一种欧洲山杨品系组培育苗方法

摘要

本发明提供了一种欧洲山杨品系组培育苗方法，将带有腋芽的茎段依次经过酒精溶液浸泡、无菌水冲洗、消毒剂消毒和无菌水再次冲洗后，去掉茎段的两端1～2mm，得到外植体；将外植体接种到不定芽分化培养基中，分化培养30～45d，得到欧洲山杨不定芽；欧洲山杨不定芽接种到继代增殖培养基中进行继代培养，得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽；将1.2～2.0cm的欧洲山杨不定芽转接到不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。采用本发明的组培育苗方法，得到组培苗的成活率为91.4～91.6％。本发明的组培育苗方法可使以一个茎段为基数，经培养一年内可增殖到10 000～100 000株组培苗。

说明书

技术领域

本发明属于农林育种方法技术领域，尤其涉及一种欧洲山杨品系组培育苗方法。

背景技术

欧洲山杨原产中国新疆的阿尔泰、塔城、天山东部北坡至西部伊犁山区，其抗寒、喜光、喜凉爽气候，在我国西北、东北的同纬度地区可广泛栽培与推广。欧洲山杨为杨属白杨派树种，在自然界中，它主要依靠种子和根蘖繁殖，种子繁殖子代性状会发生分离，不能确保优良单株性状的表现，因此生产上使用比较广泛是无性繁殖方法。无性繁殖方法包括扦插、嫁接、根蘖或组织培养等，欧洲山杨扦插生根困难，此种方法生产上难以利用，而利用嫁接或根蘖的繁殖方式，希望在1～2年内达到几万甚至几百万株苗木的生产能力，则初始繁殖材料至少达到上千株至几万株。。

而且利用“三倍体欧洲无絮山杨快速繁殖体系”中的方法进行灭菌与组织培养，在利用参考文献“三倍体欧洲无絮山杨快速繁殖体系”中的培养方法进行繁殖的过程中，主要问题如下：灭菌方法不可行，在75％酒精中约30～60秒，在0.1％的升汞中灭菌5～10分，无菌水冲洗3～5遍，褐化率达到85％～100％，褐化会导致培育苗难以成活，而褐化率越高表明培育苗的成活率就越低；利用不定芽诱导培养基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L进行腋芽诱导，不定芽诱导率仅为14.2％～25.8％；对于增殖培养基MS+6-BA0.5mg/L+0.05NAAmg/L，植株增殖率为2～3倍，且生长植株平均为1.0～1.5cm，最终导致培育苗的成活率低。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术的不足，而提供一种欧洲山杨品系组培育苗方法，能够提高育苗的成活率。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

一种欧洲山杨品系组培育苗方法，包括以下步骤：

1)将带有腋芽的茎段依次经过酒精溶液浸泡、无菌水冲洗、消毒剂消毒和无菌水再次冲洗后，去掉茎段的两端1～2mm，得到外植体；

2)将所述步骤1)得到的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，分化培养30～45d，得到欧洲山杨不定芽；

3)将所述步骤2)得到的欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行继代培养，得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽；

4)将所述步骤3)得到的1.2～2.0cm的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。

优选的，所述步骤1)中茎段的长度为0.5～2cm。

优选的，所述步骤1)中酒精溶液中乙醇的体积浓度为70～75％，所述酒精溶液浸泡的时间为10～20s；

所述消毒剂为氯化汞溶液，所述氯化汞溶液中氯化汞的质量浓度为0.05～0.15％，所述消毒剂消毒的时间为1.5～4.5min。

优选的，所述步骤2)中的不定芽分化培养基包括以下浓度的组分：

NH₄NO₃150～250mg/L、KNO₃150～200mg/L、CaCl₂40～55mg/L、MgSO₄170～200mg/L、Ca(NO₃)₂260～290mg/L、K₂SO₄140～160mg/L、KH₂PO₄170～200mg/L、KI>3BO₃2.5～3.5mg/L、MnSO₄11～12mg/L、ZnSO₄4.0～4.5mg/L、Na₂MoO₄0.12～0.13mg/L、CuSO₄0.012～0.013mg/L、FeSO₄13.0～14.5mg/L、Na₂-EDTA>

优选的，所述分化培养的条件包括：

所述培养的温度为20～30℃；

所述培养的光照时间为10～15h/d；

所述培养的光照强度为3500～5000Lx；

所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；

所述培养的环境湿度为70～80％。

优选的，所述步骤3)中的继代增殖培养基包括以下浓度的组分：

KNO₃300～400mg/L、NH₄NO₃350～450mg/L、CaCl₂90～100mg/L、MgSO₄330～400mg/L、Ca(NO₃)₂500～600mg/L、K₂SO₄550～650mg/L、KH₂PO₄350～400mg/L、FeSO₄25～30mg/L、Na₂-EDTA35～40mg/L、KI>3BO₃6.0～6.5mg/L、MnSO₄20～25mg/L、ZnSO₄8.0～9.0mg/L、Na₂MoO₄0.2～0.3mg/L、CuSO₄0.2～0.3mg/L、盐酸硫胺素3～8mg/L、烟酸0.3～0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-苄基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量为水。

