同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系

摘要

本发明公开了一种同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系。从内到外依次为电极、信标探针层、6‑巯基己‑1‑醇(MCH)封闭层、均相反应产物层，信标探针层采用电化学信号互不影响的亚甲基兰和二茂铁修饰；制备方法是先对电极抛光并用H2SO4和H2O2处理，再将信标探针修饰于电极表面。本发明传感器制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中水胺硫磷和啶虫脒的检测和生物传感器产业化的实际应用；可实现对食品中水胺硫磷和啶虫脒的快速在线检测，水胺硫磷和啶虫脒检出限分别是0.12和0.37ppb。

说明书

技术领域

本发明涉及传感器技术领域的检测两种农药的方式，特别涉及了一种同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系。

背景技术

有机磷类广泛用于农作物的杀虫、杀菌、除草，为我国使用量最大的一类农药。有机磷农药属于神经毒物，主要抑制血液和组织中乙酰胆碱酯酶的活性，导致乙酰胆碱的大量蓄积，从而阻断了神经传导，引起中枢神经系统中毒。水胺硫磷是一种高毒有机磷杀虫剂，能通过食道、皮肤和呼吸道引起中毒，作为一种高毒农药，水胺硫磷禁止用于果、茶、烟、菜、中草药等植物或蔬菜、水果上。啶虫脒属硝基亚甲基杂环类化合物，是一种新型杀虫剂，作用于昆虫神经系统突触部位的烟碱乙酰胆碱受体，干扰昆虫神经系统的刺激传导，引起神经系统通路阻塞，造成神经递质乙酰胆碱在突触部位的积累，从而导致昆虫麻痹，最终死亡。

我国是世界上第二大农药使用国，每年在蔬菜水果等农作物产品上农药使用量约达100万吨。农药大规模使用，使我国环境水体、土壤以及蔬菜水果都受到农药污染和农药残留的严重威胁。特别是近年来，由于害虫抗药性的增强，使用农药的浓度和次数不断增加，造成农药残留超标，不仅对生态环境造成了严重的污染与危害，引起了环境工作者的高度重视；而且常有发生的急性、慢性中毒事件以及农药在人体内的积累和富集而引发的各种疾病，直接影响到人类的健康，因而对食品及饮用水中农药残留进行检测是十分必要的。

目前，常用的农药残留检测方法主要有常规仪器法和生物分析法。常规仪器法是包括气相色谱法、高效液相色谱法、色谱-质谱联用技术等。这些方法仪器操作复杂，需要专业操作人员，往往不适于现场检测，生物分析法指酶抑制技术、酶免疫分析法、生物传感器等，这类方法易于现场快速测定。另一方面，农作物中往往同时存在两种或者更多的农药，高通量的检测技术也是生物分析法的一个瓶颈。

发明内容

本发明针对现有检测方法中仪器操作复杂，需要专业操作人员，不能实现高通量的缺点，提供了一种同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系，通过适配体方式对水胺硫磷和啶虫脒实现电化学检测。

本发明的技术方案是

一、一种同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器：

从内到外依次为电极、信标探针层、6-巯基己-1-醇(MCH)封闭层和均相反应产物层，信标探针层采用电化学信号互不影响的亚甲基兰和二茂铁修饰，亚甲基兰的电化学信号对水胺硫磷的量有响应，二茂铁的电化学信号对啶虫脒有响应，通过亚甲基兰的电化学信号对水胺硫磷的响应和二茂铁的电化学信号对啶虫脒的响应获得水胺硫磷和啶虫脒的检测情况。

