一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法

摘要

本发明公开了一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，包括以下步骤：(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；(2)选取已发表的127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧木的DNA间的位点多态率；(3)选取与蜡杨梅DNA位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接该接穗。本发明经过大量实验发现位点多态率与嫁接成活率SR间是显著性负相关，即多态率越高，SR越低。因此选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高，适用作为盐碱地的经济树种。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法。

背景技术

杨梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc.)是中国南方的一种重要的经济作物，距今已有7000年的栽培历史(Jiao et al.2012)，适合生长在弱酸性的土壤中。2016年浙江全省杨梅面积134.1万亩，产量52.4万吨，产值46.2亿元，其中最著名的两个栽培种是‘荸荠种’和‘东魁’。中国杨梅种类主要包括以下四类：M.rubra，M.esculenta，M.nana和M.adenophora。其他的杨梅种类还有：M.cerifera，M.faya和M.rivas-martinezii(Jia et al.2015)。Myrica cerifera是一种常绿的雌雄异株的植物，多年生灌木，枝干高度可达6米，通常生长在美国东南部沿海地区(Radford et al.1968)。蜡杨梅果实为单粒种子的核果，果实小，直径4mm，被蜡质类的物质覆盖表面，因此而得名。果实在初秋时节成熟(Erickson etal.2003)。它与固氮菌(Frankia sp.)共生，可以生长在较为贫瘠的沙质土地上(Young etal,1992)。盐胁迫是一种影响各类作物生长和产出的非生物胁迫(Shrivastava and Kumar2015)。世界范围内，20％的可耕作土地和33％的可灌溉农业用地均受到高盐害的影响(Panwar et al.2016)。土地盐碱化以每年10％的速度快速增长，预计到2050年盐碱地面积能够达到全部耕地面积的50％(Shrivastava and Kumar2015)。鉴定新型的适应盐碱地的植物可作为一种有效利用盐碱地的方法。以蜡杨梅为砧木以达到高效利用盐碱地的目的。嫁接是一种在果树上广泛应用的农艺技术(Ostendorp et al.2016)。选取具有耐盐碱性，抗病性等品种做为砧木，可以达到提高作物的产量和品质的目的。

SSR标记是遗传多样性分析，聚类分析，遗传图谱构建和种质鉴定的首选标记，因为它具有高多态性、共显性及可重复性等特点。SSR标记已被多种果树利用以构建遗传图谱，例如：胡桃(Cheng et al.2010；Han et al.2016),番石榴(Mehmood et al.2016),苦樱桃(Liang et al.2016),椰子(Kamaral et al.2016),苹果(Okada et al.2016),枇杷(Fukuda et al.2016)和梨(Nishio et al.2016)等。分子标记在理论研究和分子标记辅助育种中都起着重要的作用。

发明内容

本发明的技术目的是：提供一种基于SSR标记预测蜡杨梅为砧木的嫁接成活率的方法。本发明选用蜡杨梅作为砧木，以四种当地主栽品种的杨梅(M.

rubra)‘荸荠种’(BQ)、‘东魁’(DK)、‘水晶’(SJ)和‘夏至红’(XZH)为接穗进行试验。在过去三年的嫁接试验中，获得了稳定的各嫁接组合的嫁接成活率(SR)，然后利用127对标记对四种接穗与蜡杨梅砧木的DNA进行多态性鉴定，并与SR之间进行相关性分析，结果发现四种接穗与蜡杨梅砧木间的位点多态率与SR间是显著性负相关，即多态率越高，嫁接成活率越低。因此可利用SSR标记来筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗，将待筛选杨梅接穗与腊杨梅砧木的

DNA进行多态性鉴定，选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高。

本发明采用的技术方案是：

一种基于SSR标记筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)选取不同品种的杨梅及蜡杨梅砧木枝条，每一品种和砧木各取样2份以上，提取其DNA；

