利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性

摘要

本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性。分离得到一种能够提高拟南芥DON耐受能力和赤霉病抗性的基因TaMetRS。通过筛选小麦悬浮细胞抑制差减杂交cDNA文库及RACE克隆基因全长的方法，从小麦品种中分离得到一个受DON诱导的基因TaMetRS。利用农杆菌介导的遗传转化方法，使该基因在拟南芥中超量表达，提高了转基因拟南芥对DON耐受能力和对赤霉病的抗性，研究证实了该基因作为植物抗赤霉病功能的新用途。该基因的核苷酸序列是SEQ ID NO：1中1-2186位碱基对应的序列，编码596个氨基酸。该基因编码的蛋白质序列如SEQ ID NO：2所示。

说明书

技术领域

本发明属于小麦转基因技术领域。具体涉及利用小麦基因提高拟南芥的DON耐受性和FHB抗性。所述的基因分离克隆自TaMetRS基因，该基因被证实是一种具有新功能的MetRS基因，在植物的防御反应和脱毒过程中起着重要的作用。TaMetRS基因受到DON的诱导，定位于细胞核，参与细胞防御反应的调控。超表达该基因可以提高拟南芥对DON的耐受性及FHB的抗性。利用本发明的基因，可望提高植物的赤霉病抗性，为转基因小麦抗病育种提供新的安全的基因资源。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由禾谷镰刀菌为主引起的真菌性病害，主要发生在世界温暖潮湿和半潮湿地区，在我国主要发生在长江中下游地区，严重降低小麦产量和品质，威胁粮食安全。禾谷镰刀菌可以在苗期和花期侵染小麦引起苗腐病和穗腐病，并产生包括单端孢霉烯，玉米烯酮和伏马菌素等多种真菌毒素。作为单端孢霉烯类毒素中分布最广的deoxynivalenol(DON)毒素，已经成为世界范围内粮食及饲料的主要污染源之一。DON毒素能够抑制真核细胞蛋白质的生物合成，人或动物在食用含有DON毒素的食品后，会导致强烈的呕吐并破坏免疫系统，严重影响人和牲畜的健康。

MetRS基因的基本传统功能是催化甲硫氨酸(methionion)与相对应的tRNA的连接，形成Met-tRNA_i^Met，在蛋白的生物合成过程中起着至关重要的作用。但是同时MetRS在也具有其它重要的作用。MetRS可能在rRNA的生物合成中起着重要的作用，在哺乳动物中MetRS具有抑制癌细胞的活性，同时MetRS是人类非洲锥虫病抗寄生虫药物的靶标。但是到至今为止，还没有MetRS基因与DON抗性和FHB抗性有关的相关报道。在申请人的前期研究中，从小麦悬浮细胞的抑制差减杂交文库(suppression>

发明内容

本发明的目的涉及一个小麦的TaMetRS基因在控制植物赤霉病抗性改良中的应用。本发明分离和应用一种包含TaMetRS基因的DNA片段，该片段赋予拟南芥幼苗DON的抗性及花期FHB的抗性。其中所述的TaMetRS基因的核苷酸序列如列表SEQ ID NO：1所示，序列长度为2186bp，其中该基因的编码区是SEQ ID NO：1中70-1860位碱基对应的序列，该基因编码的蛋白质序列如列表SEQ ID NO：2所示，编码596个氨基酸。

具体地，本发明的技术方案如下所述：

一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中1-2186位碱基对应的序列。

一种受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)诱导的小麦基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的应用，该基因编码的蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本发明所述的应用的植物是拟南芥。

本发明的应用包括下列步骤：

利用PCR扩增小麦基因TaMetRS的编码区域，并在两端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点，连接到中间载体PTRAkc-VDM1-ERH中，得到植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS，利用农杆菌介导的遗传转化方法转化拟南芥，获得TaMetRS基因超量表达的转基因拟南芥，通过喷雾接种禾谷镰刀菌5035的孢子液，验证了转基因拟南芥的抗赤霉病能力。其中，所述的植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS包含有SEQ ID NO：1中70-1860位碱基对应的序列编码区域。

