一种孤儿受体GPR64的配体多肽及其编码序列和应用

摘要

本发明公开了一种孤儿受体GPR64的配体多肽及其编码序列和应用。本发明制备得到的孤儿受体GPR64的配体多肽能够有效激活GPR64，并使GPR64产生Gs、Gq、β‑arrestin1和β‑arrestin2信号通路，表明本发明得到的配体多肽可构成开发男性生殖疾病诊断和/或治疗药的基础；从而，本申请提供了有前景的化合物，其可用于开发治疗男性生殖系统疾病的新药物。孤儿受体GPR64的配体多肽具有(I)、(II)所示的氨基酸序列的中的任意一个：(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种孤儿受体GPR64的配体多肽及其编码序列和应用。

背景技术

孤儿受体GPR64(G蛋白偶联受体64)，其也被称为ADGRG2(粘附型G蛋白偶联受体G2)或HE6(人附睾特异性蛋白6)，是调节雄性生殖系统行使正常功能的一个关键分子。GPR64在人类和小鼠的附睾和输精小管呈现特异性高表达，在甲状旁腺，中枢神经系统，前列腺，尤因肉瘤、纤维样关节炎中少量表达(Obermann,Samalecos et al.2003；Davies,Baumann et al.2004；Galligan,Baig et al.2007；Haitina,Olsson et al.2008；Richter,Fasan et al.2013；Hamann,Aust et al.2015)。在雄性生殖系统中，GPR64在睾丸液的重吸收和精子浓度调节上起重要作用，当GPR64被敲除后，雄性小鼠出现精子淤积在输精小管以及输精小管出现不能正常重吸收小管液的现象，并且雄性小鼠的生育能力下降，但是对于雌性小鼠的生育能力并不受到影响(Obermann,Samalecos et al.2003；Kirchhoff,Osterhoff et al.2008)。

鉴于GPR64在雄性生殖系统中的重要作用，其已成为开发男性生殖疾病的新疗法的重要靶点。因此，寻找有效的、特异性结合GPR64的配体，可能构成开发男性生殖疾病诊断和/或治疗药的基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种孤儿受体GPR64的配体多肽及其编码序列和应用，实验研究表明，本发明制备得到的孤儿受体GPR64的配体多肽能够有效激活GPR64，并使GPR64产生Gs、Gq、β-arrestin1和β-arrestin2信号通路，表明本发明得到的配体多肽可构成开发男性生殖疾病诊断和/或治疗药的基础。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：

本发明提供一种多肽，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列的中的任意一个：

(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；具体的，修饰所得多肽具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列；

优选的，所述取代、缺失或添加氨基酸的个数为1～3个；

本发明还提供了一种编码上述多肽的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的多肽的核苷酸序列。对于编码本发明所述多肽的氨基酸序列的DNA分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于多肽的氨基酸序列的DNA分子。

在本发明的一些实施例中，本发明提供了编码上述多肽的DNA分子，其具有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。

本发明还提供一种重组载体，其含有上述DNA分子。

本发明的多肽可以使用化学方法(Peptide Chemistry，A practicalTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin)制造。在本发明的一种典型实施方式中，本发明多肽可以通过固相技术(Roberge JY等，(1995)Science 269：202-204)合成，从树脂上切下，并通过制备用高效液相色谱法(例如Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles,WH Freeman and Co,New York NY)纯化。

在本发明的一些实施例中，本发明还提供一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得具有编码如(I)或(II)所限定的氨基酸序列的DNA分子；

(2)获取DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

(3)取重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

(4)诱导转化体表达蛋白，经分离纯化即得上述多肽。

其中，(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；具体的，修饰所得多肽具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列；

优选的，所述取代、缺失或添加氨基酸的个数为1～3个；

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。

优选的，原核系统宿主细胞为大肠杆菌。

本发明的另一方面，提供了上述多肽作为孤儿受体GPR64的配体中的应用。

本发明的另一方面，提供了上述多肽激活孤儿受体GPR64的活性中的应用。

最后，本发明还提供一种治疗孤儿受体GPR64异常表达相关疾病的药物制剂，所述药物制剂由多肽及药学上可接受的辅料组成；其中，多肽具有(I)、(II)所示的氨基酸序列的中的任意一个：

(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，所述孤儿受体GPR64异常表达相关疾病包括弱精症、死精症、附睾淤积症、伴睾丸生精功能障碍、男性不育及其他男性生殖系统疾病。

作为优选，本发明提供的药物制剂为凝胶剂、粉针剂、膜剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂。

本发明有益效果：本发明提供多肽能够靶向GPR64成为GPR64的亲和性配体；发明制备得到的孤儿受体GPR64的配体多肽能够有效激活GPR64，并使GPR64产生Gs、Gq、β-arrestin1和β-arrestin2信号通路，从而，本申请提供了有前景的化合物，其可用于开发治疗男性生殖系统疾病的新药物。

