简易快速鉴别甘草、胀果甘草和光果甘草的薄层色谱法

摘要

本发明涉及简易快速鉴别甘草、胀果甘草和光果甘草的薄层色谱法。具体的，本发明方法包括以下步骤：取甘草对照药材、胀果甘草对照药材，加甲醇或乙醇溶液制成对照药材溶液；取甘草、胀果甘草、光果甘草三种药材粗粉，加溶剂超声处理，分别制得甘草、胀果甘草、光果甘草的供试品溶液；用定量毛细管分别吸取对照药材溶液和供试品溶液适量，点样于反相薄层板；以0.1％磷酸水溶液和乙醇以一定比例为展开剂，进行展开，展开后取出，晾干；5)比较色谱图中的斑点鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草。本发明方法所得色谱图中三种来源甘草呈现显著不同的斑点。本发明鉴别方法专属性强，能够准确鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草。

说明书

技术领域

本发明属中药技术领域，具体是中药药材鉴别技术领域，具体涉及一种用于简易、快速地鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草的反相薄层色谱方法。

背景技术

甘草为常用中药，始载于《神农本草经》，列为上品。具有补脾益气，清热解毒，润肺止咳，缓急止痛，调和诸药的功效。甘草已成为中药配伍用量最大的中药品种。2015年版《中国药典》一部第86页收载的甘草品种中规定，甘草为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根及根茎。为便于与胀果甘草、光果甘草两种来源的甘草区分开来，根据甘草Glycyrrhiza uralensis Fish的拉丁名种加词uralensis，通常称之为乌拉尔甘草。

据高晓娟等[高晓娟，赵丹，赵建军，等.甘草的本草考证[J].中国实验方剂学杂志，2017，23(2):193-198]考证，我国历代本草记载甘草均为乌拉尔甘草(即2015年版《中国药典》一部规定的甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.)，不包括《中国药典》记载的胀果甘草(Glycyrrhiza inflate Bat.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabra L.)。

从历版《中国药典》收载情况可以看出，1963年版《中国药典》仅规定甘草的原植物来源为甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.，1977年版《中国药典》规定甘草的原植物来源增加了胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.和光果甘草Glycyrrhiza glabra L.两种植物，以后各版《中国药典》均沿用1977年版规定。

一方面，由于来源于甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.、胀果甘草Glycyrrhiza inflate Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的甘草药材所含化学成分有所不同，另一方面，历代医家仅使用甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.一种来源的甘草药材，而三种来源的甘草药材外观性状并不容易区分。

尽管从技术上讲，通过精密分析仪器例如高效液相色谱法等可以实现三种来源甘草的鉴别区分，然而目前尚未见有简单易行的方法同时实现三种来源甘草的鉴别区分。而这一现实问题亦是本领域技术人员迫切期待解决的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种反相薄层色谱法来同时鉴别三种来源的甘草、胀果甘草、光果甘草的方法，期待这种方法便于使用者鉴别甘草药材的来源和区别用药，同时期待这种方法简便、易操作，并能够准确地将三种来源的甘草区分开来。本发明人已经发现，以中国食品药品检定研究院颁发的甘草对照药材、胀果甘草对照药材为指标成分，通过溶剂展开的程序，实现甘草、胀果甘草、光果甘草的鉴别，达到准确使用药材的目的。

在本发明中，如未特别说明，提及的甘草，是指豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fish.，即人们通常所说的乌拉尔甘草。

本发明采用的技术方案是：

技术方案1.反相薄层色谱法鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)分别称取甘草对照药材、胀果甘草对照药材，加甲醇或乙醇溶液制成对照药材溶液；

2)取甘草、胀果甘草、光果甘草三种药材粗粉适量，分别置于具塞锥形瓶中，加溶剂，超声处理(例如5～60分钟)，滤过，取续滤液，分别制得甘草、胀果甘草、光果甘草的供试品溶液；

3)用定量毛细管分别吸取步骤1)制得的二种对照药材溶液和步骤2)制得的三种供试品溶液适量，依次点样于同一反相薄层板的同一水平线不同位置上；

4)以0.1％磷酸水溶液和乙醇以一定比例为展开剂，进行展开，展开后取出，晾干；

5)按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草：

于365nm波长紫外灯下检视步骤4)所得反相薄层板，并比较色谱图中的荧光斑点，以鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草；