(2)选取127对SSR引物对步骤(1)提取的DNA进行PCR扩增，电泳检测、银染显色，检测不同杨梅枝条与蜡杨梅砧木的DNA间的位点多态率；

(3)选取与蜡杨梅DNA位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接该接穗。

进一步，所述步骤(1)中，提取DNA的方法为CTAB方法。进一步，选取杨梅枝条的嫩叶，用组织磨样仪(Thmorgan,China)研磨，之后用CTAB方法提取样品DNA(Paterson etal.2003)。由紫外分光光度计和1％的琼脂糖胶电泳测定DNA浓度。

所述步骤(2)中，PCR反应体系为10μl体系，包括：DNA 1μl，Blue mix(TSINGKE,Hangzhou,China)5μl，Forward primer 1μl，Reversed primer 1μl，ddH₂O2μl.扩增反应由Biometra(America)PCR仪完成，程序为：94℃预变性5min，94℃(30s)/55℃(30s)/72℃(1min)30个循环，72。C(10min)，最后延伸10℃(1min)。PCR产物电泳检测和银染显色过程参考Zhang>

所述步骤(2)中，采用的127对SSR引物的序列来自于Jiao Y,Jia HM,Li XW,ChaiML,Jia HJ,Chen Z,Wang GY,Chai CY,Eric van de Weg,Gao ZS.Development of simplesequence repeat(SSR)markers from a genome survey of Chinese bayberry(Myricarubra).BMC Genomics(2012),13:201.所选标记及序列详见表1。

表1SSR引物的序列

所述步骤(3)中，嫁接的方法为切接，所述切接可以是主干上的切接或在枝条上的切接。

本发明提供的方法筛选出来的杨梅接穗，以蜡杨梅为砧木嫁接后，可以种植于盐碱地上，作为沿海地区盐碱滩涂地的经济树种，提高盐碱地的绿化和经济价值，解决了现有杨梅品种不耐盐碱性的问题。

本发明选用本地普通杨梅和蜡杨梅作为砧木，以BQ、DK、SJ和XZH四种当地的主栽品种作为接穗进行试验。在过去三年的嫁接试验中，获得了稳定的各嫁接组合的SR，然后利用127对标记对四种接穗与蜡杨梅砧木的DNA之间进行多态性鉴定，127对SSR引物共计产生385个多态性位点，每对引物可以产生2-6个不同的位点，并将位点多态率与SR之间进行相关性分析，结果发现位点多态率与SR间是显著性负相关，即多态率越高，SR越低。因此可利用SSR标记来筛选以蜡杨梅为砧木嫁接杨梅接穗，将待筛选杨梅接穗与腊杨梅砧木的DNA进行多态性鉴定，选取位点多态率最低的杨梅枝条作为最佳接穗，其嫁接成活率最高，适用作为盐碱地的经济树种。

附图说明

图1砧木主干及枝条上的切接，图中A、B图为主干上的切接，C、D图为枝条上的切接。

图2 SSR引物(ZJU049)对20份DNA的多态性检测图。

具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1

材料和方法

材料

蜡杨梅(Myrica cerifera)是一种常绿的雌雄异株植物，多年生灌木，高度可达6米，通常生长在美国东南部沿海地区。蜡杨梅果实为单粒种子的核果，果实小，直径只有4mm，被蜡质类的物质覆盖表面。本研究中，砧木选用M.cerifera和当地杨梅(M.rubra)，选取余姚市的四种主栽品种BQ、DK、SJ和XZH为接穗。这四个品种的果实颜色能够代表杨梅果实的四种颜色：白色(SJ)、粉色(XZH)、红色(DK)、乌紫色(BQ)。

嫁接实验与性状调查

选取8年生的蜡杨梅为砧木(砧木高度：40-50cm)，2年生的BQ、DK、SJ和XZH的枝条为接穗(接穗长度4-5cm)，采用切接的方法(如图1所示)，蜡杨梅与不同接穗间进行嫁接实验，砧木和接穗共计形成4个不同的组合。蜡杨梅砧木适于生长在盐碱环境中(土壤pH：7.89-8.19)。

