一种人血清中非Gal异种抗体检测方法

摘要

本发明公开了一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测，所述方法包括：按照10

说明书

技术领域

本发明涉及异种器官移植技术领域，尤其涉及一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测。

背景技术

器官短缺是制约临床大规模开展器官移植手术的重要瓶颈。使用猪的器官作为替代，是解决这一难题的潜在方案[1]。包括人在内的灵长类动物的血清中存在针对猪蛋白的天然抗体，可以识别猪细胞上的异种抗原，介导了对异种移植物的排斥，引发超急性排斥反应。人血清中识别猪抗原的异种抗体主要目标是αGal，人体内循环的IgG中约1％是抗αGal抗原的。GTKO猪的出现缓解了由αGal引发的超急性排斥反应，延长了移植物的存活时间。

敲除αGal抗原并不能完全避免超急性排斥，原因之一是还存在其它的异种抗原能够被灵长类动物血清中的天然异种抗体所识别，例如Neu5GC和Sd^a抗原。因此，检测移植受体内抗非Gal抗原抗体的水平是非常重要的，可能会影响异种器官的存活时间。已有的异种移植研究中，利用猪的外周血单核细胞(Peripheral>

发明内容

本发明提供一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性。

一种人血清中非Gal异种抗体检测方法，用于猪器官移植到人体的异种器官移植中受体人中抗供体猪非Gal抗原的抗体的检测，上述方法包括：按照10⁵个细胞与100μL人血清的比例，使αGal敲除的基因敲除猪的外周血单核细胞与人血清混合孵育3小时检测IgM，孵育6小时检测IgG。

进一步地，上述αGal敲除的基因敲除猪是GGTA1敲除的基因敲除猪。

进一步地，上述αGal敲除的基因敲除猪是GGTA1敲除的五指山猪。

进一步地，上述人血清是混合的健康人血清。使用混合的健康人血清，能够消除由个别血清带来的检测结果的偶然性。

进一步地，上述孵育在4℃下进行。

进一步地，上述孵育后，使用异种血清封闭，然后使用抗人的荧光标记的抗体孵育，再使用流式细胞仪检测外周血单核细胞上结合的IgM和/或IgG的水平。

进一步地，上述异种血清是灭活的山羊血清。

进一步地，上述抗人的荧光标记的抗体是异硫氰酸荧光素标记的山羊抗人IgG或IgM。

进一步地，上述使用异种血清封闭是在4℃封闭20分钟。

进一步地，上述使用抗人的荧光标记的抗体孵育是在4℃避光孵育30分钟。

本发明的人血清中非Gal异种抗体检测方法，提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性，有助于筛选非Gal表达抗原低表达的供体猪。

附图说明

图1猪Gal表型鉴定A植物凝集素(BSI-B4)对猪全血的凝集反应，左图为野生型，右图为GTKO型；B流式细胞仪检测植物凝集素对野生型PBMC的结合；C流式细胞仪检测植物凝集素对GTKO型PBMC的结合。

图2不同孵育时间对非Gal异种抗体IgM/IgG结合的影响。在5μL(A)、20μL(C)和100μL(E)血清条件下，不同孵育时间对IgM抗体结合的影响。5μL(B)、20μL(D)和100μL(F)血清条件下，不同孵育时间对IgG抗体结合的影响。ns，无显著性差异，**，p<0.01。

图3针对非Gal抗原的IgM异种抗体结合水平对血清浓度的依赖。在0.5小时(A)、1小时(B)和3小时(C)的孵育时间下，血清浓度变化对IgM结合的影响。ns，无显著性差异，*，p<0.05，**，p<0.01，***，p<0.001，****，p<0.0001。

图4不同浓度血清对IgG异种抗体结合的影响不显著。在0.5小时(A)、1小时(B)和3小时(C)的孵育时间下，血清浓度对IgG抗体结合的影响。*，p<0.05，ns,无显著性差异。

图5孵育时间和血清浓度对细胞存活的影响。ns,无显著性差异。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。

