诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的方法及其用途

摘要

本发明涉及诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的方法及其用途。进一步地，本发明涉及体外诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的组合物及其用途。

说明书

技术领域

本发明涉及体外诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的领域。进一步地，本发明涉及体外诱导间充质干细胞定向分化为Leydig细胞的组合物。

背景技术

干细胞是组织再生的源泉，根据个体发育过程中出现的先后次序，干细胞可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞(adult stem cells，ASCs)；根据分化潜能的不同，又可将其分为全能干细胞(totipotent stem cel1)、多潜能干细胞(pluripotent stem cel1)、多能干细胞(multipotent stem cel1)和单能干细胞(unipotent stem cel1)。成体干细胞还可根据组织来源分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞、肌肉干细胞等。通过基因转染技术将某些转录因子导入动物或人的体细胞，使体细胞被诱导重构成为ES细胞样的多潜能干细胞，这种多潜能干细胞被称为诱导性多能干细胞(induced pluripotentstem cells，iPSCs)，参见Takahashi K.Yamanaka S.Induction ofpluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast culturesby defined factors.Cell,2006,126(4):663-676；Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et a1.Induction of pluripotent stem cells from adult humanfibroblasts by defned factors.Cell,2007,131(5):861-872。因发育阶段、取材及获得方式等不同，胚胎干细胞、成体干细胞及iPS细胞在临床应用上显示出不同的优势和局限性。胚胎干细胞具有分化的全能性，但伦理问题、免疫排异与成瘤性特点严重阻碍了其在临床上的研究与应用。iPS具有与胚胎干细胞类似的分化能力，但其仍具有成瘤性，而且从成体细胞诱导生成iPS的效率极低，诱导生成的iPS癌变率较高，这些因素大大增加了临床应用的不安全性。成体干细胞来源非常广泛，无成瘤性，亦不存在伦理问题。传统的观点认为成体干细胞属多能或单能干细胞。近年来的一些实验证据显示，成体干细胞具有“可塑性”，不仅能分化为特定谱系中的细胞类型，还具有分化为在发育上无关的其他谱系的能力，提示成体干细胞具有比人们以前想象的更大的分化潜能，参见Brazelton TR,Rossi FM,Keshet GI,Blau HM.From marrow tobrain:expression of neuronal phenotypes in adult mice.Science,2000,290(5497):1775-1779；Jiang Y,jahagirdar BN,Reinardt RL,等人Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.Nature,200,418(6893):41-49；Jiang Y.Henderson D.Blackstad M.等人Neuroectodermal differentiation from mosuse multipotent adult progenitorcells.Proc Natl Acad Sci U S A,2003,100(supp 1):11854-11860。

由于来源较多，目前成体干细胞没有统一的表型、培养条件及鉴定方法。各种组织来源的成体干细胞显示出不同的分化能力。这些因素使得成体干细胞的研究变得复杂混乱，很难建立比较均一的细胞系，因此为进一步的临床应用带来了困难。

间充质干细胞(MSC)是干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层，属于多能干细胞。其一类存在于多种组织(如骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织等)、具有多向分化潜力、非造血干细胞的成体干细胞。这类干细胞具有向多种间充质系列细胞(如成骨、成软骨及成脂肪细胞等)或非间充质系列细胞分化的潜能，并具有独特的细胞因子分泌功能。

胎盘主要起源于细胞滋养层和胚外中胚层的胎儿丛密绒毛膜和母体子宫蜕膜共同组成。胎盘间充质干细胞(MSC)表达类似于骨髓MSC的表面标志，如间质细胞标志SH2/CD105、SH3,4/CD73、CD90/Thy-1、CD166；主要组织相容性复合物mA—ABC；整合蛋白家族CD49e、CD29；透明质酸盐受体CD44等，不表达造血细胞表面标志CD34、CD45、CD14，HLA-DR和内皮细胞表面标志vWF、Flk-1、CD31、KDR等，同时也不表达共刺激分子CD80、CD86、CD40L等。胎盘来源的多能细胞(PD-MC)还可表达某些胚胎干细胞表面标记SSEA4、TRA-1-60，TRA-1-80，提示PDMC可能是非常原始的细胞群，介于胚胎干细胞和成体干细胞之间，比成体干细胞(ASC)具有更广泛的自我更新和多系分化能力。胎盘分泌大量孕酮，用于维持人正常孕期，参见Parolini,O.等人,Concise review:isolation and characterization of cellsfrom human term placenta:outcome of the first international Workshop onPlacenta Derived Stem Cells.Stem Cells,2008.26(2):p.300-11；Sousa,B.R.,等人,Human adult stem cells from diverse origins:an overviewfrom multiparametric immunophenotyping to clinical applications.Cytometry A,2014.85(1):p.43-77；Maliqueo,M.,等人,Placentalsteroidogenesis in pregnant women with polycystic ovary syndrome.Eur JObstet Gynecol Reprod Biol,2013.166(2):p.151-5；Wu,L.,等人,Abnormal regulation for progesterone production in placenta with prenatalcocaine exposure in rats.Placenta,2012.33(12):p.977-81；Thibeault,A.A.,等人,A unique co-culture model for fundamental and applied studies ofhuman fetoplacental steroidogenesis and interference by environmentalchemicals.Environ Health Perspect,2014.122(4):p.371-7。