优选的，所述继代培养的条件包括：

所述培养的温度为20～30℃；

所述培养的光照时间为10～15h/d；

所述培养的光照强度为3500～5000Lx；

所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；

所述培养的环境湿度为70～80％。

优选的，所述步骤4)中的不定芽生根培养基包括以下浓度的组分：

KNO₃300～400mg/L、NH₄NO₃350～450mg/L、CaCl₂90～100mg/L、MgSO₄330～400mg/L、Ca(NO₃)₂500～600mg/L、K₂SO₄550～650mg/L、KH₂PO₄350～400mg/L、FeSO₄25～30mg/L、Na₂-EDTA35～40mg/L、KI>3BO₃6.26.0～6.5mg/L、MnSO₄20～25mg/L、ZnSO₄8.0～9.0mg/L、Na₂MoO₄0.2～0.3mg/L、CuSO₄0.2～0.3mg/L、盐酸硫胺素3～8mg/L、烟酸0.3～0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量为水。

优选的，所述生根培养的条件包括：

所述培养的温度为20～30℃；

所述培养的光照时间为10～15h/d；

所述培养的光照强度为2500～3500Lx；

所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；

所述培养的环境湿度为70～80％。

本发明还包括将上述技术方案得到的欧洲山杨再生组培苗进行两步生根，所述两步生根包括以下步骤：

1)将欧洲山杨再生组培苗的根部用高锰酸钾溶液浸泡后，栽入基质内培养，得到再次生根的欧洲山杨组培苗；所述培养过程中第1～3天环境湿度为80～95％，第4～7天环境湿度为70～85％，第8～10天环境湿度为45～55％，第11天以后为自然环境湿度；

2)将所述步骤1)得到的再次生根的欧洲山杨组培苗移栽到自然光下培养；所述自然光下培养的昼温为21～29℃，所述培养的夜温为18～21℃，所述培养的环境湿度为80～95％。

本发明提供了一种欧洲山杨品系组培育苗方法，包括以下步骤：1)将带有腋芽的茎段依次经过酒精溶液浸泡、无菌水冲洗、消毒剂消毒和无菌水再次冲洗后，去掉茎段的两端1～2mm，得到外植体；2)将所述步骤1)得到的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，分化培养30～45d，得到欧洲山杨不定芽；3)将所述步骤2)得到的欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行继代培养，得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽；4)将所述步骤3)得到的1.2～2.0cm的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。采用此种方法进行移栽，将炼苗与移栽同步进行，减少了以往在培养瓶中炼苗，培养基被空气中的杂菌污染，导致苗木污染，成活率降低。另外，利用速蘸高锰酸钾的方式替代在多菌灵溶液中浸泡的方式进行苗木灭菌，减少了苗木与药品接触的面积，降低了成活率。采用本发明的组培育苗方法，得到组培苗的成活率为91.4～91.6％。本发明的组培育苗方法可使以一个茎段为基数，经培养一年内可增殖到10000～100000株组培苗。

具体实施方式

本发明提供了一种欧洲山杨品系组培育苗方法，包括以下步骤：

1)将带有腋芽的茎段依次经过酒精溶液浸泡、无菌水冲洗、消毒剂消毒和无菌水再次冲洗后，去掉茎段的两端1～2mm，得到外植体；

2)将所述步骤1)得到的外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中，分化培养30～45d，得到欧洲山杨不定芽；

3)将所述步骤2)得到的欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行继代培养，得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽；

4)将所述步骤3)得到的1.2～2.0cm的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。

本发明以带有腋芽的茎段作为原材料培养得到欧洲山杨再生组培苗。在本发明中，所述茎段的来源优选为欧洲山杨根部萌发的或者生长在植株底部的嫩枝，将所述嫩枝在流水下冲洗1～2h后，除去所述嫩枝叶片，将带有腋芽的嫩枝剪切成0.5～2cm长的茎段，所述茎段的长度更优选为1.0～1.5cm。

得到茎段后，本发明采用酒精溶液对所述茎段进行浸泡。在本发明中，所述酒精溶液的体积浓度优选为70～75％，更优选为72～74％；所述酒精溶液浸泡的时间优选为10～20s，更优选浸泡12～18s。