2013年3月，每种组合至少进行了5000次嫁接实验，2014年3月重复上年的工作；2015年5月，调查2013年每个组合的SR，每个组合各取嫩叶2份，蜡杨梅砧木取样两份，共计取样10份。2016年5月，调查2014年每个组合的SR，同时利用相同的方法调查SR和取样10份。两年共计取样20份。对取样的材料进行编号记录：BQ1与BQ2：2013年以蜡杨梅为砧木，‘荸荠种’为接穗，SR为33.367％；BQ3与BQ4：2014年以蜡杨梅为砧木，‘荸荠种’为接穗，SR为32.471％；DK1和DK2，DK3和DK4：分别为2013和2014年以蜡杨梅为砧木，‘东魁’为接穗，SR分别是38.294和33.467％；SJ1和SJ2，SJ3和SJ4：分别为2013和2014年以蜡杨梅为砧木，‘水晶’为接穗，SR分别为30.352和28.753％；XZH1和XZH2，XZH3和XZH4：分别是2013和2014年以蜡杨梅为砧木，‘夏至红’为接穗，嫁接成活率分别为31.148和29.765％。M.cerifera1和2：2013年蜡杨梅砧木；M.cerifera3和4：2014年蜡杨梅砧木。

DNA提取，PCR扩增和电泳

24份材料的幼嫩叶片均由组织磨样仪(Thmorgan,China)研磨，之后用CTAB方法提取样品DNA(Paterson et al.2003)。由紫外分光光度计和1％的琼脂糖胶电泳测定DNA浓度。

本研究利用的127对SSR引物的序列来自于Jiao et al.(2012)，引物序列如表1所示。PCR反应体系为10μl体系，包括：DNA 1μl，Blue mix(TSINGKE,Hangzhou,China)5μl，Forward primer 1μl，Reversed primer 1μl，ddH₂O>

表1SSR引物的序列

数据分析

位点多态性与SR间的相关性分析由SPSSv18.0(SPSS,Chicago,IL,USA)计算。

结果

1、位点多态率与嫁接成活率相关性

127对SSR引物共计产生385个多态性位点，每对引物可以产生2-6个不同的位点。

2013年以蜡杨梅为砧木与‘荸荠种’的嫁接成活率为33.367％，2014年以蜡杨梅为砧木与‘荸荠种’的嫁接成活率为32.471％；2013和2014年以蜡杨梅为砧木与‘东魁’的嫁接成活率分别是38.294和33.467％；2013和2014年以蜡杨梅为砧木与‘水晶’的嫁接成活率分别为30.352和28.753％；2013和2014年以蜡杨梅为砧木与‘夏至红’的嫁接成活率分别为31.148和29.765％。

四种接穗与蜡杨梅砧木间的位点多态率及嫁接成活率如表2所示，位点多态率与嫁接成活率间的相关性分析如表3所示。

表2四种接穗与蜡杨梅砧木间的位点多态率及嫁接成活率

表3位点多态率与嫁接成活率间的相关性分析

**：在0.01水平(双侧)上显著相关。

*：在0.05水平(双侧)上显著相关。

表3显示了位点多态率与嫁接成活率间是显著性负相关，即多态率越高，嫁接成活率越低。

表2表明：DK与蜡杨梅的位点多态率最低，平均为61.038％，其嫁接成活率最高，平均为35.881％。所以推测蜡杨梅砧木与接穗的位点多态率小于61％时，未知接穗的嫁接成活率能达到35％。

讨论：

中国盐碱地面广量大，西北、华北、东北西部和滨海地区都有分布，类型多样，合理开发利用这些资源，是中国农业可持续发展的重要途径之一，也对改善生态环境，推动区域经济、社会和生态可持续发展具有特别重要意义。蜡杨梅是一种新型的适应盐碱环境的砧木类型，为合理开发和利用盐碱滩涂提供可靠方案。而蜡杨梅(M.cerifera)与杨梅(M.rubra)之间亲缘关系较远，亲缘系数仅为0.45，存在种间差异，故嫁接成活率较低。而且通过实验发现，位点多态率与嫁接成活率间是显著性负相关，所以利用SSR引物多态性预测未知接穗与蜡杨梅嫁接的成活率意义重大。