本发明中的培养基组分及配比如下所示：

农杆菌培养基(YEB)：营养肉汤5g+酵母提取物5g+蛋白胨5g+蔗糖5g，(15g/L琼脂)pH 7.0；1/2MS筛选培养基：MS大量(20×)25mL+MS有机(200×)5mL+MS铁盐(200×)2.5mL+MS微量(200×)2.5mL+100mg/L肌醇+20g/L蔗糖+50mg/L Kana，(6.3g/L琼脂)pH 5.8。

上述培养基在添加完各组分后，补加蒸馏水定容至1L，在121℃高压蒸汽下灭菌18分钟。培养基中涉及到的抗生素的灭菌采用过滤灭菌，在超净工作台内的无菌环境下加入到冷却到60℃的高压灭菌后的培养基中使用。

本发明的优点在于：

本发明克隆的TaMetRS基因可以提高拟南芥植株对真菌毒素DON的耐受性，并且显著提高了转基因拟南芥植株对赤霉病病原菌禾谷镰刀菌的抗性。

本发明所使用的植物超表达载体pTRAkc-35SS-TaMetRS能够在拟南芥中高效表达TaMetRS基因，使提高植物的赤霉病抗性成为可能。

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明克隆的小麦基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)的核苷酸序列，序列长度为2186bp，它对应的氨基酸序列(即编码区)是SEQ ID NO：1中70-1860位碱基对应的序列，编码596个氨基酸。

序列表SEQ ID NO：2是本发明的小麦基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)编码的的蛋白质序列。

序列表SEQ ID NO：3是从小麦的悬浮细胞的抑制差减杂交文库(SSH)中筛选得到390bp的EST片段的核苷酸序列。

图1：是本发明分离克隆TaMetRS基因及功能鉴定的总体技术路线图。

图2：TaMetRS基因的全长序列克隆。附图标记说明：图2中的A图为3’RACE产物；图2中的B图为5’RACE产物，图2中的C图为TaMetRS基因的全长cDNA。

图3.TaMetRS基因在郑麦9023(Z9)和苏麦3号(S3)两个小麦品种中，接种DON，禾谷镰刀菌5035和Tri5－孢子液后的表达模式。图3中的A图为小麦品种Z9和S3接种DON毒素后TaMetRS基因的表达模式；图3中的B图为小麦品种Z9和S3接种不同的禾谷镰刀菌菌株5035和Tri5－后的表达模式。

图3表明本发明的TaMetRS基因能被DON和产毒菌株禾谷镰刀菌5035诱导表达，而Tri5基因缺失的菌株Tri5－对TaMetRS基因的表达没有影响。

图4：中间载体PTRAkc-VDM1-ERH的结构图谱。

图5：本发明构建的植物超量表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS的结构图谱。

图6：转基因拟南芥的分子鉴定及表达量分析。。附图标记说明：图6中的A图为转基因拟南芥的PCR鉴定，引物为TaMetRS-F2/TaMetRS-R2，目的产物大小为1800bp；图6中的B图为转基因拟南芥中TaMetRS基因的表达量分析，扩展TaMetRS基因的引物为TaMetRS-F3/TaMetRS-R3，目的片段大小为bp；内参基因Actin的扩增引物为Actin-F/Actin-R，目的片段大小为135bp。

图7：T2代转基因拟南芥幼苗在不同浓度DON(0ppm、5ppm、10ppm及15ppm)条件下处理2周后的表型。

图8：T3代拟南芥接种禾谷镰刀菌5035孢子液后，7天和10天的表型

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在分离克隆包含有TaMetRS基因完整编码区段以及验证TaMetRS基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实施例1：分离克隆TaMetRS基因的全长序列。

