公开/公告号CN106954549A
专利类型发明专利
公开/公告日2017-07-18
原文格式PDF
申请/专利权人 水生藻安生物科技(武汉)有限公司;
申请/专利号CN201710109348.8
发明设计人 不公告发明人;
申请日2017-02-27
分类号
代理机构杭州求是专利事务所有限公司;
代理人林松海
地址 430000 湖北省武汉市东湖高新技术开发区高新大道666号留学生创业园C6栋325号
入库时间 2023-06-19 02:48:20
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-05-28
授权
授权
2017-08-11
实质审查的生效 IPC(主分类):A01H4/00 申请日:20170227
实质审查的生效
2017-07-18
公开
公开
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及沉水植物篦齿眼子菜的组培和快速繁殖方法,该方法是采取完全无菌和严格的控温措施,实现了沉水植物篦齿眼子菜在实验室大量生产,并可以推广到生态环境修复领域。
背景技术
篦齿眼子菜属于眼子菜属,是一种分布于全世界的沉水植物。篦齿眼子菜生于河沟、水渠、池塘等各类水体,水体多呈微酸性或中性,在中国西北地区亦见于少数微碱性水体及咸水中。全球分布,尤以两半球温带水域较为习见,对水体中的氮磷有突出的净化效果。
近几十年来,因为环境污染和栖息地改变等因素,篦齿眼子菜从其先前生长的环境中退化或者消失。可惜的是,目前尚缺乏成熟技术,可以大规模扩繁篦齿眼子菜优质工程苗,同时克服该物种在自然环境中种源退化且污染严重的问题。
发明内容
本发明提供了一种篦齿眼子菜组织培养与快速繁殖方法,该方法是在无菌条件下,采取控温措施,给予固定光照,建立植物无菌苗体系,可常年提供大量无菌幼苗。方法易行,操作方便,产量高。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术措施:
一种篦齿眼子菜组织培养与快速繁殖方法,包括以下步骤:
A、外植体选择与预处理:选择颜色鲜绿,生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体,用碱性洗涤剂浸泡10min,再用自来水冲洗1小时,用蒸馏水反复冲洗4-5次,用无菌水再反复清洗4-5次,置于无菌操作台;
B、无菌外植体的制备:在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒,用无菌水冲洗3-4次,进行表面消毒5分钟,无菌水冲洗4-5次,在无菌滤纸上将水吸干,待用;
C、丛生芽诱导:选择0.10 mg/L KT(激动素)和0.01mg/L NAA(萘乙酸)的MS固体培养基,蔗糖质量浓度为3%,pH调至5.8-6.0,固体培养基装于组培瓶;培养基经过120℃灭菌处理20min,冷却后,接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体,于光照培养箱中静置培养,待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养;
D、增殖培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2MS液体培养基,添加0.05-2.00 mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)和0.01-0.50 mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌后,接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中,进行增殖培养;
E、生根培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2 MS液体培养基,添加0.01-1.00 mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌后,接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置,进行生根培养;
F、扩大培养:选择长度为17.0-20.0cm的无菌幼苗,置于增殖培养基中,进行工业化生产;
G、炼苗和移栽:待篦齿眼子菜无菌幼苗长至25.0cm即可炼苗,打开瓶盖,室温下炼苗1-2d后洗净培养基,取出试管苗,移栽至自然水体中;
所述的步骤C、D、E、F均采用无菌环境,光照60-70μE/(m2·s),光照周期为12h/d,室内温度(25±2)℃。
优选的,步骤B中,所述的表面消毒采用0.1%氯化汞。
优选的,步骤C中,KT的浓度为0.10mg/L,NAA 的浓度为0.01mg/L。
本发明具有以下有益效果:
篦齿眼子菜是修复受损水生态环境的先锋种类,但目前关于篦齿眼子菜组织培养的技术未见报道。本发明对篦齿眼子菜进行无菌繁殖体系建立,对以后对篦齿眼子菜进行系统的研究、湿地的保护与修复以及生态环境的修复具有重要意义。利用本发明可以不受季节、温度、地域影响,生产大量的篦齿眼子菜无菌苗。一个长为17-20cm的无菌幼苗经过一个月的培养可以繁殖出29-47cm长的幼苗,湿重可增加24倍,30d的增殖系数最高可达到15倍,优越于自然水体植物的繁殖速度。
附图说明
图1是实施例1中篦齿眼子菜30d增殖情况;
图2是实施例2中篦齿眼子菜30d增殖情况。
具体实施方式
本发明实施例所使用的试剂,如未特别说明,市售的均可实现本发明,涉及的技术方案,如未特别说明,均可采用本领域的常规技术。
实施例中采用的MS培养基配方如下:单位mg/L,
KNO31900
NH4NO31650
MgSO4•7H2O370
KH2PO4170
CaCl2•2H2O440
MnSO4•4H2O22.3