本发明通过实施例验证：

不加入水胺硫磷和啶虫脒时，亚甲基兰和二茂铁产生的信号强。

仅加入水胺硫磷时，亚甲基兰产生的信号低，二茂铁产生的信号强。

仅加入啶虫脒时，二茂铁产生的信号信号低，亚甲基兰产生的信号强。

同时加入水胺硫磷和啶虫脒时，亚甲基兰和二茂铁产生的信号明显都低。

所述的传感器能同时检测0.5到100ppb的水胺硫磷和啶虫脒，水胺硫磷和啶虫脒检出限分别是0.12和0.37ppb。

所述电极采用金电极。

二、一种同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器的方法体系：

(1)电极抛光并用体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂处理；

(2)将含有信标探针XB1和信标探针XB2的两种信标探针溶液修饰于电极表面，形成信标探针层；

(3)修饰MCH封闭未特异性结合的位点，形成6-巯基己-1-醇(MCH)封闭层；

(4)将均相反应产物修饰于电极表面上修饰后的信标探针，形成均相反应产物层；

(5)用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗修饰后的电极；

(6)采用三电极体系，读取电极上的电信号变化，根据电极表面产生的电流大小获得水胺硫磷和啶虫脒的检测结果。

所述的XB1如SEQ ID NO.1，为SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB；所述的XB2如SEQ ID NO.2，为SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc，其中，SH表示巯基、MB表示亚甲基蓝，Fc表示二茂铁。

所述含有信标探针XB1的信标探针溶液和含有信标探针XB2的信标探针溶液的体积比为1:2。

所述步骤(4)的均相反应产物是通过以下步骤的均相反应获得：

(4.1)将含有两种基因序列的发卡HAP溶液加入到Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液中；

(4.2)加入两种待测目标物溶液，在37℃孵育30min；

(4.3)加入含有两种引物序列的溶液，并加入Phi29DNA聚合酶溶液、dNTP溶液和NB.BbvCI溶液，在37℃孵育1h。

所述的发卡HAP溶液中两种基因序列分别为发卡HAP1和发卡HAP2，发卡HAP1如SEQ ID NO.3，为AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT；发卡HAP2如SEQ>CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG；两种基因序列的含量相同。

所述的含有两种引物序列的溶液的两种引物序列分别为引物1和引物2，引物1如SEQ ID NO.5，为AGCTTGCCT；引物2如SEQ ID NO.6，为CTGACAACG。

所述金电极用H₂SO₄和H₂O₂的处理时间是20min。

所述方法体系的步骤(1)～(4)具体为：

(1)电极抛光后，将电极浸泡在体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

(2)将2μL的浓度为10μM的信标探针XB1溶液和4μL的浓度为10μM的信标探针XB2溶液滴加到电极表面；

(3)修饰MCH封闭未特异性结合的位点；

(4)采用以下方式制备均相反应产物，再修饰于电极表面上修饰后的信标探针：

(4.1)将2μL的浓度为100nM的发卡HAP1溶液和2μL的浓度为100nM的发卡HAP2溶液加入到20μL的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液中；

(4.2)加入两种待测目标物水胺硫磷和啶虫脒溶液，在37℃下孵育30min；

(4.3)加入2μL的浓度为100nM的引物1溶液和2μL的浓度为100nM的引物2溶液，并加入1μL的浓度为10unitμL^-1的Phi29DNA聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL的浓度为10unitμL^-1的NB.BbvCI，在37℃孵育1h。

所述电化学传感器，采用传统的三电极体系，以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取电信号的变化，根据电极表面产生的电流的大小起到对目标物检测的作用。

本发明中一共用到了6条DNA链，其序列从5’端—3’端分别是：

(NO.1)发卡HAP1：AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT

(NO.2)发卡HAP2：CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG

(NO.3)引物1：AGCTTGCCT

(NO.4)引物2：CTGACAACG

(NO.5)信标探针XB1：SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB

(NO.6)信标探针XB2：SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc

如图1所示，本发明的工作原理是：

如图1的步骤A：本发明中应用的探针NO.1、NO.2、NO.5和NO.16都存在5’端与3’端碱基互补配对(斜体部分)的情况，因此在缓冲溶液中以发卡的构型存在。其中发卡HAP1探针的序列中，5’端画横线的部分为目标物水胺硫磷的适配体，发卡HAP2探针的5’端画横线的部分为目标物啶虫脒的适配体。适配体可以与目标物特异性的识别并紧密结合，因此发卡HAP1和发卡HAP2在与水胺硫磷、啶虫脒混合时将发生发卡打开的构型变化，使得在发卡HAP1和发卡HAP2由双链DNA变成单链的同时水胺硫磷和啶虫脒分别与发卡HAP1和发卡HAP2打开后的单链基因结合，如图1的步骤A所示。