附图说明

图1为本发明多肽激活cAMP效果图；

图2为本发明多肽激活NFAT转录调控效果图；

图3为本发明多肽激活β-arrestin1招募效果图；

图4为本发明多肽激活β-arrestin2招募效果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

正如背景技术所介绍的，现有技术中GPR64在雄性生殖系统中的重要作用，其已成为开发男性生殖疾病的新疗法的重要靶点。因此，寻找有效的、特异性结合GPR64的配体，可能构成开发男性生殖疾病诊断和/或治疗药的基础。

本申请的一种典型的实施方式中，本发明提供一种多肽，其具有(I)、(II)所示的氨基酸序列的中的任意一个：

(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；具体的，修饰所得多肽具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列；

其中，所述取代、缺失或添加氨基酸的个数为1～3个；

本发明的另一典型实施方式中，提供了一种编码上述多肽的DNA分子。由于密码子的简并性，可以存在很多种能够编码本发明所述的多肽的核苷酸序列。对于编码本发明所述多肽的氨基酸序列的DNA分子，本领域技术人员可以很容易的利用现有公知的方法制造合成。诸如，通过选择对应于构成所设计的氨基酸序列的氨基酸残基的密码子，可很容易地确定和提供相应于多肽的氨基酸序列的DNA分子。

在本发明的一些实施例中，本发明提供了编码上述多肽的DNA分子，其具有SEQ IDNO:3所示的核苷酸序列。

本发明的另一典型实施方式中，本发明还提供一种重组载体，其含有上述DNA分子。

本发明的多肽可以使用化学方法(Peptide Chemistry，A practicalTextbook.Mikos Bodansky,Springer-Verlag,Berlin)制造。在本发明的一种典型实施方式中，本发明多肽可以通过固相技术(Roberge JY等，(1995)Science 269：202-204)合成，从树脂上切下，并通过制备用高效液相色谱法(例如Creighton(1983)ProteinsStructures And Molecular Principles,WH Freeman and Co,New York NY)纯化。在本发明的另一种典型实施方式中，本发明多肽可实现自动化合成，依照制造商提供的说明书使用431A肽合成器(Perkin Elmer)进行。

根据普通的重组DNA技术，利用本发明的核苷酸序列可表达或制备重组的多肽，因此在本发明的另一典型实施方式中，本发明还提供一种多肽的制备方法，包括以下步骤：

(1)获得具有编码如(I)或(II)所限定的氨基酸序列的DNA分子；

(2)获取DNA分子与表达载体融合，构建重组表达载体；

(3)取重组表达载体转入宿主细胞，获得转化体；

(4)诱导转化体表达蛋白，经分离纯化即得上述多肽。

需要说明的是，在适当的培养条件与培养基中培养经转化的宿主细胞，使其生长到恰当的细胞密度之后，用适当的方法(例如温度转变或化学药品诱导)诱导所选择的启动子，并将细胞再培养一段时间。针对不同的宿主菌株或细胞选择以及所表达的目的蛋白质的性质相应的培养条件和培养基在本领域技术人员知识范围之内。

同时，需要说明的是，在合适的启动子控制下可以在哺乳类细胞、酵母、细菌或其它细胞中表达成熟蛋白。利用由本发明的DNA构建体衍生的RNA，也可以用无细胞翻译体系产生这种蛋白质(Sambrook,J.(1989)，《分子克隆，实验室手册》，第18章第4节，ColdSpring Harbor Press；Plainview,N.Y.)。

其中，(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

在本发明的一些实施例中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；具体的，修饰所得多肽具有如SEQID NO.2所示的氨基酸序列；

其中，所述取代、缺失或添加氨基酸的个数为1～3个；

在本发明的一些实施例中，宿主细胞为原核系统宿主细胞或真核宿主细胞。

本发明的另一典型实施方式中，原核系统宿主细胞为大肠杆菌。

本发明的另一典型实施方式中，提供了上述多肽作为孤儿受体GPR64的配体中的应用。

本发明的另一典型实施方式中，提供了上述多肽激活孤儿受体GPR64的活性中的应用。

本发明的另一典型实施方式中，本发明还提供一种治疗孤儿受体GPR64异常表达相关疾病的药物制剂，所述药物制剂由多肽及药学上可接受的辅料组成；其中，多肽具有(I)、(II)所示的氨基酸序列的中的任意一个：

(I)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(II)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列。