所述酒精溶液浸泡后，本发明采用无菌水对酒精溶液浸泡后的茎段进行冲洗。在本发明中，所述无菌水冲洗的次数优选为2～6次，更优选为冲洗3～5次。

所述无菌水冲洗后，本发明将冲洗后的茎段用消毒剂消毒。在本发明中，所述消毒剂优选为氯化汞溶液；所述氯化汞溶液中氯化汞的质量浓度优选为0.05～0.15％，更优选为0.08～0.12％，最优选为0.10％。在本发明中，所述消毒剂消毒的时间优选为1.5～4.5min，更优选为1.8～4.2min，最优选为2.0～4.0min。

所述消毒后，本发明将所述消毒后的茎段再次用无菌水进行冲洗，所述无菌水冲洗的次数优选为2～6次，更优选为3～5次。

所述无菌水再次冲洗后，本发明优选采用无菌滤纸将所述再次冲洗后的茎段上的无菌水吸干。

上述技术方案所述前处理过程后，本发明将得到的茎段去掉两端1～2mm，得到外植体。在本发明的实施例中，具体采用已消毒的解剖刀对茎段的两端切除。

得到外植体后，本发明将所述外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中进行分化培养，得到欧洲山杨不定芽。在本发明中，所述分化培养的条件优选包括：所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为23～26℃；所述培养的光照时间优选为10～15h/d，更优选为12～14h/d；所述培养的光照强度优选为3500～5000Lx，更优选为3800～4800Lx；所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；所述培养的环境湿度优选为70～80％，更优选为72～78％；所述培养的天数为30～45d，优选为35～40d。

在本发明中，所述不定芽分化培养基优选包括以下组分：NH₄NO₃150～250mg/L、KNO₃150～200mg/L、CaCl₂40～55mg/L、MgSO₄170～200mg/L、Ca(NO₃)₂260～290mg/L、K₂SO₄140～160mg/L、KH₂PO₄170～200mg/L、KI0.41～0.42mg/L、H₃BO₃2.5～3.5mg/L、MnSO₄11～12mg/L、ZnSO₄4.0～4.5mg/L、Na₂MoO₄0.12～0.13mg/L、CuSO₄0.012～0.013mg/L、FeSO₄13.0～14.5mg/L、Na₂-EDTA>4NO₃180～220mg/L、KNO₃160～180mg/L、CaCl₂>4>3)₂270～280mg/L、K₂SO₄145～155mg/L、KH₂PO₄180～190mg/L、KI0.412～0.418mg/L、H₃BO₃2.8～3.3mg/L、MnSO₄11.10～11.18mg/L、ZnSO₄4.1～4.4mg/L、Na₂MoO₄0.121～0.128mg/L、CuSO₄0.0121～0.0128mg/L、FeSO₄13.3～14.2mg/L、Na₂-EDTA>4NO₃200mg/L、KNO₃170mg/L、CaCl₂48mg/L、MgSO₄185mg/L、Ca(NO₃)₂275mg/L、K₂SO₄300mg/L、KH₂PO₄185mg/L、KI>3BO₃3.1mg/L、MnSO₄11.15mg/L、ZnSO₄4.3mg/L、Na₂MoO₄0.125mg/L、CuSO₄0.0125mg/L、FeSO₄13.9mg/L、Na₂-EDTA>

本发明对所述不定芽分化培养基的灭菌条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的方法即可，如115～121℃灭菌15～30min。

得到欧洲山杨不定芽后，本发明将所述所述欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行继代培养，得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽。在本发明中，所述继代培养的条件包括：所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为23～26℃；所述培养的光照时间优选为10～15h/d，更优选为12～14h/d；所述培养的光照强度优选为3500～5000Lx，更优选为3800～4800Lx；所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；所述培养的环境湿度优选为70～80％，更优选为72～78％；所述培养的天数为20～30d，优选为23～28d。

