一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法

摘要

本发明公开了一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法，包括四个步骤：(1)发酵液酸化；(2)惰性物质破除乳化；(3)乙酸乙酯振荡萃取；(4)离心、吸取上清液提取HSAF。本发明中所添加的惰性物质能够有效地破除乳化问题，所采用的振荡处理使萃取反应时间缩短至1min，极大地提高了萃取速率。本发明最大能够使发酵液中HSAF一次萃取效率达到88.2％，比对照提高了1.83倍，而且操作方便、工艺简单，是国内外首次对HSAF这一具有巨大应用前景的产品提取工艺进行总结。

说明书

技术领域

本发明属于分离工程技术领域，具体涉及到一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法。

背景技术

生物农药是指利用生物活体、生物代谢产物或生物特定基因而制成的农药，目前研发和应用较多的有农用抗生素(井冈霉素、阿维菌素等)、微生物农药(苏云金杆菌、假单胞菌等)、植物源农药(苦参碱、除虫菊素等)等。其具有低毒、低残留、不易产生抗药性等优点，为农业可持续发展提供了非常重要的研究方向，具有广阔的前景。

Lysobacterenzymogenes是一种新型的生防细菌，可以分泌多种胞外酶以及各类次生代谢产物，对多种真菌均具有很好的防治效果，且对部分细菌、线虫等也具有抑制效果。其中一种重要的次生代谢产物-热稳定抗真菌因子(Heat Stable Antifungal Factor,HSAF)，其具有热稳定性高(>300℃)、抗菌谱广(真菌、卵菌、细菌、单细胞藻类和线虫等)及毒性低(>5mg/mL才对人体肝脏细胞有毒性)等特点。其结构由一个独特的大环内酰胺体系、一个四胺酸结构单元和5,5,6-三环骨架组成这一新颖结构不同于目前市场上任何一种杀真菌剂。除此，HSAF对病原真菌的作用方式也与目前已报道的商用杀真菌剂截然不同，它主要是通过抑制病原菌神经酰胺合成酶活性，改变丝状真菌细胞膜中的鞘脂类化合物的组成，从而影响真菌菌丝的极性生长。综上所述，HSAF可以代表一类化学结构新颖、作用方式独特，对环境友好的生物杀菌剂或抗菌药物。

目前，对于发酵液HSAF的提取主要采用有机溶剂萃取法。由于发酵液中各种代谢产物，如蛋白质、糖类的存在，使系统极易出现乳化现象，导致相分离困难，产品损失严重。一般采用多次反复萃取的策略，虽然能够回收更多的目的产物，但费时费力，而且增加了生产工序，使生产效率大大降低，给HSAF的实验室研究和工业化生产带来了极大的困难。因此，开发一种高效提取发酵液中HSAF的方法具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种快速高效提取发酵液中活性抗菌物质HSAF的方法，包括以下步骤：

(1)发酵液酸化；

(2)加入惰性物质；

(3)加入乙酸乙酯，涡旋混合振荡萃取；

(4)离心、吸取上清液提取HSAF。

本发明步骤(1)所述的发酵液可以为任何HSAF生产菌株发酵产生的的发酵液，优选的，为产酶溶杆菌LysobacterenzymogenesOH11发酵得到的，优选的具体发酵过程为：将活化的菌株OH11接入到LB液体培养基中28℃、180rpm培养12-15h，按照1.0-2.5％接种量转入发酵培养基中，28℃、150-200rpm培养48-60h。

所述的发酵培养基成分为：黄豆粉：8g/L、葡萄糖：8g/L、CaCl₂：0.7g/L。

所述的发酵液中HSAF含量通过HPLC检测，含量为250-400mg/L。

本发明步骤(1)发酵液可以选用任意实验室中常用于调节pH的酸来进行酸化，如浓盐酸、浓硫酸等；本发明中步骤(1)发酵液酸化至pH 2.0-5.0，优选酸化pH至3.0-4.5。

