一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂及应用

摘要

本发明公开了一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂及应用。本发明提供的促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂，包括：考克氏菌（Kocuria marina）FE01，Lysinibacillus boronitolerans FE04，奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）FE08和Bacillus subtilis BSF-CL，用于水虻转化鸡粪过程中促进水虻生长，安全环保。通过在含有水虻的鸡粪中投加该菌剂，比不加菌的水虻鸡粪转化体系的水虻增重提高达28.57%，在大规模水虻转化鸡粪中，可以显著提高经济效益，具有重大经济价值。

说明书

技术领域

本发明属于农业微生物学、生态农业、环保等领域，具体涉及一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂及应用。

背景技术

1、亮斑扁角水虻

亮斑扁角水虻(Hermetiaillucens L)，英文名为Black soldier fly，是双翅目，水虻科，扁角水虻属，亮斑扁角水虻种的一种昆虫。其幼虫可达20mm长，起源于北美洲，现已成为世界性广泛分布的昆虫，在北纬45°至南纬40°之间均有分布，在美洲、欧洲、亚洲、大洋洲和多个太平洋岛屿上都有记录。我国的亮斑扁角水虻主要在华中和华南地区分布。亮斑扁角水虻的生长发育时期分为卵期、幼虫期、蛹期和成虫期，幼虫期又可分为6个不同的龄期，第6龄幼虫被称为预蛹，这个时期的幼虫头部几丁质化，一般不再进食。亮斑扁角水虻以幼虫越冬，低温下幼虫进入静止期，亮斑扁角水虻幼虫在恒温(28℃左右)下可以快速生长，孵化后12d幼虫体长可达17mm，孵化后21天可以完成幼虫生长阶段。

亮斑扁角水虻幼虫在自然界以腐烂的有机物和动物粪便为食，如发酸的番荔枝、南瓜、死亡的螃蟹、腐烂的水果和动物尸体等。研究发现，亮斑扁角水虻幼虫集中取食动物粪便，不仅可以减少粪便堆积造成的污染，消除粪便产生的臭气，还能够控制家蝇的滋生，并减少粪便中大肠杆菌的数量。亮斑扁角水虻幼虫可用于处理咖啡加工的废弃物、鸡粪、牛粪、鸡粪，取得良好的效果。亮斑扁角水虻幼虫含有大量蛋白和脂肪，还能够用于生产较高经济价值的动物饲料。

2、畜禽粪便

随着农业结构的调整，新型的集约化养殖正在逐步替代传统散户养殖，造成了畜禽粪便的排放量越来越大，据统计，我国目前畜禽粪便的排放量已高达45亿吨，成为了十分突出的环境污染，因此，畜禽粪便的无害化处理受到密切关注。传统的畜禽粪便的处理方法主要有物理法、化学法和生物法三大类。物理法和化学法处理耗时耗能，处理效果差，并会造成环境的二次污染；生物法处理有厌气池、好气氧气池与堆肥等几种方法，具有成本低、发酵产物活性强等特点，但是，普通的的生物法存在转化周期长、产品不能高值化等问题。

3.昆虫肠道微生物

昆虫肠道中栖息着大量的微生物，微生物对其寄主具有重要的影响和作用。早期对昆虫-微生物的研究主要集中在昆虫病原微生物及其应用方面。现在随着昆虫微生物学、微生态学的进展，昆虫与微生物的互惠共生关系研究越来越突出，这种非致病关系包括了互利关系，某些微生物是寄主生长、繁殖所必需的(Ben-yosef et al.,2008；Bright and Bulgheresi,2010；Drew et al.,1983)。研究较为详细的主要是白蚁这一社会性昆虫，还有沙漠蝗等农业害虫。一些昆虫在木质纤维素能源利用方面做出了突出贡献，高活力的纤维素酶和半纤维素酶等都来自于昆虫(张来丽,2011)。肠道微生物对昆虫的作用主要是参与代谢，提供营养物质，帮助寄主抵抗外援病原侵入，激起寄主免疫功能等(相辉and黄勇平,2008)。Jeon等(2011)利用16s rDNA测序分析了取食三种不同食物的水虻幼虫肠道中的微生物种群，微生物种类因食物而有所不同，但都归属于四大类群，并分离培养到了产淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶菌株，推测水虻对有机物的降解可能与微生物相关。但是他们的研究没有给出有关废物降解中水虻与微生物关系的直接证据或数据。水虻肠道中含有很高淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性，为它高效降解废弃物提供基础，水虻应归属杂食性动物，水虻肠道中多种酶活力显著高于家蝇，这也可能是水虻利用废弃物效率比其他昆虫更高的原因(Kim et al.,2011)。但此结果来自于整个肠道酶活分析，未能将微生物在其中扮演的角色分离开来。