在本发明中，所述继代增殖培养基优选包括以下浓度的组分：KNO₃300～400mg/L、NH₄NO₃350～450mg/L、CaCl₂90～100mg/L、MgSO₄330～400mg/L、Ca(NO₃)₂500～600mg/L、K₂SO₄550～650mg/L、KH₂PO₄350～400mg/L、FeSO₄25～30mg/L、Na₂-EDTA35～40mg/L、KI>3BO₃6.0～6.5mg/L、MnSO₄20～25mg/L、ZnSO₄8.0～9.0mg/L、Na₂MoO₄0.2～0.3mg/L、CuSO₄0.2～0.3mg/L、盐酸硫胺素3～8mg/L、烟酸0.3～0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、6-苄基腺嘌呤0.5～1.5mg/L、萘乙酸0.03～0.08mg/L，余量为水；更优选包括KNO₃320～360mg/L、NH₄NO₃380～420mg/L、CaCl₂93～97mg/L、MgSO₄350～380mg/L、Ca(NO₃)₂520～580mg/L、K₂SO₄580～620mg/L、KH₂PO₄360～380mg/L、FeSO₄26～29mg/L、Na₂-EDTA36～38mg/L、KI>3BO₃6.1～6.3mg/L、MnSO₄21～24mg/L、ZnSO₄8.4～8.8mg/L、Na₂MoO₄0.22～0.28mg/L、CuSO₄0.22～0.28mg/L、盐酸硫胺素5～7mg/L、烟酸0.4～0.7mg/L、盐酸吡哆醇0.4～0.7mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.8～1.2mg/L、萘乙酸0.04～0.07mg/L，余量为水；最优选包括KNO₃340mg/L、NH₄NO₃400mg/L、CaCl₂96mg/L、MgSO₄370mg/L、Ca(NO₃)₂550mg/L、K₂SO₄600mg/L、KH₂PO₄370mg/L、FeSO₄27.8mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、KI>3BO₃6.2mg/L、MnSO₄22.3mg/L、ZnSO₄8.6mg/L、Na₂MoO₄0.25mg/L、CuSO₄0.25mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-苄基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量为水。

本发明对所述继代增殖培养基的灭菌条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的方法即可，如115～121℃灭菌15～30min。

得到1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽后，本发明将所述1.2～2.0cm高的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。在本发明中，所述生根培养的条件包括：所述培养的温度优选为20～30℃，更优选为23～26℃；所述培养的光照时间优选为10～15h/d，更优选为12～14h/d；所述培养的光照强度优选为2000～4000Lx，更优选为2500～3500Lx；所述培养的光源为三基色色温6500k荧光灯；所述培养的环境湿度优选为70～80％，更优选为72～78％，所述培养的天数为20～30d，优选为23～28d。

在本发明中，所述组培苗的高度优选为3～6cm，更优选为4～5cm；所述组培苗优选具有2～6片叶片，更优选为3～5片。

在本发明中，所述不定芽生根培养基优选包括以下浓度的组分：KNO₃300～400mg/L、NH₄NO₃350～450mg/L、CaCl₂90～100mg/L、MgSO₄330～400mg/L、Ca(NO₃)₂500～600mg/L、K₂SO₄550～650mg/L、KH₂PO₄350～400mg/L、FeSO₄25～30mg/L、Na₂-EDTA35～40mg/L、KI>3BO₃6.0～6.5mg/L、MnSO₄20～25mg/L、ZnSO₄8.0～9.0mg/L、Na₂MoO₄0.2～0.3mg/L、CuSO₄0.2～0.3mg/L、盐酸硫胺素3～8mg/L、烟酸0.3～0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3～0.8mg/L、肌醇90～110mg/L、甘氨酸1～3mg/L、乙哚丁酸1.0～2.0mg/L、萘乙酸0.005～0.015mg/L，余量为水；更优选包括KNO₃320～360mg/L、NH₄NO₃380～420mg/L、CaCl₂94～98mg/L、MgSO₄350～390mg/L、Ca(NO₃)₂520～570mg/L、K₂SO₄580～620mg/L、KH₂PO₄360～380mg/L、FeSO₄26～19mg/L、Na₂-EDTA>3BO₃6.1～6.4mg/L、MnSO₄21～24mg/L、ZnSO₄8.4～8.8mg/L、Na₂MoO₄0.22～0.0.28mg/L、CuSO₄0.22～0.28mg/L、盐酸硫胺素6～7mg/L、烟酸0.4～0.6mg/L、盐酸吡哆醇0.4～0.6mg/L、肌醇95～105mg/L、甘氨酸1.5～2.5mg/L、乙哚丁酸1.2～1.8mg/L、萘乙酸0.008～0.012mg/L，余量为水；最优选包括KNO₃340mg/L、NH₄NO₃400mg/L、CaCl₂370mg/L、MgSO₄370mg/L、Ca(NO₃)₂550mg/L、K₂SO₄600mg/L、KH₂PO₄370mg/L、FeSO₄27.8mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、KI>3BO₃6.2mg/L、MnSO₄22.3mg/L、ZnSO₄8.6mg/L、Na₂MoO₄0.25mg/L、CuSO₄0.25mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量为水。

本发明对所述不定芽生根培养基的灭菌条件没有特殊限定，采用本领域技术人员常规选用的方法即可，如115～121℃灭菌15～30min。

得到欧洲山杨再生组培苗后，优选将所述组培苗的根部沾入高锰酸钾溶液中，灭菌后直接栽入已灭菌的装有蛭石的育苗盘内。在本发明中，高锰酸钾溶液中高锰酸钾的质量浓度优选为0.3～0.8％，更优选为0.5％。在本发明中，所述育苗盘内，组培苗的株行距为3cm×4cm。