从小麦的悬浮细胞的抑制差减杂交文库(SSH)中筛选得到390bp的EST片段，受到DON的强烈诱导(申请人的前期工作，未发表)，该序列如下：

AAAAGATGTCTTGCAACAGCTGAATCTCTGTCCGAATGAGCATATTTCTTTTGCCGATGAAAAGGGGGAGAGTGACAAGGCGAAAAGGCCTTGGGATCTTATACCATCAAACCACAGGATTGGGAAAATTGTGCCTTTGTTCACAGAGTTGAAAGATGATGCAGTGGATAGCTTCAGGGAAACATTTGCAGGCAGTCAGGCCGAAAGAAACGCAAGGGCTAATTAAAGAAGCCAATGAAGTTGTTGCCTAACTGGAAGCTGCAAAACATTTCTTGCAAAGTTGATCACAATACTTAATCAAATGACATTGAGATCCAGAAATGTGAGTTCGAAGGATGAATCACAATGTATATTTTACTGATTATTAGTGATGATGCATTCAGAAAATGT

根据该序列，申请人设计了两条上游引物和两条下游引物，分别是:3’RACE-F1/3’RACE-F2及5’RACE-R1/5’RACE-R2(见表1)，按照RACE试剂盒(购自Clontech公司)说明书操作，PCR反应体系的总体积为50μL，cDNA模板1uL(约100ng)、10×KOD plus buffer酶反应缓冲液5uL、2.5mM dNTP 5uL、10uM引物1.5uL、1uL KOD酶，加双蒸水至50μL。反应程序为：94℃变性5min，94℃30s、60℃30s、72℃3min、35个循环，72℃延伸5min。PCR扩增结果如图2，3’RACE得到501bp的片段(图2中的A图)，5’RACE得到1858bp的片段(图2中的B图)，二者拼接之后得到2186bp的片段(序列见SEQ ID NO：1)，设计引物TaMetRS-F1/TaMetRS-R1(表1)扩增TaMetRS全长并测序得到2186bp的片段(图2中的C图)。

表1基因克隆所用到的引物

表1的说明：引物名称后的英文字母F，R分别代表正向引物和反向引物。

实施例2：检测小麦品种中TaMetRS基因的表达模式

申请人选择两种小麦品种，郑麦9023(对FHB感病，国审品种，国审麦2003027，参见Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducible expression of a fusion protein containing a Fusarium-specific antibodyand a fungal chitinase protects wheat against Fusarium pathogens and mycotoxins.Plant Biotechnology Journal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)和苏麦3号(对FHB抗病，1970年由江苏地区农科所选育，对赤霉病高抗，参见Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducible expression of a fusion protein containing aFusarium-specific antibody and a fungal chitinase protects wheat against Fusarium pathogens and mycotoxins.Plant Biotechnology Journal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)，作为表达谱分析的材料。种子催芽后，置于4℃冰箱春花处理(催芽和春花处理是本领域的常识)2周，移栽至温室。在小麦杨花初期，选择生长状态一致的小麦穗子，用剪刀剪去麦穗中部小穗的麦芒，用微量注射器注入10uL，5×10⁵个/mL的孢子液或是无菌水或是15uL>TMⅢ(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物对TaMetRS-F3/TaMetRS-R3(见表1)基因进行特异的PCR扩增。同时用引物Actin-F/Actin-R对小麦Actin基因(AB181991)做特异扩增(扩增产物长135bp)，以作为内参基因进行定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，45个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析(荧光检测实时定量分析为本领域常用方法，参见文献：Li等，Resistance>－(由申请人所在试验室构建与保存的一种禾谷镰刀菌Tri5基因缺失突变菌株，参见Xu等，Disruption>

