g COD/gVSS/d，之后向混合液曝气，监控反应体系的溶解氧水平，使其不低于3 mg/L，产PHA混合菌群在此阶段主要将胞外碳源转化为PHA颗粒储存于细胞内（碳源储存段）。当体系内溶解氧水平达到饱和状态时，停止曝气进入静沉阶段，排掉一定体积的上清液进入本批次的1-2段中。在批次1-2段中向原菌泥反应器补加与排掉上清液相同体积的底物B，向混合液曝气并监控反应体系的溶解氧水平，使其不低于3 mg/L，产PHA菌群在该阶段利用胞内储存的碳源和游离态的营养元素进行细胞的生长（内源生长段）。待体系中铵根离子消耗完毕之后，反应停止进入静沉阶段，排掉上清液进入下一批次2-1段中，菌泥扩培反应器一个完整的批次运行应包含“进底物A→曝气→静沉→排水→进底物B→曝气→静沉→排水”动作，如此循环（如图1所示）。当体系内生物量增长至一定程度，反应系统的污泥负荷低于1.6 g COD / gVSS / d时，在碳源储存段增加底物A的补加量，使污泥负荷接近于6.4 g COD/g VSS/d，内源生长段的营养元素浓度按照步骤一中与碳源的质量比同步提升。为防止惰性生物质积累，扩培反应期间可以选择在每一批次的第二段沉淀前排掉一定量的菌泥混合液，以每天排出1 / 10~1 / 20混合液（占总体积比）为宜。一个完整的扩培周期包含的批次数应以满足生物量扩增倍数（扩培结束时的生物总量/扩培初始的生物总量，g/g）处于40~60之间为宜。

三、将扩培模式嵌入传统的三段式PHA合成工艺中，即将富集反应器的排泥收集用于扩培反应，周期结束后，菌泥扩培系统中的菌泥全部用来进行后续第三阶段PHA的合成（图2）。PHA的生产周期（以天计）应包含完整的扩培周期和后续的PHA生产时间。按照第二步中所述工艺模式依次运行多个扩培批次反应器，扩培批次反应器的个数等于一个完整生产周期的天数，若有小数，向上取整（如图4所示）。经过一个扩培周期的时间，工艺整体可以以天为最小单位实现PHA的连续产出。