在本发明中，所述组培苗移栽到育苗盘内的当日浇透水，优选在以后3d内用塑料膜将育苗盘连同所述组培苗一同盖严，第4～10d逐渐揭去塑料膜。第1～3天空气湿度优选保持在80～95％，更优选为85～90％；第4～7天空气湿度优选保持在70～85％，更优选为75～80％；第8～10d空气湿度优选保持在45～55％更优选为50％。优选在第2、7d分别以1/4MS培养基大量元素溶液进行叶面施肥，施肥量优选为25～35ml/m²，更优选为30ml/m²；移栽第7～15d后组培苗木长出新根。

在本发明中，将所述已经长出新根的组培苗连同粘在上面的蛭石优选一起植入轻基质网袋育苗容器内，在温室中缓苗2～3d后移入自然光下，整个过程环境条件为：昼温21℃～29℃、夜温18℃～21℃、湿度80％～95％。

在本发明中，移栽到轻基质网袋育苗容器内的组培苗的水肥管理优选为容器内的基质湿度优选保持在45～85％，更优选为60％～70％。组培苗恢复生长后25～35d，用复合肥和尿素每隔10d喷施1次。所述复合肥与尿素的质量比优选为(0.5～1.5):(0.5～1.5)，更优选为1:1。所述喷施的浓度优选为0.3～0.8％，更优选为0.5％。所述喷施的喷施量优选为0.1～0.5％，更优选为0.3％。第二个月，所述喷施的浓度优选为0.5～0.6％，更优选为0.55％。第三个月，所述喷施的浓度优选为0.7～1.1％，更优选为0.8～1.0％。在本发明中，喷施复合肥和尿素后，优选采用清水冲洗液面，以免造成肥害。

在本发明中，移栽到轻基质网袋育苗容器内的组培苗的病害防治优选为每月用质量浓度为0.5％波尔多液与多菌灵500倍药液交替喷洒1次，以防止立枯病的发生。所述0.5％波尔多液中的活性物质为硫酸铜和生石灰，质量比为1:1。

下面结合实施例对本发明提供的一种欧洲山杨品系组培育苗方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将欧洲山杨根部萌发的嫩枝剪下，在流水下冲洗1h后，去除嫩枝叶片，将带腋芽的嫩枝剪成1.0cm的茎段，用质量浓度为70％乙醇溶液对茎段表面进行消毒10ss，然后用无菌水冲洗3遍，再用质量浓度为0.1％氯化汞消毒2.0min后，再次用无菌水冲洗3遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，用已消毒的解剖刀切除带腋芽茎段的两端1mm，得到外植体；

将外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中进行分化培养，得到欧洲山杨不定芽，培养的条件包括温度23℃、光照时间12h/d，光强3500Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度70％的条件下培养30d，得到欧洲山杨的不定芽；不定芽分化培养基的组分为：NH₄NO₃200mg/L、KNO₃170mg/L、CaCl₂48mg/L、MgSO₄>3)₂275mg/L、K₂SO₄300mg/L、KH₂PO₄185mg/L、KI>3BO₃3.1mg/L、MnSO₄11.15mg/L、ZnSO₄4.3mg/L、Na₂MoO₄0.125mg/L、CuSO₄0.0125mg/L、FeSO₄13.9mg/L、Na₂-EDTA>

将欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行增殖培养，得到1.5cm高的欧洲山杨不定芽。继代培养的条件包括：温度23℃、光照时间12h/d、光强3500Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度70％；继代增殖培养基的组分为：KNO₃340mg/L、NH₄NO₃400mg/L、CaCl₂96mg/L、MgSO₄370mg/L、Ca(NO₃)₂550mg/L、K₂SO₄600mg/L、KH₂PO₄370mg/L、FeSO₄27.8mg/L、Na₂-EDTA37.3mg/L、KI>3BO₃6.2mg/L、MnSO₄22.3mg/L、ZnSO₄8.6mg/L、Na₂MoO₄0.25mg/L、CuSO₄0.25mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、6-苄基腺嘌呤1.0mg/L、萘乙酸0.05mg/L，余量为水。

将1.5cm苗高的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。生根培养的条件包括：温度23℃、光照时间12h/d、光强2500Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯、湿度70％～80％，得到苗高为4cm且具有3片叶片的欧洲山杨再生组培苗。不定芽生根培养基的组分为：KNO₃340mg/L、NH₄NO₃400mg/L、CaCl₂96mg/L、MgSO₄370mg/L、Ca(NO₃)₂550mg/L、K₂SO₄600mg/L、KH₂PO₄370mg/L、FeSO₄27.8mg/L、Na₂-EDTA 37.3mg/L、KI>3BO₃6.2mg/L、MnSO₄22.3mg/L、ZnSO₄8.6mg/L、Na₂MoO₄0.25mg/L、CuSO₄0.25mg/L、盐酸硫胺素5mg/L、烟酸0.5mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、乙哚丁酸1.5mg/L、萘乙酸0.01mg/L，余量为水。

