云南金花茶种苗组培快繁方法

摘要

云南金花茶种苗组培快繁方法，属于植物无性繁殖方法。本发明设两种金花茶组培培养基集合G和H中的第n个组培培养基是

说明书

技术领域

本发明属于植物无性繁殖的方法，主要涉及木本植物的组织培养方法。

背景技术

云南金花茶(Camellia fascicularis H.T.Chang)是山茶科(Theaceae)，山茶属(Camellia)金花茶组的一个种，又称簇蕊金花茶、云南显脉金花茶，属于云南特有极小种群植物。云南金花茶被植物分类学公认与金花茶(Camellia nitidissima)分属于两个种(闵天禄,张文驹.山茶属古茶组和金花茶组的分类学问题[J].植物分类与资源学报,1993,15(1):1-15.中国科学院昆明植物研究所.云南植物志(第八卷)上册[M].北京:科学出版社,1997:26.闵天禄.世界山茶属的研究[M].昆明:云南科技出版社,2000:99-100.)。此外，分子分类学用ISSR或AFLP分子标记区分该两个不同种的基因有明显差别(唐绍清,杜林方,王燕.山茶属金花茶组金花茶系的AFLP分析[J].植物科学学报,2004,22(1):44-48.肖政,李纪元,李志辉,等.金花茶组物种遗传关系的ISSR分析[J].林业科学研究,2014,27(1):71-76.)。云南金花茶花朵大且金黄，蒴果呈橙黄或紫红，观赏价值极高；花叶中含人体所需的微量元素和营养成分。亟待解决的是，作为云南省珍贵树种，本发明人实地踏查测量现存数量不到700株，分布仅限于河口、个旧、马关的三县市，按IUCN标准属极危等级(CR)，该种结实量较少，且种子易裂开，不易保存。由于人为严重破坏，长势赢弱，无法结实，影响了林下更新。在种质创新方面，云南金花茶是亟待保护的金花茶组内重要种质资源。金花茶组内其他种的繁育研究目前已有报道。如CN104488712A“一种嫩芽金花茶的组培快繁方法”和CN104285813A“一种金花茶组培繁殖方法”，前者包括愈伤组织分化芽和生根培养等步骤；后者用种子培育的无菌苗顶芽增殖培养获得丛生芽等。这些方法均使用离体组织或器官——叶片或种子通过细胞增殖培养基进行培养，所获得的种苗与母株之间会存在变异，增殖倍数及生根率较低。除外，云南金花茶的组织培养未见相关研究报道。问题是，目前组培实验步骤停留于经验和直观性，重复和冗繁降低了实验效率。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的在于以性状优良的云南金花茶的嫩茎或顶芽为启动材料，通过以芽繁芽的方式，进行种苗快速扩繁，从而提供一种遗传性状稳定，繁殖系数高，可全年生产的云南金花茶种苗组培快繁方法。

上述目的按以下方法实现，该方法包括：

对于两种削弱了顶端优势的不同种的金花茶，设这两种金花茶组培培养基的集合G和H中的第n个组培培养基分别是<g_n，α_n>和<h_n，β_n>，α_n和β_n为g_n和h_n的多元运算，那么，设f是G→H的映射，使任意的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾…∈g_n，有f(a₁)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，b₂⁽ⁿ⁾…是a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…激素的同态像。

进一步，所述方法是：

设云南金花茶为组培培养基的集合G，G＝{<g₁，α₁>，<g₂，α₂>，…<g_n，α_n>}，g₁、g₂、…g_n为云南金花茶组织培养不同生长发育期的培养基，α₁，α₂，…α_n分别是g₁、g₂、…g_n的组合方式；

另一种的金花茶组培培养基的集合H，H＝{<h₁，β₁>，<h₂，β₂>，…<h_n，β_n>}，h₁、h₂、…h_n为金花茶组织培养不同生长发育期的培养基，β₁、β₂、…β_n分别是h₁、h₂、…h_n的组合方式；

设f是G→H的映射，使集合G中第n个组培方法的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾，…∈A_n，有f(a₁⁽ⁿ⁾)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂⁽ⁿ⁾)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾，b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，h_n为集合H中的组培方法，那么，b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…是a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…激素的同构像，这两个集合是同构的。

进一步，所述的方法包括如下步骤：

(1)选取性状优良的云南金花茶当年生嫩茎或顶芽为外植体，冲洗中去除叶片，切成3-4厘米长带1-3个叶腋的茎段，消毒、冲洗、备用；

(2)切除茎段两端，保持新鲜切口斜插于启动培养基上诱导芽，该培养基配方为：

MS或WPM+1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IAA，

附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L琼脂，pH值5.6-5.8；培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500-2000Lux，30-40天获得增殖小芽；