本发明步骤(2)所述的惰性物质为溶于水而不溶于乙酸乙酯的无机盐，优选为NaCl、CaCl₂、MgCl₂或Na₂SO₄中的任意一种或者几种的组合；更优选的为CaCl₂或NaCl或二者的组合；本发明通过惰性物质的加入，能显著降低乙酸乙酯在发酵液中的溶解度，使乙酸乙酯从发酵液中游离出来，并伴随着HSAF从发酵液中转移到乙酸乙酯中，实现HSAF的分离；在整个过程中，因不存在稳定、大量的传质界面，故破坏了乳化形成的基本条件，有效地克服了乳化问题。

本发明步骤(2)所述的惰性物质的单位为g，发酵液体积的单位为ml，惰性物质添加量与发酵液体积的比为(0.1-0.3)g：1ml；优选(0.15-0.25)g：1ml；更优选的(0.15-0.20)g：1ml。惰性物质添加量低于此范围时，破乳效果不佳。

本发明步骤(3)选用乙酸乙酯做萃取剂，萃取效率高，且易分层；优选乙酸乙酯与发酵液体积比为0.5-1.5:1，更优选0.8-1.2:1。乙酸乙酯与发酵液体积比在此范围内，可以提高萃取效率。

本发明步骤(3)中选用涡旋混合振荡处理，有机溶剂和发酵液接触更充分，萃取时间大大缩短，可以将萃取时间缩短至2min以内，优选的振荡条件为1000-2500rpm，0.5-2min；更优选1500-2000rpm，1-1.5min。

本发明步骤(4)中是在常温5000-8000rpm离心5-10min，使乙酸乙酯与水相分成两层，吸取上清液即得到HSAF的乙酸乙酯溶液，蒸干后可得HSAF产品；若为了获得高纯度的HSAF，可将蒸干后获得的HSAF产品溶于甲醇溶液，通过HPLC制备柱收集馏分，干燥后即得HSAF高纯度产品。

本发明还可以通过HPLC对乙酸乙酯溶液中的HSAF含量进行检测，即可知萃取液中HSAF的含量及发酵液中HSAF产量。

与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

(1)本发明中添加的惰性物质能够有效破除萃取过程中产生的乳化问题，从而提高目的产物的萃取效率。

(2)本发明操作方便、工艺简单，利用混合振荡处理，萃取时间可缩短至2min以内，甚至仅需1min，与一般工艺(2h)比较，大大缩短了萃取时间，提高了生产效率。

(3)本发明选用乙酸乙酯做萃取剂，萃取效率高，且易分层。

(4)本发明萃取效率高，可使第一次萃取效率达到86.8％以上。

附图说明

图1不同有机溶剂萃取发酵液中HSAF过程的现象；

图2添加惰性物质时HSAF萃取过程的现象。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

以下实施例所用的L.EnzymogenesOH11发酵液的准备：

种子液准备：划取一满环菌体于50mL LB培养液中，28℃下200rpm振荡培养12h至OD₆₀₀＝1.5，即得到种子液。

发酵培养：按照配方(黄豆粉8g/L、葡萄糖8g/L、CaCl₂>

实施例1：不同有机溶剂对发酵液中HSAF萃取的影响

吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓盐酸至pH为3.0；向混合液中添加3mL有机溶剂(表1)；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使有机溶剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为HSAF有机溶剂层，吸取1mL吹干加入500μL甲醇溶解后通过HPLC对其含量进行检测。

检测条件为：反相柱：InterSustainSwift C18 5μm,250×4.6mm，流动相：溶液A(0.025％TFA水溶液)和溶液B(0.025％TFA乙腈溶液)，流速：1mL/min；进样量为20μL，紫外吸收值：318nm；进样程序：0-10min，将溶液B从5％至25％；25min，增长到80％B；26min，增长到100％；30min返回到5％，溶液A和B总比例为100％；记录峰面积，通过制定的HSAF浓度与峰面积间的线性方程为Y＝4E-05X+12.46，R²＝0.9996来计算乙酸乙酯中HSAF的含量。