将欧洲山杨组培苗从不定芽生根培养基中拔出，洗掉根上附着的培养基，将根沾入质量浓度为0.5％的高锰酸钾溶液中灭菌后直接栽入已灭菌的装有蛭石的育苗盘内，株行距为3cm×4cm，当日浇透水，以后3d内用塑料膜将育苗盘连同移栽小苗一同盖严，以保持相对湿度，第4～10d逐渐揭去塑料膜，第1～3d空气湿度保持在85％，第4～7d空气湿度保持在75％，第8～10d空气湿度保持在50％。期间第2、7d分别以1/4MS培养基大量元素溶液进行叶面施肥，施肥量30ml/m²，移栽第7～15d后苗木长出新根。将已经长出新根的小苗连同粘在上面的蛭石一起植入轻基质网袋育苗容器内在温室中缓苗2～3d，移入自然光下，正常生长和管理。

容器苗苗期水肥管理与病虫害防治：轻基质网袋育苗法苗期生长要特别注意水肥的管理，基质湿度保持在25％。芽苗恢复生长后约30d，用复合肥和尿素对半拌匀，每隔10d追施1次，施肥浓度按0.5％，施肥量0.3g/株，随着苗木增大，移栽后第二个月施肥浓度调整为0.55％，第三个月后调整为0.8％，同时施肥后用清水冲洗叶面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波尔多液与多菌灵500倍药液交替喷洒1次，以防止立枯病的发生。

茎段经过酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，对茎段的杀伤率为7.5％，对茎段的污染率为12.5％；茎段在不定芽分化培养基中分化培养后，分化率为87％，分化系数为4.23；欧洲山杨不定芽接种到继代增殖培养基中进行增殖培养，增殖系数为4.5；欧洲山杨不定芽转接到不定芽生根培养基中进行生根培养，生根率为89.6％，每组培苗生根条数为10条，成活率为91.4％；本发明的茎段经过分化培养、增殖培养和生根培养三个阶段，使茎段的繁殖周期缩短1～2个月；将欧洲山杨组培苗移栽到育苗盘内，待长出新根后再移栽到育苗容器内培养，可使组培苗的移栽成活率在95％以上；移栽的欧洲山杨组培苗的茎、根干质量比例为1.5:1，组培苗的苗干90％以上达到木质化。

实施例2

将欧洲山杨根部萌发的嫩枝剪下，在流水下冲洗2h后，去除嫩枝叶片，将带腋芽的嫩枝剪成1.5cm的茎段，用质量浓度为75％乙醇溶液对茎段表面进行消毒15s，然后用无菌水冲洗3遍，再用质量浓度为0.12％氯化汞消毒4.0min后，再次用无菌水冲洗3遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，用已消毒的解剖刀切除带腋芽茎段的两端2mm，得到外植体；

将外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中进行分化培养，得到欧洲山杨不定芽，培养的条件包括温度26℃、光照时间14h/d，光强5000Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度80％的条件下培养45d，得到欧洲山杨的不定芽；不定芽分化培养基的组分为：NH₄NO₃150mg/L、KNO₃150mg/L、CaCl₂40mg/L、MgSO₄200mg/L、Ca(NO₃)₂260mg/L、K₂SO₄140mg/L、KH₂PO₄200mg/L、KI>3BO₃3.5mg/L、MnSO₄12mg/L、ZnSO₄4.5mg/L、Na₂MoO₄0.12mg/L、CuSO₄0.012mg/L、FeSO₄13.0mg/L、Na₂-EDTA18mg/L、肌醇40mg/L、盐酸吡哆醇0.3mg/L、烟酸0.3mg/L、盐酸硫胺素2.0mg/L、甘氨酸1.5mg/L、6-苄基腺嘌呤0.3mg/L，余量为水。

将欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行增殖培养，得到2.0cm高的欧洲山杨不定芽。继代培养的条件包括：温度26℃、光照时间14h/d、光强5000Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度80％；继代增殖培养基的组分为：KNO₃300mg/L、NH₄NO₃350mg/L、CaCl₂90mg/L、MgSO₄330mg/L、Ca(NO₃)₂500mg/L、K₂SO₄550mg/L、KH₂PO₄350mg/L、FeSO₄25mg/L、Na₂-EDTA40mg/L、KI>3BO₃6.5mg/L、MnSO₄25mg/L、ZnSO₄9.0mg/L、Na₂MoO₄0.3mg/L、CuSO₄0.3mg/L、盐酸硫胺素8mg/L、烟酸0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇110mg/L、甘氨酸3mg/L、6-苄基腺嘌呤1.5mg/L、萘乙酸0.08mg/L，余量为水。