本发明中引物1与引物2都存在8个碱基，并分别与发卡HAP1和发卡HAP2的3’端互补配对。因此引物1与引物2分别结合到被待测目标物打开的发卡HAP1和发卡HAP2的单链基因上，如图1的步骤A。

引物与发卡结合后暴露出引物3’端的凹末端，在Phi29DNA聚合酶和dNTP的存在下，引物以发卡探针为模板不断延伸直到形成完整的双链，并将待测目标物挤下来，并切割下来Helper，Helper的基因序列是发卡HAP基因序列中的一部分。

被挤下的目标物可循环使用，打开下一个发卡，如图1的步骤A中的回转箭头所示。

延伸生长出的双链上含有限制性内切酶(Nb.BbvCI)的识别序列(黑体序列)，在Phi29DNA聚合酶、dNTP和Nb.BbvCI的同时作用下，切割位点及之后的核酸片段(发卡HAP1产生的称为Helper 1，发卡HAP2产生的称为Helper2)不断被生长和切割，每一个发卡HAP对应产生很多Helper，实现了信号放大作用。

如图1的步骤B：信标探针1和信标探针2分别在5’端修饰有巯基(SH)，可与金电极形成稳定的Au-S键，从而稳定的修饰在金电极表面，信标探针1的3’端修饰有亚甲基蓝(MB)，信标探针2的3’端修饰有二茂铁(Fc)，亚甲基蓝在-0.25V电位下发生氧化还原反应，二茂铁在+0.38V电位下发生氧化还原反应，我们就是通过检测这两种可完全分离的氧化还原信号来达到定量检测目标物的目的。当信标探针呈现发卡结构，3’端修饰的信标分子离电极较近，可产生较大的氧化还原信号，均相反应中产生的Helper可打开信标探针的发卡结构，使得信标探针上修饰的亚甲基兰和二茂铁远离电极表面，产生的电化学信号也大大降低。

因此，在本发明所述的电化学传感器检测过程中，通过检测MB和Fc信号的强弱对目标物进行定量，当目标物越多时，产生的Helper也越多，打开的信标探针也越多，远离电极表面的MB和Fc也越多，产生的信号也就越小。同时MB和Fc电化学信号相互分离互不影响，实现了两种农药的同时检测。

本发明的有益效果是：

1、本发明利用了核酸适配体的特异型识别，利用了水胺硫磷和啶虫脒的适配体作为识别物质实现了水胺硫磷和啶虫脒的高特异性检测。并且利用了聚合酶的聚合作用和核限制性核酸内切酶对特异性序列的识别和切割作用，实现了目标物的循环利用，并不断产生Helper探针，起到了信号放大的作用。

2、本发明传感器的反应条件温和，反应速度快。制备方法简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中水胺硫磷和啶虫脒的检测和生物传感器产业化的实际应用。

3、检测原理的主要过程均是在均相中实现的，提高的反应速度，降低了操作的复杂程度，实现了目标物的快速，简单，灵敏的检测。

4、由于使用金电极，其电极简便、小型化、易携带、可多次使用。制作电极的工艺成本低，适用于产业化中价廉的要求。

综合来说是，本发明传感器和方法体系简单，性能稳定，电极的重复性好，适用于食品安全中水胺硫磷和啶虫脒的检测和生物传感器产业化的实际应用；可实现对食品中水胺硫磷和啶虫脒的快速在线检测，水胺硫磷和啶虫脒检出限分别是0.12和0.37ppb。