在哺乳动物中，性腺和肾上腺是主要固醇生成器官。男性睾丸中Leydig细胞和女性卵巢中粒壳细胞分别负责产生雄激素和雌激素，而肾上腺皮质负责产生糖皮质激素和盐皮质激素，在除大鼠外其他物种中，肾上腺同样分泌少量雄激素，参见Andric,S.A.,等人,Testosterone-induced modulation of nitric oxide-cGMP signaling pathwayand androgenesis in the rat Leydig cells.Biol Reprod,2010.83(3):p.434-42。雄激素缺乏是临床常见的难治性疾病，目前的主要治疗方法是雄激素补充或替代疗法，外源性雄激素无法接受下丘脑-垂体-性腺轴的生理调节，易造成体内激素失调，而且反复注射会诱发前列腺癌等，产生多种副作用，所以急需寻找更好的治疗方法。与之相比，Leydig细胞移植法具有明显优势，是雄激素缺乏性疾病可靠、理想治疗途径，但是种子细胞来源不足和免疫排斥是制约该技术的主要瓶颈。随着再生医学的发展，干细胞移植疗法应运而生，受到人们的广泛关注。如果能将干细胞体外高效诱导成有功能的leydig细胞，移植到患者体内，将为雄激素缺乏性疾病治疗带来希望，参见Basaria,S.,Malehypogonadism.Lancet,2013。

Leydig细胞是睾丸内的支持细胞，睾丸分成两个部分：小管区隔和间质。生精小管由Sertoli细胞构成支架，环绕生殖细胞，外周有管周肌样细胞(PMCs)包围小管结构，间质由Leydig细胞、巨噬细胞、成纤维细胞和血管构成，这些结构植入Sertoli细胞基底膜和PMSs细胞之间的细胞外基质中。睾丸内存在一种调控网络，在男性性腺发育一开始就进行了精确的时间上和空间上调控，启动和维持睾丸功能。内尔泌和旁分泌通路，包括激素、生长因子、细胞因子以及直接的细胞接触综合起来，在细胞内、细胞间、细胞和环境三方面起作用。

Leydig细胞分化在小鼠中分四个阶段：从干性Leydig细胞发育成前体Leydig细胞、未成熟Leydig细胞和成熟Leydig细胞，在人体中阶段性并不显著，三个阶段是可以确定的：新生儿Leydig细胞、幼儿期(出生后一年到青春期前)Leydig细胞、青春期后的Leydig细胞。细胞分化时伴随着胞浆体积增大、滑面内质网发育、线粒体大小和数量增加、核增大和胞浆脂滴增加。形态改变同时，固醇生成酶和黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素受体LHR增加，睾酮产生能力增加。

Leydig细胞分泌机体95％的睾酮，剩下5％是肾上腺细胞分泌的。Leydig细胞分成两类：胎儿型Leydig细胞(FLC)和成体型Leydig细胞(ALC)。FLC同肾上腺细胞一样起源于体腔上皮和中肾间质，属于中胚层来源，分泌睾酮和其他雄激素，负责胎儿雄性化，出生后退化消失，由Sertoli细胞分泌的DHH和FGF9启动调控其增殖分化。ALC出现于青春期以后，新生儿第一年到青春期前已经产生，处于未成熟阶段，青春期时成熟的ALC数量增加，可能是因为大量募集前体细胞(如间质原始成纤维细胞和管周成纤维细胞)，并且受内分泌的促性腺激素和旁分泌的生长因子刺激，参见Yazawa,T.,et al.,Differentiation of adultstem cells derived from bone marrow stroma into Leydig or adrenocorticalcells.Endocrinology,2006.147(9):p.4104-11。研究发现发育过程中存在四种Leydig细胞，Leydig干细胞(leydig stem cells/SLC),Leydig前体细胞(Leydig progenitor cells/PLC),未成熟Leydig细胞(immature Leydigcells/ILC)和成体Leydig细胞(adult Leydig cells/ALC)。SLC不表达Leydig谱系特异性基因，不分泌睾酮。但是PLC、ILC、ALC都表达Leydig特异性标记基因P450侧链裂解酶CYP11A1(P450scc),3β-羟固醇脱氢酶(3β-HSD),细胞色素P45017α羟化酶(P450c17)、黄体生成素受体LHR，参见Wei,X.,et al.,Differentiation of umbilical cordmesenchymal stem cells into steroidogenic cells in comparison to bonemarrow mesenchymal stem cells.Cell Prolif,2012.45(2):p.101-10。

