基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法

摘要

本发明公开了一种基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法，首先设计一个环形光阑，然后基于部分相干成像方法，引入弱物体近似，利用环形光阑以及明场显微镜的参数计算出弱物体光学传递函数WOTF，最后利用相机采集三幅强度图像并通过反卷积求解光强传输方程得到定量相位图。本发明可有效解决云雾状低频噪声与高频模糊难以兼顾的矛盾，大大提高了重构相位的空间分辨率，使其达到明场显微镜两倍物镜数值孔径的分辨率，且对低频噪声具有较好的鲁棒性。而且无需对传统明场显微镜进行复杂的改造，可赋予明场显微镜高分辨率定量相位成像的能力。

说明书

技术领域

本发明属于光学测量、成像技术，特别是一种基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法。

背景技术

相位恢复是光学测量与成像的一个重要技术，无论在生物医学还是工业检测领域，相位成像技术都在发挥着重要的作用。纵观光学测量技术近半个世纪的进展，最经典的相位测量方法为非干涉测量方法。然而，干涉测量法的缺点也十分明显：(1)干涉测量一般需要高度相干性的光源(如激光)，从而需要较为复杂的干涉装置；(2)额外的参考光路的引入导致对于测量环境的要求变得十分苛刻；(3)高相干性的光源引入的相干散斑噪声限制了成像系统的空间分辨率与测量精度。

不同于干涉测量方法，另一类非常重要的相位测量技术并不需要借助干涉，它们统称为相位恢复。由于直接测量光波场的相位分布非常困难，而测量光波场的振幅/强度十分容易。因此，可以将利用强度分布来恢复(估算)相位这一过程视为一个数学上的“逆问题”，即相位恢复问题。相位恢复的方法还可细分为迭代法与直接法。基于光强传输方程的相位恢复是一种较为典型的直接相位恢复方法。光强传输方程是一个二阶椭圆偏微分方程，阐明了沿着光轴方向上光强度的变化量与垂直于光轴的平面上光波相位的定量关系。在已知光强轴向微分和聚焦面光强分布的情况下，通过数值求解光强传输方程可直接获取相位信息。相比与干涉法与迭代相位恢复法，其主要优点包括：(1)非干涉，仅仅通过测量物面光强直接求解相位信息，不需要引入额外参考光；(2)非迭代，通过直接求解微分方程获得相位；(3)可以很好的应用于白光照明，如传统明场显微镜中的科勒照明(illumination)；(4)无需相位解包裹，直接获取相位的绝对分布，不存在一般干涉测量方法中的2π相位包裹问题；(5)无须复杂的光学系统，对于实验环境没有苛刻的要求，振动不敏感。

求解光强传输方程最主要的问题就是得到在聚焦面处光强的轴向微分，该轴向微分可通过光强的数值有限差分获得。而如何选择适当的离焦距离来求取光强的轴向微分，这其中存在一个噪声与分辨率的权衡问题。研究表明，当离焦距离过小或过大时，最后重构的相位图像中会出现较多的云雾状低频噪声或高频信息丢失非常严重。为了解决这个问题，许多研究者提出多平面(>2)的强度测量方法对轴向微分进行估计。为了更方便地分析基于光强传输方程的相位重构方法，研究者引入了相衬传递函数(CTF)(文献[1]E.D.Barone-Nugent,A.Barty,K.A.Nugent,“Quantitative phase-amplitude microscopy I:optical microscopy,”Journal of Microscopy 206,194-203(2002).文献[2]T.E.Gureyev,A.Pogany,D.M.Paganin,S.W.Wilkins,“Linear algorithms for phase retrieval in the Fresnel region，”Optics Communications 231,53-70(2004).)。以上研究表明，在小离焦情况下，随着空间频率的减小，相衬传递函数迅速地减小到0，这也就解释了基于光强传输方程的相位重构方法对低频噪声的高敏感性。在大离焦的情况下，较高空间频率区域的光强传输方程传递函数响应与相干情况下的CTF差值变大，这就导致了最终的重构相位高频信息丢失严重，细小特征模糊。