ZnSO4•7H2O8.6
H3BO3>
KI 0.83
Na2MoO4•7H2O>
CuSO4.5H2O0.025
CoCL2.6H2O0.025
Na2-EDTA37.3
FeSO4•7>2O>
甘氨酸 2.0
盐酸吡哆醇 0.5
盐酸硫铵素 0.1
烟酸 0.5
肌酸 100
MS固体培养基为上述培养配方中加入6g/L琼脂。
实施例1
A、外植体选择与预处理:选择颜色鲜绿,生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体,用碱性洗涤剂浸泡10min,再用自来水冲洗1小时,用蒸馏水反复冲洗4-5次,用无菌水再反复清洗4-5次,置于无菌操作台;
B、无菌外植体的制备:在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒,用无菌水冲洗3-4次,再用0.1%氯化汞(加入几滴吐温80)进行表面消毒5分钟,无菌水冲洗4-5次,在无菌滤纸上将水吸干,待用;
C、丛生芽诱导:选择0.10 mg/L KT和0.01mg/L NAA的MS固体培养基,蔗糖质量浓度为3%,pH调至5.8-6.0,固体培养基装于组培瓶;培养基经过120℃灭菌处理20min,冷却后,接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体,于光照培养箱中静置培养,待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养;
D、增殖培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2MS液体培养基,添加2.00 mg/L 6-BA和0.50 mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌方式与芽诱导相同,接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中,进行增殖培养;
E、生根培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2MS液体培养基,添加0.01mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌方式与芽诱导相同,接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置,进行生根培养;
F、扩大培养:后期进行扩大传代培养,生产大量无菌植物时,选择长度为17.0cm的无菌幼苗,置于增殖培养基中,进行工业化生产;
G、炼苗和移栽:待篦齿眼子菜无菌苗长至25.00cm即可炼苗,打开瓶盖,室温下炼苗1-2d后洗净培养基,取出试管苗,移栽至自然水体中;
所述的步骤C、D、E、F均采用无菌环境,光照60-70μE/(m2·s),光照周期为12h/d,室内温度(25±2)℃。
本方法可以由一个外植体直接诱导出幼芽,再不断繁殖得到更多的丛芽,30 d的增殖系数达到15,植物重量增加23.9倍,长度增加1.6倍,且获得幼苗和自然环境中的篦齿眼子菜没有差别。存活率大于95%。实施例1中篦齿眼子菜30d增殖情况如图1所示。
实施例2
A、外植体选择与预处理:选择颜色鲜绿,生长健壮的可萌发腋芽的篦齿眼子菜茎段作为外植体,用碱性洗涤剂浸泡10min,再用自来水冲洗1小时,用蒸馏水反复冲洗4-5次,用无菌水再反复清洗4-5次,置于无菌操作台;
B、无菌外植体的制备:在无菌操作台上首先用75%乙醇浸泡15秒,用无菌水冲洗3-4次,再用0.1%氯化汞(加入几滴吐温80)进行表面消毒5分钟,无菌水冲洗4-5次,在无菌滤纸上将水吸干,待用;
C、丛生芽诱导:选择0.10 mg/L KT和0.01mg/L NAA的MS固体培养基,蔗糖质量浓度为3%,pH调至5.8-6.0,固体培养基装于组培瓶;培养基经过120℃灭菌处理20min,冷却后,接入灭菌处理后的1.0-2.0cm的篦齿眼子菜外植体,于光照培养箱中静置培养,待幼芽长至5.0-6.0cm进行增殖培养;
D、增殖培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2MS液体培养基,添加0.05mg/L 6-BA和0.01mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌方式与芽诱导相同,接入5.0-6.0cm的幼芽置于光照培养箱中,进行增殖培养;
E、生根培养:选择蔗糖质量浓度1.5%的1/2MS液体培养基,添加1.00 mg/L NAA的激素;液体培养基分装于500毫升组培瓶中,每瓶100毫升,灭菌方式与芽诱导相同,接入长6.0-8.0cm的幼苗置于光照培养箱中静置,进行生根培养;
F、扩大培养:后期进行扩大传代培养,生产大量无菌植物时,选择长度为20.0cm的无菌幼苗,置于增殖培养基中,进行工业化生产;
G、炼苗和移栽:待篦齿眼子菜无菌苗长至25.00cm即可炼苗,打开瓶盖,室温下炼苗1-2d后洗净培养基,取出试管苗,移栽至自然水体中;
所述的步骤C、D、E、F均采用无菌环境,光照60-70μE/(m2·s),光照周期为12h/d,室内温度(25±2)℃。
本方法由一个外植体直接诱导出幼苗,30 d的增殖系数达到10,植物重量增加24.8倍,长度增加2.6倍,获得的幼苗和自然环境中的篦齿眼子菜没有差别。存活率大于90%。实施例2中篦齿眼子菜30d增殖情况如图2所示。
表1所示为两个实施例中篦齿眼子菜的生长情况。
机译: ID-57D一种包含化合物ID-57D的组合物,所述化合物从齿齿苦苣菜提取物中分离出来,用于治疗或预防口干症
机译: ID-56D2一种包含化合物ID-56D2的组合物,所述化合物ID-56D2从齿齿苦苣菜提取物中分离出来,用于治疗或预防口干症
机译: 通过种子组织培养快速繁殖钛原的方法