目前，水虻作为一种利用多种有机废弃物的资源昆虫，联合国粮农组织将水虻在未来作为人类食物和动物饲料最具前景的昆虫，放在研究与开发的第一位。微生物与水虻生长的影响的研究与开发还处于起步阶段，具有重要的开发价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂，促进水虻生长和转化畜禽粪便。

本发明的另一个目的在于提供了一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂的应用，包括促进亮斑扁角水虻幼虫的生长，促进鸡粪转化，本发明提供的菌剂可以充分解决当前集约化养殖场粪便积累造成的环境污染问题，同时变废为宝，转化成为高质量的动物蛋白替代品。

本发明还有一个目的在于提供了枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BSF-CL，该菌已于2014年5月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名：Bacillus subtilis BSF-CL，保藏编号：CCTCC NO：M 2014222，地址：中国武汉武汉大学。

本发明最后一个目的在于提供了枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BSF-CL的应用，包括利用该菌促进亮斑扁角水虻幼虫的生长，提高水虻幼虫存活率，促进粪便转化等。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人从水虻卵表和肠道分离4株细菌，四株菌的保藏信息及生理生化特性具体如下：

考克氏菌：分类命名：考克氏菌(Kocuria marina)FE01，保藏编号：CCTCC NO：M2015558；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落呈黄色，菌落形态为边缘整齐，凸起，湿润，无褶皱，大小中等。革兰氏阳性球菌，28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝1.60)、纤维素酶(Up＝2.00)和淀粉酶(Up＝2.50)水解活性。

耐硼赖氨酸芽胞杆菌：分类命名：Lysinibacillus boronitolerans FE04，保藏编号：CCTCCNO：M 2015559；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落呈白色，菌落形态为边缘整齐，凸起，较湿润，无褶皱，大小中等。革兰氏阳性短杆状，28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝1.45)、纤维素酶(Up＝1.70)和淀粉酶(Up＝2.30)水解活性。

奇异变形杆菌：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08，保藏编号：CCTCC NO：M2015560；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上呈明显的多形性，有球形和丝状形，在LB固体培养基上呈扩散生长，形成迁徒生长现象，菌苔表面湿润。革兰氏阳性。28℃培养，需氧菌。

枯草芽胞杆菌：分类命名：Bacillus subtilis BSF-CL，保藏编号：CCTCC NO：M 2014222。已于2014年5月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落表面粗糙不透明，微黄色，在LB液体培养基中生长时，常形成皱醭。28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝2.18)、纤维素酶(Up＝1.19)和淀粉酶(Up＝5.38)水解活性。

一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂，包括：考克氏菌(Kocuria marina)FE01，Lysinibacillus boronitolerans FE04，奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08和Bacillus subtilisBSF-CL。

以上所述的复合菌剂，各菌剂的配比优选为：考克氏菌(Kocuria marina)FE01：Lysinibacillus boronitolerans FE04：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08：Bacillus subtilisBSF-CL＝0.5～5：0.5～5:0.5～5:0.5～5。所述各菌的有效浓度相同。

以上所述的复合菌剂，各菌剂的配比优选为：考克氏菌(Kocuria marina)FE01：Lysinibacillus boronitolerans FE04：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08：Bacillus subtilisBSF-CL＝1～4：1～4:1～4:1～4。

以上所述的复合菌剂，各菌剂的最佳配比为：考克氏菌(Kocuria marina)FE01：Lysinibacillus boronitolerans FE04：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08：Bacillus subtilisBSF-CL＝4：1:1:1。

一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂的应用，应用过程包括将该菌剂添加进混合有水虻与粪便的混合物中即可。

枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis BSF-CL的应用，应用过程包括将该菌添加进混合有水虻与粪便的混合物中即可。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.水虻来源的共生细菌用于水虻转化鸡粪过程中促进水虻生长，安全环保。