(3)切割步骤(2)高度在2-3厘米小芽，接种到以下增殖培养基上培养：

改良WPM+3.0mg/L 6-BA+0.1mg/L IAA，

培养基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L琼脂，pH值5.8-6.0，培养条件同(2)，经50天培养形成丛生芽；

(4)选取步骤(3)丛生芽中高在2-3厘米的单个芽，保留1-3叶片，接种到以下生根培养基上培养6-7周，得到生根苗：

改良1/2MS+2.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3g/L活性炭，

附加15-20.0g/L白砂糖，4g/L卡拉胶，pH值5.6-5.8，培养条件同(2)；

(5)在室内自然光下培养7-10天后取出生根苗，洗净培养基，移栽到消毒基质中，该基质体积比为：红土:腐质土＝2:1，空气相对湿度70-80％、温度20-30℃，30天的移栽成活率大于95％。

所述的方法是：改良WPM培养基和改良1/2MS培养基的组成及含量如下表(单位mg/L)：

本发明具有的实质性特点和显著进步是：

本发明云南金花茶嫩茎培养基的激素与“一种嫩芽金花茶的组培快繁方法”的植物激素具有同态像或同构像。尽管两者按植物学分类分别属于金花茶组不同的两个种，但这两种植物各步骤培养基激素的性质相同，区别仅在于培养基微量元素、激素浓度、环境条件。因此，本发明提供了这样一种方法，当不同种的削弱了顶端优势的金花茶进行组织培养时，如果其中一种获得成功，那么另一种金花茶的组培的植物激素组合与前者同态或同构，通过调整激素浓度等而达到组培目的。因此，即使在基因转录水平上，存在差异的两种金花茶，也可以将二者视为同质的植物。从而提高实验效率，降低成本。

尽管上述方法是在本发明实验类比和归纳之后得到的结果，然而根据上述方法，在改良了培养基微量元素，调整了激素浓度和环境条件后，本发明具有以下优点：

1、本发明流程简单。直接以优良单株嫩茎为材料“以芽繁芽”，培育的种苗无变异，可与母株的性状完全保持一致。

2、本发明不针对丛生芽愈伤组织，无需用种子为启动材料萌发小苗，也无壮苗环节。(尽管根据类比推理，壮苗环节可以与生根环节兼并。)直接采用以芽繁芽的方式增殖，

3、本发明所用的培养基激素为6-BA+IAA和IBA+NAA两种，所筛选的培养基在增殖和生根阶段其组培苗均不会产生褐化。

4、本发明的增殖培养基配方，平均增殖倍数达到了6.83倍，为“一种金花茶组培繁殖方法”的平均增殖倍数为4.6倍的1.48倍。而我们使用后者相近配方于云南金花茶上，其增殖倍数只有4.33倍。

5、本发明的生根培养基的生根率高，达到了100％。其中的凝固剂选用卡拉胶替代琼脂粉，降低了生产成本。并且不需生根苗的前期激素预处理，也不需芽生根前期护理，减少了操作环节，减少了切口褐化和污染发生的概率。

5、本发明在炼苗阶段，选用腐质土与红土，红土为腐质土的2倍，保证有效供给营养，兼顾基质的保水和透气。重要是，配比酸性红土使基质呈酸性，有利于云南金花茶的组培苗成活，30天移栽成活率达到95％以上。

6、本发明用白砂糖代替了蔗糖，降低了组培苗的生产成本。

本发明可实现云南金花茶种苗的的工厂化生产，为保护和开发云南金花茶这一濒危的名贵花卉资源提供了一种种苗遗传性状稳定、增殖速度快、生根苗质量好、移栽成活率高的方法。

附图说明

图1启动阶段，添加NAA时的生长情况，长势较差(40d)；

图2启动阶段，高浓度生长素导致诱导的芽基部产生大量愈伤组织(40d)；

图3启动阶段，正常生长的无菌小芽(40d)；

图4增殖阶段，激素配比问题导致增殖苗严重愈伤化(50d)；

图5增殖阶段，正常增殖的芽丛(50d)；

图6生根阶段，激素配比问题导致生根苗无法生根，且基部有较多愈伤组织(40d)；

图7生根阶段，正常的生根组培苗(40d)；

图8移栽成活的云南金花茶组培苗(125d)。

图9实施案例(增殖苗)

图10实施案例(生根苗)

图11实施案例(炼苗)

以下结合具体实施例对本发明方法做进一步说明，实施例包括但不限制本发明的保护范围。

具体实施方式

实施例1

设云南金花茶为组培培养基的集合G，G＝{<g₁，α₁>，<g₂，α₂>，<g₃，α₃>}，g₁、g₂、g₃分别是丛生芽增殖、增殖扩繁、生根的培养基，α₁，α₂，α₃分别是g₁、g₂、g₃的组合方式；