将2.0cm苗高的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。生根培养的条件包括：温度26℃、光照时间14h/d、光强2500Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯、湿度80％，得到苗高为4cm且具有5片叶片的欧洲山杨再生组培苗。不定芽生根培养基的组分为：KNO₃300mg/L、NH₄NO₃350mg/L、CaCl₂96mg/L、MgSO₄330mg/L、Ca(NO₃)₂500mg/L、K₂SO₄550mg/L、KH₂PO₄350mg/L、FeSO₄25mg/L、Na₂-EDTA40mg/L、KI>3BO₃6.5mg/L、MnSO₄25mg/L、ZnSO₄9.0mg/L、Na₂MoO₄0.3mg/L、CuSO₄0.3mg/L、盐酸硫胺素8mg/L、烟酸0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量为水。

将欧洲山杨组培苗从不定芽生根培养基中拔出，洗掉根上附着的培养基，将根沾入质量浓度为0.5％的高锰酸钾溶液中灭菌后直接栽入已灭菌的装有蛭石的育苗盘内，株行距为3cm×4cm，当日浇透水，以后3d内用塑料膜将育苗盘连同移栽小苗一同盖严，以保持相对湿度，第4～10d逐渐揭去塑料膜，第1～3d空气湿度保持在85％，第4～7d空气湿度保持在75％，第8～10d空气湿度保持在50％。期间第2、7d分别以1/4MS培养基大量元素溶液进行叶面施肥，施肥量30ml/m²，移栽第7～15d后苗木长出新根。将已经长出新根的小苗连同粘在上面的蛭石一起植入轻基质网袋育苗容器内在温室中缓苗2～3d，移入自然光下，正常生长和管理。

容器苗苗期水肥管理与病虫害防治：轻基质网袋育苗法苗期生长要特别注意水肥的管理，基质湿度保持在25％。芽苗恢复生长后约30d，用复合肥和尿素对半拌匀，每隔10d追施1次，施肥浓度按0.5％，施肥量0.3g/株，随着苗木增大，移栽后第二个月施肥浓度调整为0.55％，第三个月后调整为0.8％，同时施肥后用清水冲洗叶面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波尔多液与多菌灵500倍药液交替喷洒1次，以防止立枯病的发生。

茎段经过酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，对茎段的杀伤率为7.4％，对茎段的污染率为12.0％；茎段在不定芽分化培养基中分化培养后，分化率为88％，分化系数为4.23；欧洲山杨不定芽接种到继代增殖培养基中进行增殖培养，增殖系数为4.6；欧洲山杨不定芽转接到不定芽生根培养基中进行生根培养，生根率为90％，每组培苗生根条数为14条，成活率为91.6％；本发明的茎段经过分化培养、增殖培养和生根培养三个阶段，使茎段的繁殖周期缩短1～2个月；将欧洲山杨组培苗移栽到育苗盘内，待长出新根后再移栽到育苗容器内培养，可使组培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的欧洲山杨组培苗的茎、根干质量比例为1.5:1，组培苗的苗干90％以上达到木质化。

实施例3

将欧洲山杨根部萌发的嫩枝剪下，在流水下冲洗1.5h后，去除嫩枝叶片，将带腋芽的嫩枝剪成1.5cm的茎段，用质量浓度为75％乙醇溶液对茎段表面进行消毒20s，然后用无菌水冲洗3遍，再用质量浓度为0.08％氯化汞消毒3.5min后，再次用无菌水冲洗3遍，最后用无菌滤纸吸干无菌水，用已消毒的解剖刀切除带腋芽茎段的两端1.5mm，得到外植体；

将外植体接种到已灭菌的不定芽分化培养基中进行分化培养，得到欧洲山杨不定芽，培养的条件包括温度24℃、光照时间13h/d，光强4000Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度75％的条件下培养35d，得到欧洲山杨的不定芽；不定芽分化培养基的组分为：NH₄NO₃250mg/L、KNO₃200mg/L、CaCl₂55mg/L、MgSO₄>3)₂290mg/L、K₂SO₄160mg/L、KH₂PO₄170mg/L、KI>3BO₃2.5mg/L、MnSO₄11mg/L、ZnSO₄4.0mg/L、Na₂MoO₄0.13mg/L、CuSO₄0.013mg/L、FeSO₄14.5mg/L、Na₂-EDTA19mg/L、肌醇60mg/L、盐酸吡哆醇0.2mg/L、烟酸0.2mg/L、盐酸硫胺素3.0mg/L、甘氨酸0.5mg/L、6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，余量为水。