附图说明

图1是本发明方法体系的原理图。

图2是本发明各个实施例中电极上检测获得的电信号结果图，图中A为实施例1，B为实施例2，C为实施例3，D为实施例4。

图3是实施例5对应的标准曲线图，其中A图不同浓度农药对应的波谱图，B是水胺硫磷与电信号响应的拟合图，C图是啶虫脒与电信号响应的拟合图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，下述说明仅是实例性的，不限定本发明的保护范围。

本发明的实施例如下：

以下实施例用到的溶液的制备是：

PBS缓冲液是由方法配制：Na₂HPO₄(10mM)，NaH₂PO₄(10mM)，NaCl(140mM)，KCl(1mM)，MgCl₂(1mM)，CaCl₂(1mM)，最终溶液的pH值为7.4。

配置的PBS缓冲液与超纯水均需进行灭菌处理。具体方法是，将PBS和超纯水分别放置在不同的锥形瓶中，然后用锡箔纸和报纸进行封口。在高压灭菌锅中在120℃的温度下灭菌20min。

本发明中所用发卡、信标探针和引物均为人工合成，合成后的溶解方法为：3000转/min离心3min，用灭菌后的PBS(pH＝7.4)溶解为所需浓度。

实施例1

a、金电极首先在粒径为0.3μm的氧化铝浆和粒径为0.05μm的氧化铝浆中依次进行抛光处理，直到呈镜面，并将电极浸泡在20mL体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

b、将共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步骤a处理后的电极表面，在常温下孵育2h，信标探针XB通过Au-S键将巯基链固定到电极表面。

c、用MCH修饰来封闭未特异性结合的位点，具体是：将6μL的1mM的MCH溶液滴加到电极表面，孵育30min后用PBS洗涤。

d、进行均相反应，主要步骤为：

1、将2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的浓度1×的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液分别加入到离心管中，37℃孵育30min；

原始制备附带10倍浓度(10×)的缓冲液，使用时稀释10倍，原始10倍浓度(10×)的缓冲液包含40.0mM pH 7.5Tris-HCl,50.0mM KCl,10.0mMMgCl₂和5.0mM(NH₄)₂SO₄。

2、继续向上一步的离心管中加入2μL 100nM引物1与2μL 100nM引物2，加入1μL的浓度为10unitμL^-1的Phi29DNA聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL的浓度为10unitμL^-1的NB.BbvCI。震荡30s放入37℃的恒温箱中孵育1h。

e、将均相反应后的溶液滴加到预先修饰好XB的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB和Fc电信号的变化。

h、其结果如附图2的A图所示，因没有加入目标物，也就没有产生能打开信标探针发夹构型的Helper，信标探针呈发卡构型，MB和Fc距离电极较近，产生的信号很大，电信号具体分别为1.43μA和1.01μA，对应检测到的浓度分别为0ppb和0ppb。

实施例2

a、金电极首先在粒径为0.3μm的氧化铝浆和粒径为0.05μm的氧化铝浆中依次进行抛光处理，直到呈镜面，将电极浸泡在20mL体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

b、将共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步骤a处理后的电极表面，在常温下孵育2h，信标探针XB通过Au-S键将巯基链固定到电极表面。

c、修饰MCH用以封闭未特异性结合的位点。

d、均相反应中的主要步骤：

1、将2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的浓度1×的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液分别加入到离心管中，加入过量的水胺硫磷(500ppb)，37℃孵育30min；

2、继续向1步的离心管中加入2μL 100nM引物1与2μL 100nM引物2，加入1μL的浓度为10unitμL^-1的聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL浓度为10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震荡30s放入37℃的恒温箱中孵育1h。

e、将均相反应后的溶液滴加到预先修饰好XB的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB和Fc电信号的变化。

h、其结果如附图2的B图所示，因加入过量的水胺硫磷，也就产生能打开HAP1发卡构型，同时产生打开MB修饰的XB1发夹构型的Helper1，使得MB远离电极表面，MB信号明显降低，而信标探针2呈发卡构型，Fc距离电极较近，产生的信号很大，电信号具体分别为0.14μA(MB)和0.98μA(Fc)，对应检测到的浓度分别为500ppb(水胺硫磷)和0ppb(啶虫脒)。