甘草供试品和甘草对照药材在比移值Rf值0.41左右处，均有一个天蓝色的荧光斑点，在Rf值0.51左右处，均有一个黄绿色的荧光斑点；

胀果甘草供试品和胀果甘草对照药材仅在Rf值0.41左右处，均有一个天蓝色的荧光斑点；

光果甘草供试品在Rf值0.49和0.54左右处，各有一个黄绿色的荧光斑点，在Rf值0.41和0.51左右，没有斑点。

技术方案2.根据技术方案1所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中所述甲醇或乙醇溶液是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，例如是30％～100％甲醇溶液或者例如是30％～100％乙醇溶液，例如是60％～85％甲醇溶液或者例如是60％～85％乙醇溶液；

技术方案3.根据技术方案1所述的方法，步骤2)中所述药材粗粉可以是过20～100目筛的粉末；所述粗粉适量，可以是0.5～2g；

技术方案4.根据技术方案1所述的方法，步骤2)中所述溶剂是指将甲醇或乙醇与水以一定比例混合后制成的溶液，例如是30％～100％甲醇溶液或者例如是30％～100％乙醇溶液，例如是60％～85％甲醇溶液或者例如是60％～85％乙醇溶液；

技术方案5.根据技术方案1所述的方法，步骤3)中所述取对照药材溶液或供试品溶液适量，可以是1～20μl，例如5～15μl；所述反相薄层板，可以是预制反相薄层板，其是可以从市售途径得到的；

技术方案6.根据技术方案1所述的方法，步骤4)中所述0.1％磷酸水溶液和乙醇以一定比例为展开剂，0.1％磷酸水溶液和乙醇的体积比可以是3:7～7:3，例如5：3～5，例如5：4；

技术方案7.根据技术方案1所述的方法，步骤4)中所述展开，可以是一次展开或二次展开。

技术方案8.根据技术方案1所述的方法，步骤1)基本上是照如下方式操作的：

称取甘草对照药材、甘草对照药材(例如各0.5～2g)，分别置于具塞锥形瓶中，加溶液(例如30％～100％甲醇溶液，例如是60％～85％甲醇溶液，甲醇占水溶液中体积比)或乙醇溶液(例如30％～100％乙醇溶液，例如是60％～85％乙醇溶液，乙醇占水溶液中体积比)适量(例如50～200ml，例如80～180ml)，密塞，超声处理(例如功率500W，频率40kHz)例如20-40分钟例如30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液。

技术方案9.根据技术方案1所述的方法，步骤2)所述药材粗粉基本上是照如下方式制备得到的：用高速万能粉碎机对干燥的甘草、胀果甘草、光果甘草药材分别进行粉碎，过20～100目筛得药材粉末，为粗粉。

技术方案10.根据技术方案1所述的方法，步骤2)所述三种供试品溶液基本上是照如下方式制备得到的：分别称取甘草、胀果甘草、光果甘草粉末0.5～2g，分别置于具塞锥形瓶中，加30％～100％(例如60％～85％)甲醇(甲醇占水溶液中体积比)或30％～100％(例如60％～85％)乙醇(乙醇占水溶液中体积比)适量(例如50～200ml，例如80～180ml)，密塞，超声处理(功率500W，频率40kHz)5～60分钟例如20-40分钟例如30分钟，放冷，滤过，取续滤液，分别制得甘草、胀果甘草、光果甘草供试品溶液。

技术方案11.根据技术方案1所述的方法，步骤4)所述展开是在双槽薄层色谱展开缸中进行的。

技术方案12.根据技术方案1所述的方法，步骤4)所述展开基本上是照如下步骤a)和步骤b)的方式进行的：

a)取0.1％磷酸水溶液和乙醇，按照体积比5:4混合均匀，得到展开剂；将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；

b)将步骤3)点样后的反相薄层板，置于步骤a)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和2～30分钟(例如预饱和10～15分钟)后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成展开。

技术方案13.根据技术方案1所述的方法，其如本发明实施例1所述。

技术方案14.根据技术方案1所述的方法，其如本发明实施例2所述。

本发明任意两个或者多个技术方案之间可以相互组合以形成新的技术方案。

本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，只要它们不会相互矛盾，当然在相互之间适用时，必要的话可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