实施例3：TaMetRS基因超量表达载体的构建和转化拟南芥

PTRAkc-35SS-TaMetRS植物表达载体的构建

为了能更好的分析TaMetRS基因的功能，申请人将TaMetRS基因在拟南芥中超量表达。从转基因植株的表型研究该基因的功能。超量表达载体构建方法如下：以小麦品种郑麦9023(Z9)DON处理12h后的总RNA反转录得到的cDNA为模板，用引物TaMetRS-F2/TaMetRS-R2(请见表1)，扩增出包含TaMetRS基因完整编码区的cDNA片段(见序列表SEQ ID NO:1所示的序列)，在该cDNA片段的两端分别添加EcoRI和BamHI酶切位点，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸5min。PCR产物电泳后，切取1800bp左右的目的片段，用DNA片段回收试剂盒(购自Axgen公司)，向凝胶中加入3倍体积的DE-A缓冲液(试剂盒自带)，75℃水浴溶解6min，使凝胶完全溶解后，加入1.5倍体积的DE-B缓冲液(试剂盒自带)，移入回收柱中，以12000rpm离心1min，弃流出的液体，向回收柱中加入500ul washing buffer 1，12000rpm离心1min，再向回收柱中加入700ul washingbuffer 2，12000rpm再离心1min，重复用washing buffer 2洗涤一次，加入25ul elution buffer，静置2min后，12000rpm离心2min，得到纯化的PCR产物即TaMetRS基因，将上述纯化后的PCR产物分别用EcoRI和BamHI酶切后，无水乙醇沉淀回收。同时也将载体PTRAkc-VDM1-ERH(见图4，由华中农业大学麦类作物分子生物技术试验室改造)分别用EcoRI和BamHI酶切后，切胶回收，最后将酶切好的目的片段用T4DNA ligase(Transgene)连接到载体骨架中，构建得到超量表达载体，其后转化大肠杆菌DH5α，通过筛选阳性克隆，得到重组载体的PTRAkc-35SS-TaMetRS(图5)。

转基因植株的遗传转化与筛选鉴定

TaMetRS基因的遗传转化

通过农杆菌介导的拟南芥遗传转化方法将上述超表达载体PTRAkc-35SS-TaMetRS转入到拟南芥中，农杆菌介导的拟南芥的遗传转化方法是参考Zhang Xiuren等人报道的方法(Zhang Xiuren等，Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method，Nature protocols，1:641-646，2006)。具体操作步骤如下：拟南芥培养至顶生花序约3cm时，去除其顶生花序以刺激侧生花序生长。在侧生花序长至6～10cm时进行转化。转化前使土壤吸足水分，并将已授粉的小花及幼嫩角果去除。根癌农杆菌划线培养至出现单菌落，挑取单菌落至5ml YEB培养基中，28℃、200r/min振荡培养40h，按1：100比例接种至50ml YEB培养基中，28℃、200r/min振荡培养至OD₆₆₀达0.8左右，6000r/min离心15min收集菌体，用等体积转化重悬液重悬菌体沉淀。将拟南芥植株莲座叶以上部分全部浸入重悬液中，保持15sec。转化后的植株平放于铺有润湿滤纸的托盘中，盖上保鲜膜以保持湿度，1h后，按照同样的方法再处理一次。黑暗条件下保持24h后将植株取出直立，于22℃、8h光照条件下培养。待植株正常开花结实后收获种子，干燥后-20℃保存备用。收获的种子放入离心管中，先用浓度为70％酒精处理1min，再用0.15％次氯酸溶液处理2min，无菌水清洗数次；播种在1/2MS培养基(pH>

转基因阳性植株的分子鉴定与表达量分析

提取转基因T0植株新鲜叶片提取DNA(使用植物基因组DNA提取试剂盒，购自天根生化科技(北京)有限公司产品)，目的基因引物TaMetRS-F2/TaMetRS-R2进行PCR阳性检验，结果见图6中的A图。

转基因阳性植株TaMetRS基因的表达量分析

利用Trizol(购自Invitrogen公司)试剂提取转基因阳性植株MetRS-1和MetRS-2的总RNA(试验步骤按照Trizol试剂说明书操作)。利用反转录酶SuperScript^TMⅢ(购自Invitrogen公司)将其反转录合成cDNA(方法根据Invitrogen公司反转录酶试剂说明书)，反应条件为：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反转录合成的cDNA为模板，用引物对TaMetRS-F3/TaMetRS-R3(见表1)基因进行特异的PCR扩增。同时用引物Actin-F/Actin-R对小麦Actin基因(AB181991)做特异扩增(扩增产物长135bp)，以作为内参基因进行半定量分析。反应条件为：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，28个循环。电泳检测PCR产物的浓度。结果表明(见图6的B图)，TaMetRS基因在转基因植株中大量表达。

