一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法

摘要

本发明公开的一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法：向黄酮化合物标准品母液中加醋酸盐缓冲液，用分光光度计对其波谱扫描得到对照组图；分别用五种胺盐与黄酮化合物标准品母液在醋酸盐缓冲液中反应，用分光光度计波谱扫描反应物，将结果与对照组图比较；在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液，经循环伏安法检测得电化学发光基准图；在五个毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液并加入五种溶液，经循环伏安法检测得五种对照图，经对比得到电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂；在进行后续处理完成检测。本发明毛细管电泳电化学发光检测方法具有样品消耗少及分析结果不受样品氧化干扰的优点。

说明书

技术领域

本发明属于化合物检测方法技术领域，具体涉及一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法。

背景技术

黄酮类化合物(flavonoids)是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮(flavone)结构的化合物，它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，如：向天果、槐米中的芦丁和陈皮中的陈皮苷，均能降低血管的脆性及改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，用于防治老年高血压和脑溢血。由银杏叶制成的舒血宁片含有黄酮和双黄酮类，主要用于冠心病及心绞痛的治疗。全合成的乙氧黄酮又名心脉舒通或立可定，有扩张冠状血管、增加冠脉流量的作用。许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，还能护肝、可解肝毒、抗真菌，用于治疗急/慢性肝炎及肝硬化。

毛细管电泳电化学发光技术(英文名称为：Capillary Electrophoresis Electrochemiluminescence，简称：CE-ECL)兼有CE微量(即样品消耗量少)、迅速、高效和ECL高选择性及高灵敏性(检测限可达10^-12-10^-18mol/L)等特点。联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)电化学发光是一种高灵敏度的检测手段，其技术简单、灵敏度高、线性范围宽、分析控制性强，无须外加光源及分光系统，避免了杂散光和光源不稳定的影响。联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)与CE-ECL联用技术是兼备高效电泳分离和灵敏电化学检测的一种极具应用潜力的新型分析技术。胺类化合物在联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)体系中具有良好的电化学发光效应。近年来，毛细管电泳电化学发光被广泛应用于含氨基团物质和胺类药物的研究。

就现有技术而言，黄酮类化合物的分析检测通常是使用紫外分光光度法、高效液相色谱及液相质谱联用等技术，但这些方法普遍存在样品消耗量大的问题，无法对某些特殊珍贵的微量样品进行分析检测。而采用毛细管电泳电化学发光技术对黄酮类化合物进行检测分析则具有检测限低、样品消耗少及分离效率高的技术优势。另外，黄酮类化合物普遍存在化学性质不稳定的特点，容易在样品分析或储藏过程中发生氧化还原反应导致分析结果不准确，而将黄酮类化合物衍生为稳定的叔胺类化合物，能降低样品氧化造成的分析结果不准确的风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，具有检测限低、样品消耗少及分离效率高的优点。

本发明所采用的技术方案是，一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、吸取黄酮化合物标准品母液，向吸取的黄酮化合物标准品母液中添加醋酸盐缓冲液，经混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度计对溶液Ⅰ-A进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-A；分别采用二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺与黄酮化合物标准品母液在醋酸盐缓冲液中反应，得到五种溶液，用紫外分光光度计波谱扫描法分别检验五溶液，并将得到结果与对照组图Ⅰ-A进行比较，判断是否发生叔胺衍生化反应；

步骤2、在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液，经循环伏安法检测，待稳定后获得电化学发光基准图，即图Ⅱ-A；分别在五个毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液，再分别加入经步骤1得到的五种溶液，分别经循环伏安法检测，待稳定后获得五种对照图，将得到的五种对照图与图Ⅱ-A进行对比，确定出电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂；

步骤3、待步骤1和步骤2完成后，制备出黄酮化合物标准品衍生化母液，并对实验条件进行优化，获得线性范围、检测限、精密度、稳定性及加样相对回收率，以完成毛细管电泳电化学发光检测。

本发明的特点还在于：

步骤1具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、吸取250μL浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液，向吸取的黄酮化合物标准品母液中添加2500μL醋酸盐缓冲液，经混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度计对溶液Ⅰ-A进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-A；

分别取五份浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液，且每份的量均为250μL；先向这五份黄酮化合物标准品母液中均添加2500μL醋酸盐缓冲液；再分别加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，经振荡充分混匀后，静置3min，分别得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度计分别进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-B-二甲胺，图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺、图Ⅰ-B-二戊胺；

步骤1.2、将步骤1.1中获得的对照组图Ⅰ-B-二甲胺、图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺及图Ⅰ-B-二戊胺分别与对照组图Ⅰ-A与进行比较，根据吸收峰值的变化，判断是否发生了叔胺衍生化反应。