在每种固醇生成组织中(如卵巢、睾丸、肾上腺、胎盘等)，细胞色素P450家族(p450scc,p450c21,p450c17,p450c11,etc.)和羟固醇脱氢酶家族(3βHSD and 17βHSD)都作为固醇类激素生物合成的催化剂，催化一系列级联反应，最终把胆固醇变成固醇类产物。在不同细胞类型中，这些酶表达水平不同，合成的激素也就不同，参见Tsai,L.C.and J.A.Beavo,The roles of cyclic nucleotide phosphodiesterases(PDEs)insteroidogenesis.Curr Opin Pharmacol,2011.11(6):p.670-5。

如果能将胎盘来源MSC转变成生成雄激素睾酮的Leydig细胞，进行细胞移植治疗，将解决种子细胞来源不足的问题，满足临床需要。

在本专利申请中，本发明人公开了一种将胎盘来源的间充质干细胞(MSC)定向诱导为可分泌雄激素睾酮的Leydig细胞，该Leydig细胞可通过细胞移植治疗，解决种子细胞来源不足的问题，满足临床需要。

发明内容

本发明人使用北京协和医院产科来源的胎盘组织成功分离MSC，并对其进行了形态、表型和分化潜能的鉴定。通过调研，我们发现黄体生成素(LH)的高度类似物人绒毛膜促性腺激素(hCG)、血小板源性生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)以及巨噬细胞分泌的炎性因子如白介素1α(IL-1α)从内分泌、旁分泌层面上对Leydig细胞的生长发育进行调控，可以促进固醇生成相关基因表达，使这种亚全能干细胞产品具有激素分泌功能。

一方面，本发明提供了一种体外诱导间充质干细胞定向分化为Leygid细胞的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在适合于细胞生长的条件下培养间充质干细胞；

b)在步骤a)中培养的间充质干细胞至亚融合状态时，向培养基中添加100IU/ml人绒毛膜促性腺激素、20ng/ml胰岛素样生长因子-1、10ng/ml人血小板源性生长因子以及0.0005ng/ml白介素1-α；

c)继续培养0-14天后，收集并鉴定定向分化的Leygid细胞。

优选地，根据本发明的方法，其中所述的间充质干细胞来源于哺乳动物胎盘，更优选地，来自人胎盘细胞。

特别地，根据本发明所述的方法，其中所述胎盘来源的哺乳动物间充质干细胞呈上皮样形态，具有Flk1阳性的表型，具有三胚层多谱系的分化能力，但不具有成瘤性。更优选地，其全能基因包括Oct4、Nanog、c-Myc、Sall4、Sox2、Klf4；外胚层早期分化相关基因包括Hoxa1、Gbx2、Six1和Olig3；中内胚层早期分化相关基因T、Pgdfrα、Eomes、Tbx6和Mixl1；中胚层早期分化相关基因Kdr、Hand1、Gata4和Mesp2；限定性内胚层早期分化相关基因Onecut1、Prox1、Foxa1、Foxa2、Sox7、Sox17、Pdx1和Gsc的甲基化修饰状态以活化或H3K4me3和H3K27me3共存的双价修饰为主。