下面对光强传输方程进行较为详细的背景介绍。

考虑一个沿着z轴传播的单色相干近轴光波场，其复振幅U(x)为其中j是虚数单位，φ(x)为所要恢复的相位分布。光强传输方程可以表示为

其中表示横向梯度算子，·表示点乘算子。表示光强的轴向微分，该轴向微分可通过有限差分近似获得。一般情况下通过引入辅助函数方程可以被转化成以下的泊松方程：

通过求解第一个泊松方程，可以解得辅助函数ψ(x)，再通过求解第二个泊松方程即可求得待测物体的定量相位。对于观察样品为未染色的细胞和生物组织来说，其光强沿横向变化很小，光强传输方程可以被简化为一个泊松方程：

至此，以上两步泊松方程的解法可总结为傅里叶空间中的逆拉普拉斯算子(1/πλ|u|²)。该算子可以看作是光强传输方程的响应或传递函数，而逆拉普拉斯算子不管是低频还是高频响应都非常差，这就影响了重构相位的信噪比以及可达到的最大成像分辨率。因此，这其中就存在低频噪声与高频模糊两个主要问题。为了解决这个问题，许多研究者提出多平面(>＝2)的强度测量来估计轴向微分(文献[3]M.Beleggia,M.A.Schofield,V.V.Volkov,Y.Zhu,“On>

此外，光强传输方程的局限是仅仅给出了拍摄强度图像的相位，而不是真实物体的相位，这是因为在方程中并没有包含成像系统的参数。通过使相干CTF推广到部分相干下的弱物体光学传递函数(WOTF)，光强传输方程的应用范围扩展到了部分相干领域。通过引入包含成像系统参数的弱物体光学传递函数，光强传输方程实现了在部分相干情况下物体的相位恢复。虽然部分相干照明有益于提高定量相位成像的分辨率，但是其相位重构的好坏主要还是依赖于WOTF的形式。在传统的部分相干成像中，可以通过提升圆形照明光的数值孔径来增大WOTF的截止频率，以达到提高成像分辨率的目的。如图2(a)至图2(d)，传统圆形光照明时随着相干系数s(s为照明数值孔径与物镜数值孔径的比值)的变大，WOTF的截止频率也随之变大。但当照明数值孔径接近于物镜数值孔径时，WOTF在各空间频率的响应变差，导致强度图像对比度逐渐减，也就无法实现准确的相位重构。因此，传统方法利用圆形光源照明中存在低频云雾状噪声与高频模糊难以同时兼顾的矛盾，其相位重构的准确性差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法，可有效解决云雾状低频噪声与高频模糊难以兼顾的矛盾，大大提高了重构相位的空间分辨率，且对噪声具有较好的鲁棒性。

实现本发明目的的技术解决方案为：一种基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法，首先设计一个环形光阑，然后基于部分相干成像方法，引入弱物体近似，利用环形光阑以及明场显微镜的参数计算出弱物体光学传递函数WOTF，最后利用相机采集三幅强度图像并通过反卷积求解光强传输方程得到定量相位图。

本发明与现有技术相比，其显著优点：(1)能显著提高成像空间截止频率到相干成像系统衍射极限的2倍，从而提高相位重构的空间分辨率，而且额外的高频部分有利于相位细节的恢复。(2)能使相位对比度提高2倍以上，使低频和高频的成分显著提高，由此解决低频噪声与高频模糊的矛盾，且对低频噪声具有较好的鲁棒性。(3)无需对传统明场显微镜进行复杂的改造，即可赋予其高分辨率定量相位成像的能力。

