降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法

摘要

本发明提供了一种降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法，该方法适于降低高分子或无机微纳米尺度颗粒表面的蛋白质吸附。通过二氧化硅壳层包裹微纳米颗粒表面，进而利用氨基硅烷偶联剂表面修饰，制备氨基化的微球。直接以表面氨基作为光引发位点，利用光引发表面接枝聚合，将聚乙二醇基甲基丙烯酸酯修饰在微纳米颗粒表面，进而通过甘氨酸修饰改性聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯，制备抗蛋白质非特异性吸附的功能化微球。该方法操作简便，同时微纳米颗粒表面的功能基团可以灵活调节，将极大拓展功能化高分子或无机复合粒子在多个领域，尤其是生物医用材料等方面的实际应用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种高分子材料的表面接枝改性方法，尤其涉及一种降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法。

背景技术

蛋白质在材料表面的非特异性吸附会导致许多不良的反应，如在生物医学方面，非特异性的蛋白质吸附，会导致生物传感器的灵敏度和选择性下降，植入体内的医用材料表面发生凝血导致炎症反应，以及导致载体聚集从而缩短血液循环时间降低药物时效性等，因此抗蛋白质非特异性吸附是材料领域面临的一个重要问题。高分子或无机微纳米尺寸的粒子已经在细胞培养、生物分离与纯化、免疫检测和诊断、药物载体等方面取得广泛的应用，因此微纳米颗粒表面的功能化修饰，提高抗蛋白质非特异性吸附的能力，对微纳米颗粒在生物医学领域的应用十分重要。

目前主要通过对粒子进行表面修饰改性，提高粒子的抗蛋白质非特异性吸附的能力，如聚乙二醇(PEG)及其衍生物、多糖和聚酰胺等亲水性非两性离子聚合物。可以采用物理吸附、化学吸附、共价接枝修饰等多种方法，将降低非特异性吸附的聚合物修饰在微纳米颗粒表面，其中共价接枝表面修饰的效率和稳定性相对较高，尤其是“由表面接枝”(grafting from)的修饰方式，表面聚合物接枝效率较高，并可以调节接枝的密度。但是表面共价接枝聚合往往需要加入引发剂等化学试剂，并且需要复杂多次的后处理提纯步骤。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种简便有效的表面修饰方法，显著降低微纳米颗粒表面的蛋白质非特异性吸附。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：1、一种降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法，具体包括以下步骤：

步骤1、制备二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒，将微纳米颗粒超声分散在十六烷基溴化氨的水溶液中，加入正硅酸乙酯和一定体积氨水后，室温搅拌进行水解反应，逐渐在微纳米颗粒表面沉积一层二氧化硅壳层，制得二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒。

步骤2、制备氨基化微纳米颗粒，将二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒超声分散在乙醇溶液中，加入氨基丙基三甲氧基硅烷和氨水，室温下搅拌进行水解反应，逐渐将氨基丙基三甲氧基硅烷接枝在颗粒的二氧化硅壳层表面，同时在微纳米颗粒表面进行氨基修饰，制得氨基化微纳米颗粒；

步骤3、通过表面光引发原位接枝聚合，首先将端羟基聚乙二醇基甲基丙烯酸酯单体溶于乙醇中；然后将一定质量的氨基化的微纳米颗粒加入单体乙醇溶液中，超声均匀分散后，直接放在紫外灯箱中，光引发单体原位聚合，同时不断搅拌使反应均匀进行，获得端羟基聚乙二醇修饰的微纳米颗粒；

步骤4、甘氨酸的胺基保护，将二碳酸二叔丁酯与甘氨酸的胺基反应，获得叔丁氧羰基(BOC)胺基保护的甘氨酸；

步骤5、将BOC保护的甘氨酸加入聚乙二醇修饰的微纳米颗粒中，甘氨酸的羧基与聚乙二醇端羟基反应，获得甘氨酸修饰的微纳米复合微球；

步骤6、将步骤5获得改性的微纳米颗粒分散在去离子水中，加入三氟乙酸，将碳酸二叔丁酯保护基脱保护，并在去离子水中透析提纯；

步骤7、反应结束后，用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，并将pH值调7‐8之间，即制得能够降低表面蛋白质非特异性吸附的功能微纳米复合粒子。

本发明提出一种表面功能化修饰方法，通过光引发聚乙二醇基甲基丙烯酸酯和其他功能单体的共聚，对聚合物微球表面进行功能改性，降低颗粒表面的蛋白质非特异性吸附。

与现有技术相比，本发明有益效果至少在于：

(1)本发明通过光引发接枝聚合，在微球表面修饰部分氨基化的聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯，降低微纳米颗粒表面抗蛋白质非特异性吸附，同时赋予微纳米颗粒表面官能团用于进一步表面修饰改性。