进一步地，根据本发明所述的方法，其中在步骤b)中进一步加入1X ITS或1％FBS。

另一方面，本发明提供了一种体外诱导细胞培养上清液中分泌睾酮的方法，所述方法包括胰腺癌步骤：

a)在适合于细胞生长的条件下培养间充质干细胞；

b)在步骤a)中培养的间充质干细胞至亚融合状态时，向培养基中添加100IU/ml人绒毛膜促性腺激素、20ng/ml胰岛素样生长因子-1、10ng/ml人血小板源性生长因子以及0.0005ng/ml白介素1-α；

c)继续培养0-14天后，收集上清液并测定睾酮的含量。

另一方面，本发明提供了一种用于体外诱导间充质干细胞定向分化为Leygid细胞的组合物，所述组合物包括100IU/ml人绒毛膜促性腺激素、20ng/ml胰岛素样生长因子-1、10ng/ml人血小板源性生长因子以及0.0005ng/ml白介素1-α。

优选地，根据本发明的组合物，进一步包括1X ITS或1％FBS。

另一方面，本发明提供了根据权利本发明的组合物用于体外诱导间充质干细胞定向分化为Leygid细胞的用途。

另一方面，本发明提供了根据本发明的组合物用于体外诱导细胞培养上清液中分泌睾酮的用途。

附图说明

图1A表明胎盘Flk1+MSC形态；图1B表明胎盘Flk1+MSC表型鉴定结果。

图2A-2C表明胎盘Flk1+MSC成脂成骨分化能力鉴定结果。图2A表明二代胎盘MSC成骨6天碱磷酶(ALP)染色；图2B表明二代胎盘MSC成骨14天茜素红染色；图2C表明二代胎盘MSC成脂油红O染色。

图3表明胎盘Flk1+MSC向睾丸Leydig细胞诱导后睾酮激素分泌功能鉴定结果。

图4A至图4F表明胎盘MSC成脂成骨诱导基因鉴定结果：前四个是成脂相关基因，后两个是成骨相关基因。

图5A至图5F表明胎盘Flk1+MSC向睾丸Leydig细胞或固醇生成细胞诱导后基因鉴定结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例

实施例1Flk1+间充质干细胞(Flk1+MSC)的获得及分化能力的验证

为了评估Flk1+MSC的临床应用价值，我们首先其分化能力进行了验证。

胎盘组织取自北京协和医院妇产科，剖腹产手术后获得无菌胎盘组织块。采集出来的脂肪组织用D-Hanks洗去血细胞和麻醉药，反复数次，用镊子剪刀等剪成1-2mm米粒大小，0.2％II型胶原酶消化1.5-2h小时，之后用D-Hanks洗涤2次以除去胶原酶。离心收集细胞，细胞以2×10⁶/ml的密度接种于含58％DMEM/F12+40％MCDB-201、5％胎牛血清(FCS)、10ng/ml>

将获得的Flk1+MSC分成6等份，分别向肝上皮、神经、造血、成脂肪及成骨谱系诱导分化，另一份细胞继续扩增后用于各谱系分化的对照。诱导14天后，光镜下可见成脂诱导组细胞胞浆内充满了脂肪滴，油红O染色阳性率达80％，实时定量PCR检测显示成脂标志基因AP2及LPL高表达；成骨诱导组ALP及茜素红染色阳性率达65％，实时定量PCR检测显示，成骨标志基因ALP和OPN表达较诱导前明显上调。Flk1+MSC向造血方向诱导第3天，造血相关的标志分子Osteocalcin(OC)、c-Kit和CD34染色阳性，诱导14天时可见BFU-E(红系爆式集落形成单位)、CFU-G(巨嗜细胞集落形成单位)、CFU-MK(巨核细胞集落形成单位)和HPP-CFC(高增殖潜能细胞集落形成单位)等各系造血集落的形成。诱导第21天，肝上皮诱导组细胞CK8、CK18和CK19免疫组化检测阳性。诱导第12天，神经诱导组细胞Nestin和Musashi免疫组化检测阳性。

上述结果表明，Flk1+MSC在一定的诱导条件下能够向肝上皮、神经、造血及成脂和成骨等不同胚层来源的多谱系方向分化。

实施例2：胎盘来源Flk1+MSC免疫表型的鉴定(流式细胞术检测)

(1)采用间接免疫荧光染色法进行染色，流式细胞仪检测。收集第二代状态良好的细胞，常规0.125％的EDTA胰蛋白酶(含0.01％的EDTA)消化；

(2)细胞分散均匀后取少量细胞悬液计数，其余细胞转移至离心管，1200rpm离心5分钟；

(3)弃上清，收集细胞沉淀，轻弹管底使细胞分散，用含D-hank’s重悬后，分装到流式管中，每管约5×105个细胞；

(4)加入一抗，4℃孵育30分钟。一抗为CD73、CD90、CD29、CD34、CD31、CD44、CD105、HLA-DR和Flk1(细胞在孵育Flk1之前，先用用BD的Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization kit固定破膜)，选用同种同型非相关IgG抗体作为阴性对照；