实施例4：TaMetRS超量表达转基因T₂/T₃代株系在DON胁迫下的生长状况

本实施例选取本发明的转TaMetRS基因的超量表达的T₂代株系(编号为MetRS-1)进行了不同浓度的DON胁迫试验。具体步骤如下：将超量表达转基因株系(MetRS-1)种子按常规方法消毒(先用浓度为70％酒精处理1min，再用0.15％次氯酸溶液处理2min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，将野生型拟南芥(非转基因，简称WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，在4℃春化处理2天，置于20℃，生长7天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有0ppm、5ppm、10ppm及15ppm四种不同浓度DON的1/2MS培养基上。生长2周后，测量转基因植株和野生型植株的根长和鲜重，试验重复3次，每次每个株系20株苗。试验结果表明(图7)，在0ppm和5ppm两种浓度DON的条件下，野生型和转基因植株的根长和鲜重没有明显差异，但是DON能够抑制拟南芥的生长。在10ppm及15ppm>

不同转基因株系(编号为MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃株系在15ppm>2/T₃种子消毒(浓度为70％酒精处理1min，0.15％次氯酸处理2min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型拟南芥(WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，4℃春化2天，置于20℃，生长7天后挑选发芽好且长势一致的种子转移到含有15ppm>2/T₃材料在15ppm>

表2转基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃材料在15ppm>

a表示在0.05水平具有显著性差异

b表示在0.01水平具有显著性差异

实施例5：TaMetRS超量表达转基因T₂代株系的FHB抗性分析

本实施例选取了本发明的不同转基因株系(编号为MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃株系，接种禾谷镰刀菌5035孢子液，浓度为5×10⁵个/ml后，分析植株的发病情况。具体步骤如下：将超量表达转基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃种子消毒(浓度为70％酒精处理1min，0.15％次氯酸处理2min，无菌水清洗数次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上发芽，野生型拟南芥(WT)播种于不含卡那霉素的1/2MS培养基上，4℃春化处理2天，置于20℃，生长7天后移栽到小钵中。试验用的土壤为炭泥土：蛭石：珍珠岩＝2：1：1(重量比)混合而成。置于短光照条件(8小时光照/16黑暗)20℃生长35天左右，此时拟南芥开花比较茂盛，选取生长状态比较一致的植株，进行禾谷镰刀菌5035孢子喷雾接种，每株均匀喷雾一次。具体接种方法如下：调整好浓度的孢子液添加0.001％的Silwet>

拟南芥调查主要对花序(F)、老角果(OS)及新角果(NS)发病情况进行统计，最终的发病指数(Fusarium-Arabidopsis disease，FAD)是三者之和，即FAD value＝F+NS+OS具体打分标准见表3(Urban等，Arabidopsis is susceptible to the cereal ear blight fungal pathogens Fusarium graminearum and Fusariumculmorum，The Plant Journal，32:961-973)。

表3拟南芥接种禾谷镰刀菌5035调查统计方法

结果表明，转基因植株在第7天和第10天的FAD值均要低于野生型(表4)。其中，T₂代转基因株系MetRS-1在第7天和第10天的FAD值为6.59和8.41，与WT相比分别降低了41％和38％，而MetRS-2在第7天和第10天的FAD值为5.10和5.91，与WT相比分别降低了55％和57％，T3代转基因株系的FAD值也明显降低(图8)。因此上述结果说明，在拟南芥中超表达TaMetRS基因可以提高植株的FHB抗性。

表4拟南芥接种禾谷镰刀菌5035后的发病指数(FAD)调查

b表示在0.01水平具有显著性差异。