(2)本发明提供的方法操作简便，可以灵活调节微纳米颗粒表面的功能化基团，因此该制备方法绿色、简便。

(3)显著降低微球表面的蛋白质非特异性吸附，同时可以灵活调节微球表面的功能化。

附图说明

图1光引发接枝聚合修饰微纳米颗粒降低蛋白非特异性吸附的示意图

图2氨基硅烷偶联剂修饰聚苯乙烯微球的扫描电镜照片；

图3聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的聚苯乙烯微球的扫描电镜照片；

图4聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的聚苯乙烯微球的透射电镜照片；

图5修饰前和修饰后的聚苯乙烯微球与荧光蛋白混合的荧光光谱。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，如下步骤进行：

本发明所述一种降低微纳米颗粒表面蛋白质非特异性吸附的表面修饰方法，具体包括以下步骤：

步骤1、制备二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒，先将十六烷基溴化氨溶解于50℃水中，然后利用超声将微纳米颗粒分散在十六烷基溴化氨水溶液中，逐滴加入正硅酸乙酯和一定体积氨水后，室温下不断搅拌进行水解反应，微纳米颗粒表面沉积一层二氧化硅壳层，制得二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒。

其中复合粒子粒径可以从50nm‐20微米；

步骤2、制备氨基化微纳米颗粒，将二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒超声分散在乙醇溶液中，加入氨基丙基三甲氧基硅烷和氨水，室温下搅拌进行水解反应，逐渐将氨基丙基三甲氧基硅烷接枝在颗粒的二氧化硅壳层表面，同时在微纳米颗粒表面进行氨基修饰，制得氨基化微纳米颗粒；

步骤3、通过表面光引发原位接枝聚合，首先将端羟基聚乙二醇基甲基丙烯酸酯单体溶于乙醇中；然后将一定质量的氨基化的微纳米颗粒加入单体乙醇溶液中，超声均匀分散后，直接放在紫外灯箱中，光引发单体原位聚合，同时不断搅拌使反应均匀进行，获得端羟基聚乙二醇修饰的微纳米颗粒；

步骤4、甘氨酸的胺基保护，将二碳酸二叔丁酯与甘氨酸的胺基反应，获得叔丁氧羰基(BOC)胺基保护的甘氨酸；

步骤5、将BOC保护的甘氨酸加入聚乙二醇修饰的微纳米颗粒中，甘氨酸的羧基与聚乙二醇端羟基反应，获得甘氨酸修饰的微纳米复合微球；

步骤6、将步骤5获得改性的微纳米颗粒分散在去离子水中，加入三氟乙酸，将碳酸二叔丁酯保护基脱保护，并在去离子水中透析提纯；

步骤7、反应结束后，用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，并将pH值调7‐8之间，即制得能够降低表面蛋白质非特异性吸附的功能微纳米复合粒子。

实施例一：

表面抗蛋白质吸附、羧基化聚苯乙烯微球的制备，具体过程如示意图1所示：

1)制备二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒。将0.5克聚苯乙烯微球超声分散在100mL、0.5摩尔/升的十六烷基溴化铵水溶液中，加入0.5mL正硅酸乙酯和0.5mL氨水，室温下搅拌反应24h，聚苯乙烯微球表面沉积SiO2壳层，制得SiO2壳层包裹的聚苯乙烯复合微球。该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图2所示。

2)制备氨基化微纳米颗粒，将0.2克二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒超声分散在100mL乙醇溶液中，加入0.1mL氨基丙基三甲氧基硅烷和0.5mL氨水，室温下搅拌进行水解反应12小时，逐渐将氨基丙基三甲氧基硅烷接枝在颗粒的二氧化硅壳层表面，同时在微纳米颗粒表面进行氨基修饰，制得氨基化微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图3所示。

3)微球表面光引发原位接枝聚合。将0.1克氨基化聚苯乙烯复合微球加入20mL乙醇溶液中，超声均匀分散后，加入0.5克聚乙二醇基甲基丙烯酸酯单体，超声充分溶解后，放入紫外灯箱中搅拌，同时打开紫外光，引发单体原位聚合，同时不断搅拌使反应进行1小时，然后用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，获得聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图4所示，可清晰看到微球表面被聚合物层包裹修饰。

4)甘氨酸的胺基保护，将1克二碳酸二叔丁酯与0.2克的氢氧化钠溶于20mL二甲基乙酰胺和水的混合溶液中，二者体积比为1:1，然后在冰水浴中搅拌，加入3克的二碳酸二叔丁酯和0.5克甘氨酸，冰水浴中搅拌反应30分钟，然后在室温下反应12小时，反应粗产物溶于50mL水中，用乙酸乙酯萃取，浓缩后干燥，获得叔丁氧羰基(BOC)胺基保护的甘氨酸；