实施例3

a、金电极首先在粒径为0.3μm的氧化铝浆和粒径为0.05μm的氧化铝浆中依次进行抛光处理，直到呈镜面，将电极浸泡在20mL体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

b、将共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步骤a处理后的电极表面，在常温下孵育2h，信标探针XB通过Au-S键将巯基链固定到电极表面。

c、修饰MCH用以封闭未特异性结合的位点。

d、均相反应中的主要步骤：

1、将2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的浓度1×的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液分别加入到离心管中，加入过量的啶虫脒(500ppb)，37℃孵育30min；

2、继续向1步的离心管中加入2μL 100nM引物1与2μL 100nM引物2，加入1μL的浓度为10unitμL^-1的聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL浓度为10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震荡30s放入37℃的恒温箱中孵育1h。。

e、将均相反应后的溶液滴加到预先修饰好XB的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB和Fc电信号的变化。

h、其结果如附图2的C图所示，因加入过量的啶虫脒，也就产生能打开HAP2的发卡结构，同时产生打开Fc修饰的XB2发夹构型的Helper2，使得Fc远离电极表面，Fc信号明显降低，而信标探针1呈发卡构型，MB距离电极较近，产生的信号很大，电信号具体分别为1.42μA(MB)和0.094(Fc)μA，对应检测到的浓度分别为0ppb(水胺硫磷)和500ppb(啶虫脒)。

实施例4

a、金电极首先在粒径为0.3μm的氧化铝浆和粒径为0.05μm的氧化铝浆中依次进行抛光处理，直到呈镜面，将电极浸泡在20mL体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

b、将共6μL的XB溶液(10μM的XB1：2μL和10μM的XB2：4μL)滴加到步骤a处理后的电极表面，在常温下孵育2h，信标探针XB通过Au-S键将巯基链固定到电极表面。

c、修饰MCH用以封闭未特异性结合的位点。

d、均相反应中的主要步骤：

1、将2μL 100nM的HAP1和2μL100nM的HAP2和20μL的浓度1×的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液分别加入到离心管中，加入过量的水胺硫磷和啶虫脒，37℃孵育30min；

2、继续向1步的离心管中加入2μL 100nM引物1与2μL 100nM引物2，加入1μL的浓度为10unitμL^-1的聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL浓度为10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震荡30s放入37℃的恒温箱中孵育1h。

e、将均相反应后的溶液滴加到预先修饰好XB的电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB和Fc电信号的变化。

h、其结果如附图2的D图所示，因加入过量的水胺硫磷和啶虫脒，也就产生能打开HAP1和HAP2的发卡结构，同时产生打开信标探针发夹构型的Helper1和Helper2，使得MB和Fc远离电极表面，MB和Fc信号都明显降低，电信号具体分别为0.13μA(MB)和0.097μA(Fc)，对应检测到的浓度分别为500ppb(水胺硫磷)和500ppb(啶虫脒)。

实施例5

a、10支金电极首先在粒径为0.3μm的氧化铝浆和粒径为0.05μm的氧化铝浆中依次进行抛光处理，直到呈镜面，将电极浸泡在20mL体积比为3:1的H₂SO₄和H₂O₂的混合液中，孵育20min后用超纯水彻底洗涤；

b、将共6μL的XB溶液(10μM的XB 1：2μL和10μM的XB 2：4μL)滴加到步骤a处理后的10支电极表面，在常温下孵育2h，信标探针XB通过Au-S键将巯基链固定到电极表面。

c、修饰MCH用以封闭未特异性结合的位点。

d、均相反应中的主要步骤：

1、将2μL 100nM的HAP1和2μL 100nM的HAP2和20μL的浓度1×的Phi29DNA聚合酶的缓冲溶液分别加入到10支离心管中，向10支离心管中加入不同量的的水胺硫磷和啶虫脒(0ppb和0ppb(a)，0.5ppb和0.5ppb(b)，1.0ppb和1.0ppb(c)，5ppb和5ppb(d)，10ppb和10ppb(e)，50ppb和50ppb(f)，100ppb和100ppb(g)，500ppb和500ppb(h))，37℃孵育30min；