现有技术公开了一些对各种对甘草、胀果甘草、光果甘草三者进行区分/鉴别的方法。例如，2015年版《中国药典》一部收载的“甘草”中从性状的角度对三种来源的甘草进行了区分，但是这种区分要求有极其丰富的经验才能完成，普通的从业者是难以将它们进行科学地区分的。另外，崔淑芬(崔淑芬等，微乳薄层色谱法鉴别甘草的研究，中草药，2007年04期)公开了一种使用微乳展开剂的薄层色谱法来鉴别三种甘草，其中使用的微乳组成为：0.23mol/L的SDS+16％正丁醇+11％甲醇+2.4％正庚烷，并且需要使用甘草苷和甘草查耳酮甲两种对照用单体化合物，其使用的展开板亦为聚酰胺薄膜；显然，该崔淑芬方法一方面在配制微乳方面的难度是远比本发明添加微量磷酸的乙醇溶液要大的，例如为了使正丁醇、正庚烷二者溶解于水中，需要添加表面活性剂/乳化剂十二烷基硫酸钠即SDS，并且这种微乳是不稳定的，有使用的期限；另外，由于使用了甲醇、正丁醇、正庚烷这些有机溶剂，其对操作者的健康保障、环境友好、试验后清洗等都会带来非常大的麻烦；再者，崔淑芬的方法需要用到甘草苷和甘草查耳酮甲两种对照用单体化合物，而这种对照用单体化合物来源少、贵，并不是一般实验室都能配备的。而本发明使用微量磷酸-乙醇-水体系作为展形剂进行健康保障、环境友好、试验后清洗等方面都非常简易的处置的反相薄层层析，可以不用对照单体化合物即可实现三种药材的快速、有效的鉴别区分，这是现有技术都无法与本发明技术效果相比的。另外，本发明人在本发明中已经发现，即使是本发明方法，亦是一种非常独特且精确选择的方法条件；例如，当在本发明实施例1和实施例2中仅将其中的展开剂中所用的磷酸改为使用盐酸、硫酸或硝酸等无机酸或者甲酸或乙酸等有机酸且酸水溶液的pH值与该磷酸水溶液相同时，Rf值0.41左右处的天蓝色的荧光斑点均消失，仅在本发明实施例1和实施例2使用磷酸作为展开剂酸性组分的条件下才能分离/呈现出Rf值0.41左右处的天蓝色的荧光斑点；又例如，当在本发明实施例1和实施例2中仅将其展开剂中磷酸水溶液与乙醇的体积比改为在5：3～5范围内变化时，光果甘草在Rf值0.49和0.54的两个黄绿色荧光斑点可以分离开，但是如果在本发明实施例1和实施例2中仅将其展开剂中磷酸水溶液与乙醇的体积比改为在5：3～5之外的范围变化例如水液比醇液体积比5：2或者5：6时，光果甘草在Rf值0.49和0.54处的两个黄绿色荧光斑点无法有效的分离开来且移到Rf值约0.51处呈现一个黄绿色荧光斑点，即其在图1中B、D两斑点移到C处，表明即使用是本发明色谱条件中酸性物质的种类和水/乙醇比例的细微改变均可能会严重影响三种甘草的鉴别区分；另外，已经发现，当在本发明实施例1和实施例2中，其它分析条件在本发明规定的范围内适当改变时不会影响三种甘草的鉴别区分效果。再如，木合布力·阿布力孜(木合布力·阿布力孜等，新疆医科大学学报，2014年02期)公开了一种胀果甘草的简便快速鉴定方法，其所用的方法利用超声辅助的乙醇提取法制备新疆胀果甘草和光果甘草的总黄酮类提取物；利用硅胶薄层色谱法分析2种甘草总黄酮提取物的斑点特征；利用制备薄层法分离薄层板上的特殊斑点并对所分离的单体成分进行结构分析，结果表明胀果甘草乙醇提取物在展开剂为乙酸乙酯∶甲酸∶水(8∶3∶1)的薄层色谱条件下所显示的一种特殊亮黄色斑点被鉴定为甘草查尔酮A，色谱特征不同于其他甘草品种，表明以甘草查尔酮A为对照品的硅胶搏层色谱法是快速鉴别胀果甘草的简便方法，适合于甘草品种的快速鉴定及资源考察研究。然而木合布力的这一文献方法并不适合三种甘草的同时鉴别，并且由于其中使用了大量的乙酸乙酯、甲酸，还使用了甘草查尔酮A这种单体化学物质，这些方法条件会与崔淑芬那样引发令人难以接受的缺陷。

本发明的优点在于：本发明首次采用反相薄层色谱法鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草，方法操作简单，所使用的仪器设备和对照药材普及性好，便于药材加工、销售企业和药品检验单位推广应用。

附图说明

图1为实施例1所得带标注的反相薄层色谱鉴别方法色谱图(365nm紫外灯光)，图中1为甘草(胀果甘草)对照药材，2为胀果甘草供试品，3为光果甘草供试品，4为甘草(甘草)对照药材，5为甘草供试品；具体的，以上图1中显示：

甘草供试品和甘草对照药材在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点，在Rf值0.51左右(图中C对应的位置)，均有一个黄绿色的荧光斑点；