抗原抗体的结合是分子表面的非共价键结合。我们在前期实验中发现血清浓度和孵育时间可能影响非Gal抗原和人异种抗体的结合水平；另外，移植前免疫排斥反应检测的高灵敏性和准确性将有助于临床方案的制定。针对我们前期的实验发现和移植前非Gal抗原引起的免疫排斥反应检测的重要性，本发明选用GTKO的PBMC作为靶细胞，采集20个健康成年人的血清等量混合，在不同孵育时间和血清浓度的条件下，应用流式细胞术检测IgM和IgG抗体的结合水平，探讨血清浓度和孵育时间对非Gal抗原结合人异种抗体的影响，以提高流式检测非Gal抗原结合人异种抗体的灵敏性、准确性和可重复性。

1材料与方法

1.1材料

野生型、GGTA1敲除的五指山猪来自中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，利用EDTA抗凝管从猪的腹主动脉采集血液，并分离外周血单核细胞(PBMC)；羊血清(Goat Serum，货号G9023)和植物凝集素(BSI-B4，货号L2895)购自于美国sigma-aldrich公司；异硫氰酸荧光素标记山羊抗人免疫球蛋白G(FITC-Goat Anti-Human IgG，Gamma)货号62-8411和异硫氰酸荧光素标记山羊抗人免疫球蛋白M(GOXHUIgMFITC AFFINITY XADS货号A18842)均购自于美国ThermoFisher公司；牛血清白蛋白(BSA)购自于美国Amresco公司，货号9048-46-8；碘化丙啶染液(Propidium Iodide Staining Solution)购自于美国BD公司，货号556463；20位健康人血清合并液由本实验室收集冻存，包括ABO各个血型。

1.2猪外周血单核细胞的分离

猪血用PBS按体积比1:2稀释混匀，加至Ficoll-Paque^TMPLUS上，密度梯度离心，室温下以1500rpm离心30分钟，离心结束后吸取PBMC。

1.3利用猪全血检查Gal基因型

采集猪全血，PBS稀释10倍，混匀，滴入BSI-B4凝集素，5-10分钟后观察血型凝集反应。

1.4血清补体灭活

人和山羊血清在56℃水浴锅内孵育30分钟，以灭活补体，1800rpm离心5分钟，收集上清备用。

1.5人血清抗体与猪外周血单核细胞(PBMC)表面抗原孵育

每个猪外周血单核细胞(PBMC)样本为1x10⁵，体积为100μL，加入相应量的灭活人血清(5μL、20μL和100μL全血清)，混匀，4℃下内孵育不同时间(0.5h、1h、2h、3h和6h)，加入3mLFACS缓冲溶液(PBS，1％牛血清白蛋白，0.01％叠氮钠，pH7.2)，700g离心5min，100μLFACS缓冲溶液重悬细胞。

1.6封闭及免疫荧光染色

每个样品加入10μL灭活的山羊血清(1:10稀释)，混匀后于4℃封闭20分钟后，加入10μL异硫氰酸荧光素标记的山羊抗人IgG或IgM(1:100稀释)，混匀，4℃避光孵育30分钟，加入3mLFACS缓冲溶液，700g离心5min，去上清，100μLFACS缓冲溶液重悬细胞，10μL的碘化丙啶染液(1：25稀释)染色10分钟，流式细胞仪检测。

1.7 Gal染色

1x10⁵外周血单核细胞(PBMC)，加入10μL植物凝集素(1：32稀释)，4℃避光孵育30分钟，加入3mLFACS缓冲溶液，700g离心5min，去上清，FACS缓冲溶液重悬细胞，流式细胞仪检测。

1.8统计学方法

采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析，以P<0.05为显著差异。

2结果

2.1 α-Gal表型的鉴定

采集到新鲜猪血后，可以利用植物凝集素对于α-Gal阳性的红细胞的凝集作用初步判断猪的基因型，这一反应类似于血型的鉴定。在滴入FITC标记的BSI-B4植物凝集素后，野生型的红细胞会发生明显的凝集，而GTKO型的红细胞则不会发生凝集。(图1A)

除了利用红细胞确定α-Gal表型，FITC标记的BSI-B4分别染色野生型和GTKO型的PBMC，确保最终使用的是GTKO型的PBMC。图1B显示的是野生型的PBMC，BSI-B4可以结合到此类PBMC上。GTKO型的PBMC由于表面没有α-Gal的表达，则不能被BSI-B4结合，见图1C。