2、继续向1步的离心管中加入2μL 100nM引物1与2μL 100nM引物2，加入1μL的浓度为10unitμL^-1的聚合酶、2μL的浓度为5mM的dNTP和1μL浓度为10unitμL^-1的Nb.BbvCI。震荡30s放入37℃的恒温箱中孵育1h。

e、将均相反应后的溶液滴加分别依次修饰到到c步骤处理好的10支电极上。然后将电极继续放在37℃的恒温箱中孵育2h。

f、用磁力搅拌器在PBS溶液中清洗电极，每次10min，共清洗3次。

g、以Ag/AgCl为参比电极，以Pt电极为对电极，电位设置为-0.4到0.6V，脉冲宽度0.05V，脉冲宽度扫描为0.06S，采用差分脉冲伏安技术读取MB和Fc电信号的变化。

h、其结果如附图3所示，因加入不同量的水胺硫磷和啶虫脒，也就产生能打开不同量HAP1和HAP2的发卡结构，同时产生不同量的打开信标探针发夹构型的Helper1和Helper2，使得MB和Fc远离电极表面的程度也不同，MB和Fc信号随水胺硫磷和啶虫脒量的增多而依次降低，水胺硫磷电信号具体分别为1.43μA,1.40μA,1.14μA,0.89μA,0.67μA,0.36μA,0.16μA和0.13μA，对应检测到的浓度分别为0ppb,0.5ppb，1.0ppb，5ppb，10ppb，50ppb，100ppb，500ppb。啶虫脒电信号具体分别为1.01μA,0.96μA,0.81μA,0.63μA,0.46μA,0.26μA,0.12μA和0.097μA，对应检测到的浓度分别为0ppb,0.5ppb，1.0ppb，5ppb，10ppb，50ppb，100ppb，500ppb。

在附图3中同时可看出，该传感器可同时检测0.5到100ppb的水胺硫磷和啶虫脒，水胺硫磷和啶虫脒检出限分别是0.12和0.37ppb。

本发明上述涉及的基因和氨基酸序列具体如下：

SEQ ID NO.1：发卡HAP1的基因序列

来源：人工合成

AGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCTGCTGAGGTGGAGGCAAGCT

SEQ ID NO.2：发卡HAP2的基因序列

来源：人工合成

CTGACACCATATTATGAAGAGCTGAGGGTCGTTGTCAG

SEQ ID NO.3：引物1的基因序列

来源：人工合成

AGCTTGCCT

SEQ ID NO.4：引物2的基因序列

来源：人工合成

CTGACAACG

SEQ ID NO.5：信标探针XB1

来源：人工合成

SH-GAGGTAAGCCTCCACCTC-MB

SEQ ID NO.6：信标探针XB2

来源：人工合成

SH-GAGGGAACAACGACCCTC-Fc

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受实施例的限制，其它任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、组合、替代、简化均应为等效替换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省农业科学院

<120> 同时检测水胺硫磷和啶虫脒的电化学传感器及其方法体系

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agcttgctgc agcgattctt gatcgccaca gagctgctga ggtggaggca agct 54

<210> 2

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ctgacaccat attatgaaga gctgagggtc gttgtcag 38

<210> 3

<211> 9

<212> DNA

<213> 引物2

<400> 3

agcttgcct 9

<210> 4

<211> 9

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

ctgacaacg 9

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

gaggtaagcc tccacctc 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

gagggaacaa cgaccctc 18