另一种的金花茶组培培养基的集合H，H＝{<h₁，β₁>，<h₂，β₂>，<h_n，β₃>}，h₁、h₂、h₃分别是丛生芽增殖、增殖扩繁、生根的培养基，β₁、β₂、β₃分别是h1、h2、h3的组合方式；

设f是G→H的映射，使集合G中第n个(n＝1，2，3)组培方法的植物激素a₁⁽ⁿ⁾，a₂⁽ⁿ⁾，…∈A_n，有f(a₁⁽ⁿ⁾)＝b₁⁽ⁿ⁾，f(a₂⁽ⁿ⁾)＝b₂⁽ⁿ⁾，…，且b₁⁽ⁿ⁾，b₂⁽ⁿ⁾，…∈h_n，h_n为集合H中的组培方法，那么，b₁⁽ⁿ⁾、b₂⁽ⁿ⁾，…与a₁⁽ⁿ⁾、a₂⁽ⁿ⁾，…具有激素的同构像，这两个系统是同构的。

本发明中，云南金花茶的植物激素与“一种嫩芽金花茶的组培快繁方法”的激素比较：愈伤组织培养基前者6-BA、IAA，后者6-BA、NAA；丛生芽增殖培养基前者6-BA、IAA，后者6-BA、NAA；生根培养基前者为IBA、NAA，后者为IAA、NAA。其中，丛生芽增殖或壮苗培养基可以与生根培养基兼并。因此，两者的组培各培养基具有同构像。尽管两者按植物学分类分属于金花茶不同种，这两个培养基激素是同构的，区别仅在于调整基本培养基的微量元素、激素的浓度、pH值以及部分环境条件。

实施例2：

(1)外植体的选择与消毒：于2015年3月在西南林业大学智能温室大棚内，选择生长健状，半木质化的云南金花茶的嫩枝，用剪刀剪下，带回实验室，在流水下冲洗10-20分钟，在冲洗过程中去除叶片，并切成3-4厘米长带1-3个叶腋的茎段，转移到消毒容器内。先用75％酒精喷洒在外植体上，使外植体湿润，再转移到超净工作台内，加入0.1％升汞，振荡消毒8-12min，最后用无菌水冲洗3～5次，备用。

(2)芽的诱导。将消毒后的茎段，切除两端3-5毫米，使其两端保持新鲜切口，斜插于启动培养基上，其培养基配方为：MS或WPM+1.0-2.0mg/L6-BA+0.1-0.5mg/L IAA中，培养基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L琼脂，pH值5.6-5.8。培养条件为：温度25±2℃，光照时间12h/d，光照强度1500-2000Lux。其平均腋芽诱导率超过90％。

(3)芽的增殖。将步骤(2)中长出的高度在2-3厘米小芽切割下来，接种到继代增殖培养基上培养，经50天的培养形成丛生芽，表1增殖培养基为：改良WPM+6-BA+TDZ+IAA组合及其结果，其中，改良WPM+3.0mg/L6-BA+0.1mg/L IAA组合效果较为突出，芽的增值系数为6.83，平均苗高3.5cm(见表1)，该培养基中附加30.0g/L白砂糖，4.5g/L琼脂，pH值5.8-6.0，培养条件同(2)。

表2增殖培养基为MS或WPM+6-BA+KT+IAA组合及其结果，各组合与表1较好增殖结果比较，差异较大；

表1不同激素配比对云南金花茶腋芽增殖的影响

注：表中相同列不同字母代表在0.05水平上差异显著，以下表2～4相同。

表2 6-BA与KT组合对云南金花茶增殖的影响

(4)生根培养。步骤(3)的丛生芽中的单个芽长至2-3厘米左右时，选取叶片舒展的单个芽，去除多余叶片，使叶片数保留1-3片。切取后接种到生根培养基上，生根培养6-7周左右，得到云南金花茶的生根苗(见表3)。其中，以生根培养基为：改良1/2MS+2.0mg/L IBA+0.3mg/L NAA+0.3g/L活性炭，生根率最高，达100％(见表4)。该培养基中附加15-20.0g/L白砂糖，4g/L卡拉胶，pH值5.6-5.8，培养条件同(2)。

表3不同生长素组合下的云南金花茶生根结果

表4云南金花茶生根配方的进一步筛选结果

(5)生根苗的移栽。生根的小苗移栽前先在室内自然光下培养7-10天左右，然后再取出生根苗，洗净根部周围的培养基，之后移栽到消过毒的基质中，移栽基质为红土:腐质土(体积比)＝2:1。移栽前一个月注意保温保湿和透气，空气相对湿度保持在70-80％，温度在20-30℃，一个月后小苗基本适应外界环境，其成活率达95％，然后转入正常的水肥管理。