其中，修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。

在本发明的另外一些实施例中，修饰为甲基化；作为优选，多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

其中，所述孤儿受体GPR64异常表达相关疾病包括弱精症、死精症、附睾淤积症、伴睾丸生精功能障碍、男性不育及其他男性生殖系统疾病。

本发明的另一典型实施方式中，本发明提供的药物制剂为凝胶剂、粉针剂、膜剂、水剂、汤剂、冲剂、片剂、丸剂、缓释剂、控释剂、粉剂、糊剂、含漱剂、舌下片、吹入剂、烟剂、口服液、口服片、注射液、糖浆剂、煎膏剂、酒剂、散剂、颗粒剂、丸剂、片剂或胶囊剂。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例说明本申请的技术方案。

实施例1多肽对孤儿受体GPR64激活表达

实验步骤：

1.采用431A肽合成器(Perkin Elmer)合成下述多肽：

Val-Ser-Phe(4Me)-Gly-Ile-Leu-Leu-Asp-Leu-Ser-Arg-Thr-Ser-Leu-Pro(SEQID NO：2)；

2.采用分子生物学方法，构建基因重组的mGPR64重组质粒，以HEK293细胞过表达mGPR64，利用GloSensor方法可以检测GPR64下游Gs介导的第二信使cAMP的原理，以引起cAMP变化的量表示多肽刺激GPR64引起的Gs活力变化情况；利用NFAT-荧光素酶表达系统可以检测GPR64下游Gq介导的第二信使钙离子的原理，以引起荧光素酶变化的量表示多肽刺激GPR64引起的Gq活力变化情况；利用GPR64与β-arrestin1的生物发光共振能量转移方法可以检测GPR64对β-arrestin1招募的原理，以引起生物发光共振能量转移的效率表示多肽刺激GPR64引起的β-arrestin1招募变化情况；利用GPR64与β-arrestin2的生物发光共振能量转移方法可以检测GPR64对β-arrestin2招募的原理，以引起生物发光共振能量转移的效率表示多肽刺激GPR64引起的β-arrestin2招募变化情况。

将待测多肽化合物用HBSS配制成工作浓度为500pmol/L、5nmol/L、50nmol/L、500nmol/L、5μmol/L、50μmol/L和500μmol/L，加入到待测过表达mGPR64和GloSensor的HEK293细胞中，阴性对照为表达空载体pcDNA3和GloSensor的HEK293细胞，利用多功能酶标仪测定发光值，结果见图1。

将待测多肽化合物用HBSS配制成工作浓度为500nmol/L、5μmol/L、50μmol/L和500μmol/L，加入到待测过表达mGPR64和NFAT-荧光素酶的HEK293细胞中，阴性对照为表达空载体pcDNA3和NFAT-荧光素酶的HEK293细胞，利用多功能酶标仪测定发光值，结果见图2。

将待测多肽化合物用HBSS配制成工作浓度为500nmol/L、5μmol/L、50μmol/L和500μmol/L，加入到待测过表达mGPR64和β-arrestin1的HEK293细胞中，阴性对照为表达空载体pcDNA3和β-arrestin1的HEK293细胞，利用多功能酶标仪测定发光值，结果见图3。

将待测多肽化合物用HBSS配制成工作浓度为500nmol/L、5μmol/L、50μmol/L和500μmol/L，加入到待测过表达mGPR64和β-arrestin2的HEK293细胞中，阴性对照为表达空载体pcDNA3和β-arrestin2的HEK293细胞，利用多功能酶标仪测定发光值，结果见图4。

实验结果表明：多肽化合物对GPR64表现出激活效果，并使GPR64产生Gs、Gq、β-arrestin1和β-arrestin2信号通路。激活Gs信号通路的半激活浓度EC50为47.15nmol/L，激活Gq信号通路的半激活浓度EC50为2.164mol/L，激活β-arrestin1信号通路的半激活浓度EC50为20.04μmol/L，激活β-arrestin2信号通路的半激活浓度EC50为30.94μmol/L。

上述实验表明本发明提供多肽能够靶向GPR64成为GPR64的亲和性配体；能够有效激活GPR64，并使GPR64产生Gs、Gq、β-arrestin1和β-arrestin2信号通路。从而本申请提供了有前景的化合物，其可用于开发治疗男性生殖系统疾病的新药物。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种孤儿受体GPR64的配体多肽及其编码序列和应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<400> 1

Val Ser Phe Gly Ile Leu Leu Asp Ser Leu Arg Thr Ser Leu Pro

1 5 1015

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工合成

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Xaa(3)= 4Me-Phe

<400> 2

Val Ser Xaa Gly Ile Leu Leu Asp Ser Leu Arg Thr Ser Leu Pro

1 5 1015

<210> 3

<211> 663

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtgagcttcg gcatcctgct ggacagcctg aggaccagcc tgccc 45