5)微纳米颗粒表面氨基化改性，将0.05克聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的微纳米颗粒超声分散在乙醇中，加入0.1克BOC保护的甘氨酸，加入2mL/0.5M的EDC/NHS混合溶液，室温搅拌反应24小时，用乙醇、水分别离心洗涤2‐3次，完成对颗粒表面的氨基化改性；

6)微球表面脱BOC基团保护，将0.1克氨基改性的微纳米颗粒分散在10mL二甲基甲酰胺中，加入1mL三氟乙酸，室温搅拌反应5小时，将碳酸二叔丁酯保护基脱保护，并在去离子水中透析提纯；

7)反应结束后，收集反应产物，离心浓缩后，用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，并将pH值调7‐8之间，即制得能够降低表面蛋白质非特异性吸附的功能微纳米复合粒子。制备出的复合微球的抗蛋白非特异性吸附性能由荧光光谱表征，结果如图5所示，制备出的微球表面不易吸附荧光多肽，因此荧光光谱强度较低，证明具有良好的抗蛋白非特异性吸附能力。

实施例二：

表面抗蛋白质吸附、聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的聚苯乙烯微球的制备

1)制备二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒。将0.5克聚苯乙烯微球超声分散在100mL、0.5摩尔/升的十六烷基溴化铵水溶液中，加入0.5mL正硅酸乙酯和0.5mL氨水，室温下搅拌反应24h，聚苯乙烯微球表面沉积SiO2壳层，制得SiO2壳层包裹的聚苯乙烯复合微球。该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图2所示。

2)制备氨基化微纳米颗粒，将0.2克二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒超声分散在100mL乙醇溶液中，加入0.1mL氨基丙基三甲氧基硅烷和0.5mL氨水，室温下搅拌进行水解反应12小时，逐渐将氨基丙基三甲氧基硅烷接枝在颗粒的二氧化硅壳层表面，同时在微纳米颗粒表面进行氨基修饰，制得氨基化微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图3所示。

3)微球表面光引发原位接枝聚合。将0.1克氨基化聚苯乙烯复合微球加入20mL乙醇溶液中，超声均匀分散后，加入0.5克聚乙二醇基甲基丙烯酸酯单体，超声充分溶解后，放入紫外灯箱中搅拌，同时打开紫外光，引发单体原位聚合，同时不断搅拌使反应进行1小时，然后用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，获得聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图4所示，可清晰看到微球表面被聚合物层包裹修饰。

4)反应结束后，收集反应产物，离心浓缩后，用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，即制得能够降低表面蛋白质非特异性吸附的功能微纳米复合粒子。

实施例三：

表面抗蛋白质吸附、羟基化聚苯乙烯微球的制备：

1)制备二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒。将0.5克聚苯乙烯微球超声分散在100mL、0.5摩尔/升的十六烷基溴化铵水溶液中，加入0.5mL正硅酸乙酯和0.5mL氨水，室温下搅拌反应24h，聚苯乙烯微球表面沉积SiO2壳层，制得SiO2壳层包裹的聚苯乙烯复合微球。该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图2所示。

2)制备氨基化微纳米颗粒，将0.2克二氧化硅壳层包裹的微纳米颗粒超声分散在100mL乙醇溶液中，加入0.1mL氨基丙基三甲氧基硅烷和0.5mL氨水，室温下搅拌进行水解反应12小时，逐渐将氨基丙基三甲氧基硅烷接枝在颗粒的二氧化硅壳层表面，同时在微纳米颗粒表面进行氨基修饰，制得氨基化微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图3所示。

3)微球表面光引发原位接枝聚合。将0.1克氨基化聚苯乙烯复合微球加入20mL乙醇溶液中，超声均匀分散后，加入0.5克聚乙二醇基甲基丙烯酸酯单体，超声充分溶解后，放入紫外灯箱中搅拌，同时打开紫外光，引发单体原位聚合，同时不断搅拌使反应进行1小时，然后用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，获得聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的微纳米颗粒；该复合微球的表面微观形貌如低倍率扫描电镜图4所示，可清晰看到微球表面被聚合物层包裹修饰。

5)微纳米颗粒表面羧基化改性，将0.05克聚甲基丙烯酸聚乙二醇酯修饰的微纳米颗粒超声分散在乙醇中，加入0.1克乙二酸，加入2mL/0.5M的EDC/NHS混合溶液，室温搅拌反应24小时，用乙醇、水分别离心洗涤2‐3次，完成对颗粒表面的羧基化改性；

6)反应结束后，收集反应产物，离心浓缩后，用水和乙醇混合溶液离心洗涤2‐3次，并将pH值调5‐6之间，即制得能够降低表面蛋白质非特异性吸附的功能微纳米复合粒子。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但是本发明并不同限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。