由图1和表1可知，醇类溶剂与发酵液发酵互溶，不能分层；而使用密度较大的溶剂，如二氯甲烷使有机相在下层，不易吸取有机相，且二氯甲烷中HSAF浓度较低；添加乙酸丁酯，虽然乳化层较少，但萃取效率极低，而且很难吹干；而添加本发明所述的乙酸乙酯时，即使产生了乳化层，但乙酸乙酯中HSAF浓度能到达到322.8mg/L，由此可见，采用本发明所述的乙酸乙酯，可以大大提高萃取效率。

表1有机溶剂对HSAF萃取效率的影响

实施例2：添加CaCl₂破除乳化提取发酵液中HSAF

吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓盐酸至pH为3.5；投放0.5gCaCl₂后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3mL乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使有机相与水相分层，吸取上清即为HSAF萃取液，通过HPLC对其含量进行检测，其他条件同实施例1。

由图2和表2可知，CaCl₂可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中HSAF的含量(336.8mg/L)。同时，以充分萃取后得到的HSAF含量为发酵液中HSAF总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生HSAF为止，每次萃取液中HSAF含量为336.8mg/L，36.3mg/L，5.7mg/L，对应的体积分别为2.8mL，3mL，3mL。与此，计算出发酵液中HSAF总含量为356.3mg/L)，通过计算发现添加CaCl₂能够使第一次萃取效率达到88.2％，比对照提高了1.83倍。而商业化破乳剂(PPB)对本研究中乳化问题效果不明显。

实施例3：添加NaCl破除乳化提取发酵液中HSAF

吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓盐酸至pH为4.0；投放0.6g NaCl后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3mL乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上2000rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使发酵液与有机溶剂分成两相，上清即为HSAF萃取液，吸取1mL吹干加入500μL甲醇溶解后按照实施例1中方案对其含量进行检测。

由图2和表2可知，NaCl可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中HSAF的含量(343.6mg/L)。同时，以充分萃取后得到的HSAF含量为发酵液中HSAF总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生HSAF为止，每次萃取液中HSAF含量为343.6mg/L，40.5mg/L，6.6mg/L，对应的体积分别为2.7mL，3mL，3mL。与此，计算出发酵液中HSAF总含量为356.3mg/L)，通过计算发现添加NaCl能够使第一次萃取效率达到86.8％，比对照提高了1.79倍。而商业化破乳剂(PPB)对本研究中乳化问题效果不明显。

实施例4：添加NaCl和CaCl₂组合破除乳化提取发酵液中HSAF

吸取发酵液3mL至15mL离心管中，滴加浓盐酸至pH为3.0；投放0.3g NaCl和0.2g CaCl₂后，轻轻摇晃使其充分溶解；向混合液中添加3mL乙酸乙酯溶剂；置于漩涡混合振荡器上1500rpm反应1min，使萃取剂与发酵液充分接触；8000rpm下离心5min，使有机相与水相分层，吸取上清即为HSAF萃取液，通过HPLC对其含量进行检测，其他条件同实施例1。

由图2和表2可知，添加NaCl和CaCl₂可有效破除萃取过程中产生的乳化现象，并且能够提高萃取液中HSAF的含量(331.5mg/L)。同时，以充分萃取后得到的HSAF含量为发酵液中HSAF总量(通过三次萃取至发酵液中不再产生HSAF为止，每次萃取液中HSAF含量为331.5mg/L，38.9mg/L，8mg/L，对应的体积分别为2.8mL，3mL，3mL。与此，计算出发酵液中HSAF总含量为356.3mg/L)，通过计算发现添加NaCl和CaCl₂能够使第一次萃取效率达到86.8％，比对照提高了1.79倍。而商业化破乳剂(PPB)对本研究中乳化问题效果不明显。

表2添加不同无机盐对HSAF萃取效率的影响