下面结合附图对本发明作进一步详细描述。

附图说明

图1是本发明基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法步骤流程示意图。

图2是传统圆形光照明时不同相干系数s和不同离焦距离下WOTF(虚部)的响应曲线。(a)s＝0.1；(b)s＝0.4；(c)s＝0.75；(d)s＝0.99。

图3(a)是所拍摄的微透镜阵列的全息图。

图3(b)是数字全息重构得到的相位图。

图3(c)是基于本发明方法恢复得到的相位图。

图3(d)是相位横截面对比，分别对应图3(b)和图3(c)中的标线区域。

图4是对颊上皮细胞样品进行了定量相位成像的实验结果示意图。图4(a)是本发明重构出的定量相位图；图4(b)是颊上皮细胞样品厚度的伪彩色三维显示图。图4(c)～(e)是图4(a)中所选三个区域的局部放大图。图4(f)是图4(e)中箭头所标出的截面相位曲线图。

图5是对BMSC人体骨髓基质细胞样品进行定量相位成像的实验结果示意图。图5(a1)是相干系数为1的环形光照明下离焦距离为0.5μm沿光轴方向采集3幅光强图像后恢复的相位图；图5(b1)～(e1)分别是相干系数为0.22、0.44、0.78、0.99的圆形光照明下离焦距离为0.5μm沿光轴方向采集3幅光强图像后恢复的相位图；图5(a2)～(e2)分别是图5(a1)中对应区域的局部放大图；图5(a3)～(e3)分别是图5(a2)～(e2)中箭头所标出的截面的相位曲线图。

图6是环形光阑的结构示意图。

具体实施方式

结合图1，本发明基于光强传输方程的环形光照明高分辨率定量相位显微成像方法，具体实施步骤如下：

步骤一，设计一个环形光阑。该环形光阑可由3D打印机打印，也可以通过玻璃或金属材料黑色阳极电镀工艺制成(与传统相差板加工工艺相同)，还可以由可编程LED或LCD编码实现。所设计的环形光阑主要有两个参数：一个是环形光阑的外径r，另一个是圆环宽度△s。该环形光阑的环形区域透光，中心为黑色不透光区域，该中心黑色不透光区域具有较高的遮光率并且整个环形光阑具有良好的热稳定性，环形光阑的外径r等于明场显微镜的物镜光瞳半径，如图6所示。考虑到圆环宽度△s对透光强弱的影响，一般取外径r的5％～15％，本发明举例时选取10％(即△s＝10％r)，将该环形光阑放置在明场显微镜的聚光镜孔径光阑处，并将伯特兰透镜放入明场显微镜的目镜观察筒的筒镜中，通过目镜观察物镜后焦面以确保环形光阑内切于物镜光曈。

步骤二，基于部分相干成像的(方法)原理，引入弱物体近似，利用环形光阑以及明场显微镜的参数计算出弱物体光学传递函数(WOTF)，即弱物体光学传递函数的公式为：

其中，u和u'是傅里叶空间的二维坐标，k是波数，λ是明场显微镜的照明光波长，S(u)表示环形光阑平面光源的光强分布，|P(u)|表示明场显微镜的物镜光曈函数，Δz表示明场显微镜沿光轴的离焦距离，WOTF为求出的弱物体光学传递函数。其中该传递函数的虚部为弱物体的相位传递函数。

所设计的环形光阑的数学表达式为：

其中，为频率坐标，该频率坐标被归一化到相干衍射极限(NA_obj/λ，NA_obj表示物镜数值孔径，λ表示系统照明光波长)，s₁和s₂分别表示环形光阑内圈和外圈的数值孔径(根据所设计的光阑s₂＝1，s₁＝90％)，表示环形光阑平面光源的光强分布，表示明场显微镜的物镜光曈函数。根据明场显微镜的照明波长λ以及离焦距离Δz(这里可以对Δz选取不同的值，但该量不宜过大，一般取2μm以内)代入弱物体光学传递函数公式(1)中，计算出在特定离焦距离和照明波长下该环形光阑的弱物体光学传递函数。

步骤三，利用相机沿光轴拍摄三幅强度图像，并通过反卷积求解光强传输方程得到定量相位图，具体步骤如下：

第一步，通过手动调焦或电控离焦控制相机同步采集欠焦、聚焦、过焦三幅光强图像，分别记作I_△z(x)，I₀(x)与I_-Δz(x)，它们的离焦距离分别是Δz，0，-Δz。