步骤1.1中采用的醋酸盐缓冲液的浓度为0.4mol/L，pH值为4.5。

步骤2具体按照以下步骤实施：

步骤2.1、在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，经循环伏安法检测，待稳定后获得电化学发光基准图，即图Ⅱ-A；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二甲胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二甲胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二乙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丁胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二戊胺；

步骤2.2、将经步骤2.1得到的图Ⅱ-B-二甲胺、图Ⅱ-B-二乙胺、图Ⅱ-B-二丙胺、图Ⅱ-B-二丁胺及图Ⅱ-B-二戊胺分别与图Ⅱ-A进行比较，确定出电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂：二丙胺。

步骤2中联吡啶钌电化学发光液包括有5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺和50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液。

步骤3具体按照以下步骤实施：

黄酮化合物标准品衍生化母液具体按照以下步骤制备：

在容器内依次加入84μL的醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)、10μL浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液及3μL的二丙胺，混合均匀后静置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺经反应后成为三丙胺，即得到浓度为10mg/L～20mg/L的黄酮化合物标准品衍生化母液；

优化实验条件具体按照以下方法实施：

将浓度为10mg/L～20mg/L的黄酮化合物标准品衍生化母液作为待检样品，进样缓冲液采用硼酸盐缓冲液，进行毛细管电泳电化学发光实验条件优化，依次优化进样缓冲液-硼酸盐缓冲液浓度10mmol/L～200mmol/L，进样缓冲液-硼酸盐缓冲液pH 5.0～8.5，检测电位，分离电压、进样电压和进样时间，完成对实验条件的优化；

线性范围的获得方法具体如下：

线性范围的获得方法具体如下：

对检测终浓度为10ng/mL～2000ng/mL范围内黄酮化合物标准品衍生化母液，以浓度递增20％方式从10ng/mL开始设置浓度梯度，将获得的数据进行回归方程分析，将相关性系数R²＞9.5的区域视为线性范围；

检测限：S/N＝3时的浓度为检测限浓度，S为峰高，N为基线噪音，即峰高约在基线噪音高的3倍；

精密度：在线性范围内，随机选择固定浓度的黄酮标准品衍生化母液进行5～10次重复检测，得到其迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差，即RSD，标准偏差与计算结果算术平均值的比值，以验证该检测方法的精密度；

稳定性：每隔12h，重复精密度的操作过程，持续48h，验证该方法的稳定性。

加样相对回收率：在已知浓度的样品里加该样品量的80％、100％、120％的对照品，然后测定结果各3次共9次，将得到的结果减去已知的量再除以加入量即为回收率，回收率试验至少要进行3次试验，n＝3，或三组平行试验n＝6。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，与现有的紫外分光光度法、液相色谱法及液相质谱联用等方法相比，具有样品消耗少(pL级)、设备简单及分辨率高的优点，非常适合珍贵样品的分析检测。

(2)本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法其原理是：利用黄酮类化合物含有酮式羰基，可与仲胺在酸性条件下反应生成叔胺类化合物，形成的叔胺类化合物可利用毛细管电泳电化学发光技术检测。

(3)本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，经衍生化以后，将黄酮类化合物衍生为化学性质稳定的叔胺类化合物，降低了样品氧化造成的分析结果不准确的风险。

(4)本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，具有分离效率好、灵敏度高、样品消耗量少、分析周期短、分析设备简单以及设备可小型化的特点。

附图说明

图1是实施例中的对照组图Ⅰ-A；

图2是实施例中的图Ⅰ-B-二甲胺；

图3是实施例中的图Ⅰ-B-二乙胺；

图4是实施例中的图Ⅰ-B-二丙胺；

图5是实施例中的图Ⅰ-B-二丁胺；

图6是实施例中的图Ⅰ-B-二戊胺。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。

毛细管电化学发光技术不能检测黄酮类化合物，但是联吡啶钌(Ru(bpy)₃²⁺)与叔胺类化合物可以发生电化学发光反应，且具有很强的发光效应。若能利用衍生化反应，将黄酮类化合物转化为叔胺类化合物，则可使用毛细管电泳电化学发光技术实现检测黄酮类化合物的目的。

黄酮类化合物结构中都含有酮基，其结构式具体如下：

含有酮基的化合物在酸性条件下能与仲胺反应生成叔胺类化合物，其反应式具体如下：

本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、吸取黄酮化合物标准品母液，向吸取的黄酮化合物标准品母液中添加醋酸盐缓冲液，经混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度计对溶液Ⅰ-A进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-A；分别采用二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺与黄酮化合物标准品母液在醋酸盐缓冲液中反应，得到五种溶液，用紫外分光光度计波谱扫描法分别检验五溶液，并将得到结果与对照组图Ⅰ-A进行比较，判断是否发生叔胺衍生化反应，具体按照以下步骤实施：