2.首次采用水虻来源的共生细菌复配用于水虻转化鸡粪过程中促进水虻生长。

3.复配的水虻来源的共生细菌对水虻的促生长作用是目前世界上最高的(比不加菌的水虻鸡粪转化体系的水虻增重提高达28.57％)，在大规模水虻转化鸡粪中，可以显著提高经济效益，具有重大经济价值。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。本发明实施例中所用水虻为水虻为亮斑扁角水虻武汉品系(Hermitiaillucens strain Wuhan)。

实施例1：

菌株的获得：

申请人从水虻卵表和肠道分离4株细菌，四株菌的保藏信息及生理生化特性具体如下：

考克氏菌(本发明或称FE01)：分类命名：考克氏菌(Kocuria marina)FE01，保藏编号：CCTCC NO：M 2015558；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落呈黄色，菌落形态为边缘整齐，凸起，湿润，无褶皱，大小中等。革兰氏阳性球菌，28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝1.60)、纤维素酶(Up＝2.00)和淀粉酶(Up＝2.50)水解活性。

耐硼赖氨酸芽胞杆菌(本发明或称FE04)：分类命名：Lysinibacillus boronitolerans FE04，保藏编号：CCTCC NO：M 2015559；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落呈白色，菌落形态为边缘整齐，凸起，较湿润，无褶皱，大小中等。革兰氏阳性短杆状，28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝1.45)、纤维素酶(Up＝1.70)和淀粉酶(Up＝2.30)水解活性。

奇异变形杆菌(本发明或称FE08)：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)FE08，保藏编号：CCTCC NO：M 2015560；已于2015年9月18日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上呈明显的多形性，有球形和丝状形，在固体培养基上呈扩散生长，形成迁徒生长现象，菌苔表面湿润。革兰氏阳性。28℃培养，需氧菌。

枯草芽胞杆菌(本发明或称BSF-CL)：分类命名：Bacillus subtilis BSF-CL，保藏编号：CCTCCNO：M 2014222。已于2014年5月23日送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国武汉武汉大学。生理生化特性：在LB培养基上菌落表面粗糙不透明，微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。28℃培养，需氧菌。具有蛋白酶(Up＝2.18)、纤维素酶(Up＝1.19)和淀粉酶(Up＝5.38)水解活性。

菌株的鉴定

FE01、FE04、FE08和BSF-CL通过16SrDNA片段序列同源性分析初步进行了分类鉴定，鉴定结果如表1所示。

表1菌株鉴定结果

实施例2：

FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株的发酵方法：

FE01：LB液体培养基，接种量为1％，180r/min，28℃摇瓶发酵24h。

FE04：LB液体培养基，接种量为1％，180r/min，28℃摇瓶发酵24h。

FE08：LB液体培养基，接种量为1％，180r/min，28℃摇瓶发酵24h。

BSF-CL：LB液体培养基，接种量为1％，180r/min，28℃摇瓶发酵24h。

实施例2：

FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株发酵液的应用：

在PA瓶中接入10ml LB液体培养基。用无菌接种环分别挑取FE01、FE04、FE08和BSF-CL单菌落，分别接种到PA瓶中，28℃摇瓶发酵24h。利用无菌水将发酵液的浓度调整到1×10⁸个/ml，将稀释好的菌液与鸡粪进行配比，具体见下表。

将基质搅拌均匀后，同时在不同处理组中接入500头大小相近，健康的6日龄亮斑扁角水虻幼虫，每个处理设置3个重复。

当水虻50％预蛹后，将水虻与基质分离，50℃烘干后统计总的虫体干重以及剩余基质干重。实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计。