胀果甘草和胀果甘草对照药材仅在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点；

光果甘草在Rf值0.49和0.54左右(图中B和D对应的位置)，各有一个黄绿色的荧光斑点，在Rf值0.41和0.51左右(图中A和C对应的位置)，没有斑点。

图2为实施例2所得(未带标注的)反相薄层色谱鉴别方法色谱图(365nm紫外灯光)，图中1～5代表的物质与与图1中1～5代表的物质相同。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。以下实施例进一步说明本发明，而不是限制本发明。

实施例1：反相薄层色谱法鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草的方法。

1)对照药材溶液的制备：

分别称取甘草(甘草)对照药材、甘草(胀果甘草)对照药材各1g，分别置于具塞锥形瓶中，加70％乙醇(乙醇占水溶液中体积比)100ml，密塞，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液，备用；

2)药材供试品溶液制备：

用高速万能粉碎机对干燥的甘草、胀果甘草、光果甘草药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；

称取甘草、胀果甘草、光果甘草粉末1g，分别置于具塞锥形瓶中，加70％乙醇(乙醇占水溶液中体积比)100ml，密塞，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，制得甘草、胀果甘草、光果甘草供试品溶液。

3)用定量毛细管分别吸取上述制得的2种对照药材溶液和3种供试品溶液各10μl，依次点样于同一反相薄层板(这种反相薄层层析板可以直接从市场购得)同一水平线的不同位置上。

4)展开方法，按以下a～b方法操作：

a)取0.1％磷酸水溶液和乙醇，按照体积比5:4混合均匀，得到展开剂。将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；

b)将步骤3)点样后的反相薄层板，置于步骤a)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10～15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成展开；

5)按下述方法比较色谱图中的斑点，从而鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草：

于365nm波长紫外灯下检视步骤4)b)的反相薄层板，并比较色谱图中的荧光斑点(详见附图)，以鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草；

甘草供试品和甘草(甘草)对照药材在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点，在Rf值0.51左右(图中C对应的位置)，均有一个黄绿色的荧光斑点；

胀果甘草和甘草(胀果甘草)对照药材仅在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点；

光果甘草在Rf值0.49和0.54左右(图中B和D对应的位置)，各有一个黄绿色的荧光斑点，在Rf值0.41和0.51左右(图中A和C对应的位置)，没有斑点。

图1示出了本实施例在365nm波长下的检视图。另外，下文实施例2所得薄层图谱即图2与上述实施例1所得图1基本相同。

实施例2：反相薄层色谱法鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草的方法。

1)对照药材溶液的制备：

分别称取甘草(甘草)对照药材、甘草(胀果甘草)对照药材各2g，分别置于具塞锥形瓶中，加80％甲醇(甲醇占水溶液中体积比)150ml，密塞，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，作为对照药材溶液，备用；

2)药材供试品溶液制备：

用高速万能粉碎机对干燥的甘草、胀果甘草、光果甘草药材分别进行粉碎，过60目筛得药材粉末；

分别称取甘草、胀果甘草、光果甘草粉末2g，分别置于具塞锥形瓶中，加80％甲醇(甲醇占水溶液中体积比)150ml，密塞，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，取续滤液，制得甘草、胀果甘草、光果甘草供试品溶液。

3)用定量毛细管分别吸取上述制得的2种对照药材溶液和3种供试品溶液各10μl，依次点样于同一反相薄层板同一水平线的不同位置上。

4)展开方法，按以下a～b方法操作：

a)取0.1％磷酸水溶液和乙醇，按照体积比5:4混合均匀，得到展开剂。将展开剂置干燥洁净的双槽薄层色谱展开缸的第一个槽中；

b)将步骤3)点样后的反相薄层板，置于步骤a)的双槽薄层色谱展开缸第二个槽中，密闭缸盖，预饱和10～15分钟后，将上述双槽薄层色谱展开缸第一个槽中的展开剂转移到放有反相薄层板的第二个槽中，进行展开，展距10cm，结束展开，取出薄层板，晾干，完成展开；

5)按下述方法比较色谱图中的斑点鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草：

于365nm波长紫外灯下检视步骤4)b)的反相薄层板，并比较色谱图中的荧光斑点(详见附图)，以鉴别甘草、胀果甘草、光果甘草；

甘草供试品和甘草(甘草)对照药材在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点，在Rf值0.51左右(图中C对应的位置)，均有一个黄绿色的荧光斑点；

胀果甘草和甘草(胀果甘草)对照药材仅在Rf值0.41左右(图中A对应的位置)，均有一个天蓝色的荧光斑点；

光果甘草在Rf值0.49和0.54左右(图中B和D对应的位置)，各有一个黄绿色的荧光斑点，在Rf值0.41和0.51左右(图中A和C对应的位置)，没有斑点。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。