(5)30分钟后，用D-hank’s或破膜试剂盒专用洗液洗2遍，去除未结合的一抗；

(6)加入FITC标记的二抗，4℃避光孵育30分钟；

(7)用0.5％牛血清白蛋白的PBS洗液洗2遍，去除未结合的二抗；

(8)弃上清，用200μl 4％的多聚甲醛重悬细胞沉淀，避光于冰上放置，待流式细胞仪上机检测。

结果表明：胎盘来源MSC高表达MSC经典的阳性标记CD73、CD90、CD105、CD29、CD44，不表达内皮和造血谱系标记CD31、CD34，并且不表达MHC II类分子HLA-DR，证实了原代分离的细胞经贴壁传代用MSC特异培养基筛选以后，获得了纯度较高的间充质干细胞(参见图1A-1B)。

实施例3：胎盘来源Flk1+MSC成脂成骨诱导后染色鉴定

胎盘来源MSC成脂诱导过程

(1)取第二代的人胎盘来源间充质干细胞，常规消化计数，按2×104/cm2的密度接种于六孔板或培养皿中；

(2)观察细胞生长情况，待生长至80％汇合时，将培养基换成成脂诱导培养基继续培养；

(3)每三天更换培养液一次，并于倒置显微镜下观察细胞形态的改变及细胞内脂滴的形成情况。

胎盘来源MSC成骨诱导过程

(1)取第二代的人胎盘来源间充质干细胞，常规消化计数，按2×104/cm2的密度接种于六孔板或培养皿中；

(2)观察细胞生长情况，待细胞生长至70％汇合时，将培养基换成成骨诱导培养基诱导细胞向成骨细胞分化；

(3)每三天更换培养液，倒置显微镜观察细胞形态变化及细胞外基质钙化情况。

脂肪细胞油红O染色

(1)油红O母液的配制：0.5g油红O粉末+100ml异丙醇，60℃水浴30分钟溶解，避光保存；

(2)油红O工作液的配制(配好后2小时内使用)：油红O母液：蒸馏水＝3：2混匀，室温放置30分钟，过滤后使用；

(3)弃去培养基，用PBS洗2遍；

(4)10％福尔马林4℃固定10分钟，PBS轻轻洗2遍；

(5)60％的异丙醇溶液轻轻涮洗细胞，置换残余的水分；

(6)加入油红O工作液染色20分钟；

(7)蒸馏水洗3次，显微镜下观察并拍照。

成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)染色

(1)使用中国医学科学院血研所科技公司生产的碱性磷酸酶(ALP)试剂盒对成骨细胞进行染色，操作步骤参考试剂盒说明书；

(2)配制工作液：取2号液10ml，3号液200μl，加入4号粉10mg，震摇速溶，用滤纸过滤，除去未溶解的粉剂；

(3)取待染色细胞，弃去培养基，PBS轻轻洗2遍；

(4)加入试剂盒内的1号液数滴，室温固定1分钟，流水漂洗2分钟，晾干；

(5)将配好的工作液滴加到细胞上，置湿盒内，37℃孵育2小时；

流水冲洗2分钟，显微镜下观察并拍照。

成骨细胞茜素红染色：

(1)工作液配制：1％茜素红40ml，加入茜素红粉剂0.2g，加入10ul氨水调节PH到7.3。

(2)弃去培养基，用PBS洗2遍；

(3)加入试剂盒内的1号液数滴，室温固定1分钟，流水漂洗2分钟，晾干；

(4)将配好的工作液滴加到细胞上，置湿盒内，37℃孵育30分钟；

(5)蒸馏水洗3次，显微镜下观察并拍照。

该结果表明：胎盘来源MSC的确具有成脂成骨分化潜能，是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞，是作为临床移植的理想种子细胞来源(参见图2A-2C；图4A-4F)。