将欧洲山杨不定芽接种到已灭菌的继代增殖培养基中进行增殖培养，得到2.0cm高的欧洲山杨不定芽。继代培养的条件包括：温度25℃、光照时间13h/d、光强4000Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯和湿度75％；继代增殖培养基的组分为：KNO₃400mg/L、NH₄NO₃450mg/L、CaCl₂100mg/L、MgSO₄400mg/L、Ca(NO₃)₂600mg/L、K₂SO₄650mg/L、KH₂PO₄400mg/L、FeSO₄30mg/L、Na₂-EDTA35mg/L、KI>3BO₃6.0mg/L、MnSO₄30mg/L、ZnSO₄8.0mg/L、Na₂MoO₄0.2mg/L、CuSO₄0.2mg/L、盐酸硫胺素3mg/L、烟酸0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.8mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、6-苄基腺嘌呤0.5mg/L、萘乙酸0.03mg/L，余量为水。

将2.0cm苗高的欧洲山杨不定芽转接到已灭菌的不定芽生根培养基中进行生根培养，得到欧洲山杨再生组培苗。生根培养的条件包括：温度24℃、光照时间13h/d、光强3000Lx、光源为三基色色温6500k荧光灯、湿度75％，得到苗高为4cm且具有4片叶片的欧洲山杨再生组培苗。不定芽生根培养基的组分为：KNO₃400mg/L、NH₄NO₃350mg/L、CaCl₂96mg/L、MgSO₄330mg/L、Ca(NO₃)₂500mg/L、K₂SO₄550mg/L、KH₂PO₄350mg/L、FeSO₄25mg/L、Na₂-EDTA40mg/L、KI>3BO₃6.5mg/L、MnSO₄25mg/L、ZnSO₄9.0mg/L、Na₂MoO₄0.3mg/L、CuSO₄0.3mg/L、盐酸硫胺素8mg/L、烟酸0.8mg/L、盐酸吡哆醇0.3mg/L、肌醇90mg/L、甘氨酸1mg/L、乙哚丁酸1.0mg/L、萘乙酸0.015mg/L，余量为水。

将欧洲山杨组培苗从不定芽生根培养基中拔出，洗掉根上附着的培养基，将根沾入质量浓度为0.5％的高锰酸钾溶液中灭菌后直接栽入已灭菌的装有蛭石的育苗盘内，株行距为3cm×4cm，当日浇透水，以后3d内用塑料膜将育苗盘连同移栽小苗一同盖严，以保持相对湿度，第4～10d逐渐揭去塑料膜，第1～3d空气湿度保持在85％，第4～7d空气湿度保持在75％，第8～10d空气湿度保持在50％。期间第2、7d分别以1/4MS培养基大量元素溶液进行叶面施肥，施肥量30ml/m²，移栽第7～15d后苗木长出新根。将已经长出新根的小苗连同粘在上面的蛭石一起植入轻基质网袋育苗容器内在温室中缓苗2～3d，移入自然光下，正常生长和管理。

容器苗苗期水肥管理与病虫害防治：轻基质网袋育苗法苗期生长要特别注意水肥的管理，基质湿度保持在25％。芽苗恢复生长后约30d，用复合肥和尿素对半拌匀，每隔10d追施1次，施肥浓度按0.5％，施肥量0.3g/株，随着苗木增大，移栽后第二个月施肥浓度调整为0.55％，第三个月后调整为0.8％，同时施肥后用清水冲洗叶面，以免肥害。芽苗移栽成活后，每月用0.5％波尔多液与多菌灵500倍药液交替喷洒1次，以防止立枯病的发生。

茎段经过酒精溶液浸泡和氯化汞溶液消毒后，对茎段的杀伤率为7.3％，对茎段的污染率为12.2％；茎段在不定芽分化培养基中分化培养后，分化率为89％，分化系数为4.23；欧洲山杨不定芽接种到继代增殖培养基中进行增殖培养，增殖系数为4.6；欧洲山杨不定芽转接到不定芽生根培养基中进行生根培养，生根率为90％，每组培苗生根条数为9条，成活率为91.6％；本发明的茎段经过分化培养、增殖培养和生根培养三个阶段，使茎段的繁殖周期缩短1～2个月；将欧洲山杨组培苗移栽到育苗盘内，待长出新根后再移栽到育苗容器内培养，可使组培苗的移栽成活率在95％以上，移栽的欧洲山杨组培苗的茎、根干质量比例为1.5:1，组培苗的苗干90％以上达到木质化。

由以上实施例可知，采用本发明的欧洲山杨品系组培育苗方法，得到组培苗的成活率为91.4～91.6％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。