2.2孵育时间对IgM/IgG异种抗体结合的影响

在传统的5μL血清孵育条件下，延长孵育时间，不能显著的提高IgM(图2A)和IgG(图2B)的结合水平。在20μL血清浓度条件下，孵育时间的延长到3小时后，GTKO的PBMC结合的IgM抗体水平有统计学意义的上升(图2C)，而IgG则没有明显变化(图2D)。在100μL血清孵育条件下，和半小时的孵育相比，IgM的结合在3小时具有统计学意义(图2E)。而IgG的结合有所升高，但是并没有统计学差异。总之，IgM的结合相比于IgG表现出对孵育时间的敏感性。

2.3血清浓度对IgM异种抗体结合的影响

在同等孵育时间的条件下，提高孵育的血清浓度能够显著提高PBMC对人血清中IgM的结合。20μL的血清浓度比5μL条件下能够结合更多的抗体，将血清浓度提高到100μL，则能在0.5、1、2、3小时条件下相对于20μL浓度血清提高抗体结合，在6小时条件下虽然结合抗体的平均数有所提高，但是变异也更大，对比同等时间下20μL的血清浓度没有统计学差异。(图3)

2.4不同浓度血清对IgG异种抗体结合的影响

在同等孵育时间的条件下，提高孵育的血清浓度能够提高PBMC对人血清中IgG的结合，但是没有统计学差异。只有在最长的6小时条件下，100μL的血清浓度对比5μL的血清浓度具有统计学差异。(图4)

2.5孵育时间对细胞存活的影响

利用PI染色标记PBMC的存活。我们发现，提高血清的孵育时间，增加血清的孵育浓度，不会明显的改变PBMC的活性，与无血清处理组的存活率接近，为90％左右。IgM和IgG的抗体孵育没有差别。(图5)

3讨论

针对非Gal抗原，无论天然存在的抗体，还是在移植异种移植物后诱导产生的抗体都会介导对异种移植物的排斥[2,3]。因此，在进行猪到灵长类的移植手术前，有必要检测受体血清中针对供体的非Gal抗原的抗体水平，在移植后也有必要检测其非Gal抗原诱导的抗体水平。传统的检测抗体的方法，大多数是针对抗Gal抗体的。抗Gal抗体的数量相对较大，检测比较容易。根据目前的认识，未来用于异种移植的供体猪一定是在Gal抗原被敲除的背景下进行。那么如何有效的检测非Gal抗原是异种移植研究人员一定会面临的挑战。

利用PBMC筛选非Gal抗原相对低表达的供体，对于延长异种移植物的存活应该也是有益的。虽然在已有的研究结果中显示，只要给予充分的免疫抑制剂，受体血清的抗非Gal抗体是比较难于检测到的，但是我们仍然认为，如果可以选择比较低的非Gal抗原表达的供体，受体仍然有潜在的长远收益。

利用猪细胞检测血清中抗体的存在是异种移植领域内的常用方法(表1)。最常用的血清孵育时间是30分钟。2014年马里兰大学的Azimzadeh等人专门研究了针对非Gal抗原的天然和诱导抗体的结合实验[4]。在这项研究中，作者以猪主动脉血管内皮细胞为靶细胞，主要关注不同的血清浓度对结合非Gal抗原的影响。我们的研究则主要以PBMC为靶细胞，并且在关注血清浓度之外，还发现不同的孵育时间也会影响抗体对非Gal抗原的结合。虽然在固体器官移植物进入体内后，pAEC是最早受攻击的细胞，并且在抗原提呈过程中起重要作用，但是PBMC更便于在移植手术前在体外实验系统中评估供体与受体的匹配度。

目前，我们不能完全解释为什么孵育时间的增加导致抗非Gal抗体结合的增加。推测，血清中的抗体与非Gal抗原的亲和性可能低于对Gal抗原的亲和性，因此，与非Gal抗原发生结合需要更长的时间。

总之，在α-Gal抗原敲除之后，非Gal抗原的存在仍然能够被灵长类血清中的抗体所结合。延长的血清孵育时间，可以和提高血清浓度一起，增加抗体的结合。我们的实验结果证明，使用全血清孵育，检测IgM的结合孵育时间为3小时，检测IgG孵育时间为6小时。这可能是测量抗非Gal抗原的IgM和IgG与PBMC的结合最灵敏的方法，而且不会影响细胞的活力。

表1:近十年间利用猪的PBMC细胞检测人血清中IgM/IgG抗体结合实验所使用的血清浓度和孵育时间

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

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