实施例4：诱导胎盘来源的Flk1+MSC定向分化为Leydig细胞

(1)取第二代的人胎盘来源间充质干细胞，常规消化计数，按2×104/cm2的密度接种于六孔板或培养皿中；

(2)观察细胞生长情况，待生长至70％～80％汇合时，将培养基换成Leydig细胞诱导培养基继续培养；

(3)每三天更换培养液一次，并于倒置显微镜下观察细胞形态的改变

实验分为3组：实验1组诱导液各成分及终浓度分别是人黄体生成素高度类似物/人绒毛膜促性腺激素(LH/hCG)100IU/ml、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)20ng/ml、人血小板源性生长因子(PDGF)10ng/ml、白介素1-α(IL-1α)0.0005ng/ml、1×ITS。实验2组诱导液各成分终浓度分别是人黄体生成素高度类似物/人绒毛膜促性腺激素(LH/hCG)100IU/ml、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)20ng/ml、人血小板源性生长因子(PDGF)10ng/ml、白介素1-α(IL-1α)0.0005ng/ml、1％FBS。第三组为对照组，即正常培养条件下胎盘MSC，于细胞密度达95％以上时进行细胞传代。该诱导方法是模拟Leydig细胞体内生长发育微环境，诱导体系一开始将所有诱导成分混合以后同时添加，细胞连续培养14天，并分别于0天、7天、14天用TRIZOL法和RIPA+PMSF法收集RNA和蛋白样品，同时收集细胞诱导上清用于检测激素分泌水平。

实施例5：胎盘来源的MSC向Leydig细胞诱导后Q-PCR分析

(1)细胞总RNA的提取(参照invitrogen公司的Trizol说明书进行)，具体如下：

1)弃培养液，按1-5×10⁶细胞1ml的量加入Trizol，室温孵育5分钟，轻轻吹打使细胞充分裂解，待细胞裂解完全后，将裂解液移至无RNA酶的1.5ml>

2)每毫升Trizol加0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置2-3分钟；4℃12000g。

离心15分钟；

3)离心后，试管中形成两相，下层酚-氯仿相，中间白色蛋白，上层无色水相。RNA在水相，将上层水相转移到新的EP管，注意勿吸到白膜层；

4)RNA的沉淀：每毫升Trizol加0.5ml异丙醇，沉淀RNA。室温孵育10分钟，4℃12000g离心10分钟；

5)RNA的清洗：弃上清，按Trizol与乙醇1：1的比例，加75％的乙醇清洗RNA沉淀，涡旋震荡，4℃，7500g离心5分钟；

6)RNA的干燥：自然风干或真空干燥5-10分钟，注意不要过分干燥，否则会降低RNA的溶解度；

7)RNA的溶解：用25-30微升DEPC水溶解RNA，可将样品于55-60℃水浴中放置10分钟，以增加溶解度；

8)取2μl溶解后的RNA溶液用紫外分光光度仪检测RNA的纯度及含量，余下的RNA溶液可置于-80℃保存，避免反复冻融

(2)cDNA的合成:具体操作参照M-MLV产品说明书，大致如下：

1)在0.2ml无菌无酶Ep管中加入以下试剂：

2)轻轻混匀后，70℃温浴10分钟,之后立即冰浴2分钟,稍加离心；

3)在上述EP管中直接加入下列成分：

4)混匀后42℃反转录60分钟，72℃灭活15分钟，-20℃贮存备用。

(3)Real time PCR反应：

1)在0.2ml Ep管中加入下列成分，配成20ul反应体系，

反应条件：94℃预变性10分钟后，之后开始40个循环：94℃变性15秒，60℃退火40秒，延伸40秒。反应结束后，根据溶解曲线分析证实产物的特异性，每对引物的反应均包括一个无模板(用ddH2O代替模板)对照。

该结果表明：胎盘来源MSC经诱导以后，Leydig细胞固醇生成相关基因在RNA水平上和正常对照组比较明显上调，参见图5A-5F。也就是说，我们最终获得的细胞确实是Leydig细胞。

实施例6胎盘MSC诱导上清激素分泌检测

细胞培养上清收集以后，冻存于-20℃冰箱，采用了北京协和医院检验科罗氏全自动电化学发光免疫分析仪来检测睾酮(testosterone)的分泌水平。电化学发光仪是用于检测人体内分泌激素的医学仪器。该仪器由日本日立公司生产出品，采用瑞士罗氏公司全套进口试剂，应用国际领先的电化学发光技术，检测多项内分泌激素。其特点是快速、微量、准确。检测项目包括生殖内分泌激素：雌二醇、睾酮、人绒毛膜促性腺激素等。

该结果说明：胎盘来源的MSC经诱导以后，从初步检测结果来看，获得细胞具有了分泌雄激素(睾酮)的功能，参见图3。从功能上进一步验证了，我们诱导后的细胞确实是睾丸Leydig细胞。