水虻存活率(％)＝转化后水虻数量/转化前加入的水虻数量×100％

虫体增重率(％)＝(转化后实验组水虻干重-转化后对照组组水虻干重)/转化后对照组水虻干重

水虻转化率(％)＝(转化后水虻干重-转化前水虻干重)/转化前鸡粪干重×100％

鸡粪减少率(％)＝(转化前鸡粪干重-转化后鸡粪干重)/转化前鸡粪干重×100％

1.FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株发酵液在鸡粪中对水虻的促生长作用，见表2：

表2添加单株微生物对水虻存活率和转化周期的影响

注：使用SPSS v19.0，平均值后相同字母表示没有显著性，不同字母表示有显著性(P＝0.05)，下同

¹从水虻幼虫转化鸡粪开始50％形成预蛹所需要的时间(d)，下同，实验重复两次。

从表2可以看出，两次重复中，与空白对照组相比，不同处理组中水虻幼虫的存活率均有显著提高，添加FE01可提高存活率3.4％-3.47％，添加FE04可提高存活率4.13％-4.93％，添加FE08可提高存活率5.2％-5.33％，添加BSF-CL可提高存活率5.40-5.60％，说明微生物能够提高水虻幼虫存活率。从微生物对水虻转化鸡粪周期的影响来看，FE01菌株可使转化周期缩短2天，其他菌株对鸡粪转化周期基本没有影响。但从整体观察，并且考虑到人为误差，添加微生物并不影响水虻幼虫的转化周期。

2.FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株发酵液对水虻转化率和增重率的影响，见表3：

表3添加单株微生物对水虻转化率和增重率的影响

从表3可以看出，两次重复实验微生物对水虻转化率和增重率影响趋势相同，与空白对照组相比，添加单株微生物对水虻的转化率的影响区别很大。添加FE01，FE08，BSF-CL可显著增加水虻幼虫的重量。添加FE08的实验组幼虫增重率最高达18.6％，添加BSF-CL的实验组增重率最高达18.23％；FE04组两次重复实验显示，与对照比，一次转化率和增重率略有下降，另一次转化率和增重率略有上升。

3.FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株发酵液对鸡粪减少率的影响，表4

表4添加单株微生物对鸡粪减少率的影响

从表4可以看出，两次重复实验结果的趋势相似，与空白对照组相比，不同的微生物对鸡粪减少率的影响差别比较大，FE01、FE04、FE08和BSF-CL可以显著增加鸡粪的减少率。

因此，FE01、FE04、FE08和BSF-CL单个菌株发酵液均能提高水虻的存活率，促进水虻转化和增重，同时促进鸡粪转化。其中BSF-CL菌株的效果为最佳。

实施例3：

一种促进亮斑扁角水虻幼虫生长的复合菌剂，包括FE01、FE04、FE08和BSF-CL。

本实施例制备了9组复合菌剂，具体配方如下(V/V)：

将FE01、FE04、FE08和BSF-CL发酵液的浓度都调整到1×10⁸个/ml，设置9个复配组合，复配比例如下：

组1：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:1:1:1

组2：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝2:1:1:1

组3：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝4:1:1:1

组4：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:2:1:1

组5：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:4:1:1

组6：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:1:2:1

组7：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:1:4:1

组8：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:1:1:2

组9：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝1:1:1:4

用于以下实施例。

实施例4：

复合菌剂的应用，其应用过程是：

空白对照为500g灭菌基质；处理组为500g灭菌基质并添加1ml实施例3制备的复合菌剂，共九个处理组。

表5不同比例复配菌剂对水虻的促生促转化作用

将基质搅拌均匀后，同时在不同处理组中接入500头大小相近，健康的6日龄亮斑扁角水虻幼虫，每个处理设置3个重复。

当水虻50％预蛹后，将水虻与基质分离，50℃烘干后统计总的虫体干重以及剩余基质干重。实验结果采用SPSS18.0统计分析软件统计。结果见表5。

水虻存活率(％)＝转化后水虻数量/转化前加入的水虻数量×100％

虫体增重率(％)＝(转化后实验组水虻干重-转化后对照组组水虻干重)/转化后对照组水虻干重

水虻转化率(％)＝(转化后水虻干重-转化前水虻干重)/转化前鸡粪干重×100％

鸡粪减少率(％)＝(转化前鸡粪干重-转化后鸡粪干重)/转化前鸡粪干重×100％。

复合菌剂对亮斑扁角水虻幼虫的生长和转化均具有促进作用，在亮斑扁角水虻幼虫处理鸡粪体系中加入复合菌剂，利用复合菌剂与水虻幼虫联合转化鸡粪。

由表5结果可以看出，复配菌剂的最佳比例为：FE01：FE04：FE08：BSF-CL＝4:1:1:1，比不加菌的水虻鸡粪转化体系的水虻增重提高达28.57％，能获得更多的水虻幼虫生物量。