第二步，对三幅光强图像进行傅里叶变换，分别记作与将以及步骤二中计算得出的弱物体光学传递函数(WOTF)代入方程(4)中，通过反卷积求出相位的傅里叶变换

第三步，对进行逆傅里叶变换即可求得定量相位φ(x),从而实现了高分辨率定量相位的显微成像。

综合以上步骤可知，本发明通过设计一个环形光阑，并求得由环形光阑以及明场显微镜参数决定的弱物体光学传递函数，从而使得传递函数各频率的响应显著提高。由于最终重构相位中的低频和高频成分增多，其可有效的解决传统圆形照明时低频云雾状噪声与高频模糊难以兼顾的矛盾。与此同时，由于使用高数值孔径的环形照明，这就增大明场显微镜的截止频率，其可显著提高明场显微镜的成像分辨率。此外，本方法无需对传统明场显微镜进行复杂的改造，可赋予明场显微镜高分辨率定量相位成像的能力。

下面给出本发明在微光学元件上的实验结果。样品是一间距为300μm的平凸石英微透镜阵列(MLA300-7AR,Thorlabs)。实验中，光强轴向微分信号是通过两幅±1μm距离的过焦与欠焦光强分布采用中心有限差分得到的。图3(a)给出了所拍摄的微透镜阵列的全息图。图3(c)给出了本发明重构出的定量相位。注意尽管相位的范围已经超过了2π，光强传输方程仍可以直接恢复出绝对相位且不需要相位解包裹。为了验证本发明方法的准确性，将结果与数字全息显微镜成像结果进行对比(λ＝632.8nm，60x，NA＝0.85)，如图3(b)所示。本发明还从两者结果中选取了一条截面曲线进行定量比较，如图3(d)所示。两条曲线符合的很好，误差有可能是由于噪声的影响以及数字全息重构中定义最佳聚焦面的不准确性。

本发明对颊上皮细胞样品进行了定量相位成像，使用的油浸显微物镜(UPLSAPO 100X,Olympus)放大率为100倍，数值孔径为1.4，照明光的中心波长为550nm。如图4所示，图4(a)是本发明重构出的定量相位图。图4(b)是颊上皮细胞样品厚度的伪彩色三维显示图。图4(c)～(e)是图4(a)中所选三个区域的局部放大图。图4(f)是图4(e)中箭头所标出的截面相位曲线图。从图4(f)可以看出，最小可分辨的球形结构间距为208nm(相当于2.66的有效数值孔径)，这意味着在定量相位成像中横向分辨率至少可达到208nm。从实验结果可以看出，由本发明恢复的相位在重建分辨率上得到了很大的提升(达到2倍物镜数值孔径的分辨率)。

此外，本发明还选取了BMSC人体骨髓基质细胞样品进行了定量相位成像，使用的显微物镜(UPLSAPO 40X,Olympus)放大率为40倍，数值孔径为0.9，照明光的中心波长为550nm。如图5所示，图5(a1)是相干系数为1的环形光照明下离焦距离为0.5μm沿光轴方向采集3幅光强图像后恢复的相位图。图5(b1)～(e1)分别是相干系数为0.22、0.44、0.78、0.99的圆形照明下离焦距离为0.5μm沿光轴方向采集3幅光强图像后恢复的相位图。图5(a2)～(e2)分别是图5(a1)中对应区域的局部放大图。图5(a3)～(e3)分别是图5(a2)～(e2)中箭头所指截面的相位曲线图。对比这五个不同照明模式下恢复的相位图结果可以看出使用环形光照明恢复出的相位比任一种圆形光照明的结果都好。本发明重构的相位图背景更均匀，在去除低频噪声的基础下，高频细节得到最大程度的保留。由此证明本发明能够有效的解决低频云雾噪声与高频模糊难以兼顾的矛盾，对低频噪声具有较好的鲁棒性。