步骤1.1、吸取250μL浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液，向吸取的黄酮化合物标准品母液中添加2500μL醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)，经混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度计对溶液Ⅰ-A进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-A；

分别取五份浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液，且每份的量均为250μL；先向这五份黄酮化合物标准品母液中均添加2500μL醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)；再分别加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，经振荡充分混匀后，静置3min，分别得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度计分别进行波谱扫描，获得对照组图Ⅰ-B-二甲胺，图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺、图Ⅰ-B-二戊胺；

步骤1.2、将步骤1.1中获得的对照组图Ⅰ-B-二甲胺、图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺及图Ⅰ-B-二戊胺分别与对照组图Ⅰ-A与进行比较，根据吸收峰值的变化(吸收峰发生蓝移或者消失，且峰高趋向于扁平变化，则认为发生了叔胺衍生化反应)，判断是否发生了叔胺衍生化反应。

步骤2、在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液，经循环伏安法检测，待稳定后获得电化学发光基准图，即图Ⅱ-A；分别在五个毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液，再分别加入经步骤1得到的五种溶液，分别经循环伏安法检测，待稳定后获得五种对照图，将得到的五种对照图与图Ⅱ-A进行对比，确定出电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂，具体按照以下方法实施：

步骤2.1、在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，经循环伏安法检测，待稳定后获得电化学发光基准图，即图Ⅱ-A；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二甲胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二甲胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二乙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丁胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二戊胺；

步骤2.2、将经步骤2.1得到的图Ⅱ-B-二甲胺、图Ⅱ-B-二乙胺、图Ⅱ-B-二丙胺、图Ⅱ-B-二丁胺及图Ⅱ-B-二戊胺分别与图Ⅱ-A进行比较，确定出电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂，比如：二丙胺。

步骤3、待步骤1和步骤2完成后，制备出黄酮化合物标准品衍生化母液，并对实验条件进行优化，获得线性范围、检测限、精密度、稳定性及加样相对回收率，以完成毛细管电泳电化学发光检测，具体方法分别如下：

黄酮化合物标准品衍生化母液具体按照以下步骤制备：

在容器内依次加入84μL的醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)、10μL浓度为100mg/L～200mg/L的黄酮化合物标准品母液及3μL的二丙胺，混合均匀后静置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺经反应后成为三丙胺，即得到浓度为10mg/L～20mg/L的黄酮化合物标准品衍生化母液；

优化实验条件具体按照以下方法实施：

将浓度为10mg/L～20mg/L的黄酮化合物标准品衍生化母液作为待检样品，进样缓冲液采用硼酸盐缓冲液，进行毛细管电泳电化学发光实验条件优化，依次优化进样缓冲液-硼酸盐缓冲液浓度10mmol/L～200mmol/L，进样缓冲液-硼酸盐缓冲液pH 5.0～8.5，检测电位，分离电压、进样电压和进样时间，完成对实验条件的优化；

线性范围的获得方法具体如下：

对检测终浓度为10ng/mL～2000ng/mL范围内黄酮化合物标准品衍生化母液，以浓度递增20％方式从10ng/mL开始设置浓度梯度，将获得的数据进行回归方程分析，将相关性系数R²＞9.5的区域视为线性范围；

检测限：S/N＝3时的浓度为检测限浓度，S为峰高，N为基线噪音，即峰高约在基线噪音高的3倍；

精密度：在线性范围内，随机选择固定浓度的黄酮标准品衍生化母液进行5～10次重复检测，得到其迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD，标准偏差与计算结果算术平均值的比值)，以验证该检测方法的精密度；

稳定性：每隔12h，重复精密度的操作过程，持续48h，验证该方法的稳定性。

加样相对回收率：在已知浓度的样品里加该样品量的80％、100％、120％的对照品，然后测定结果各3次共9次，将得到的结果减去已知的量再除以加入量即为回收率，回收率试验至少要进行3次试验(n＝3)，或三组平行试验(n＝6)。

实施例

矢车菊-3-O-葡萄糖苷的毛细管电泳电化学发光检测方法：

目前，将主要的天然黄酮类化合物分类为：黄酮类(flavones)、黄酮醇(flavonol)、二氢黄酮类(flavonones)、二氢黄酮醇类(flavanonol)、花色素类(anthocyanidins)、黄烷-3，4二醇类(flavan-3,4-diols)、双苯吡酮类(xanthones)、查尔酮(chalcones)和双黄酮类(biflavonoids)等十五种；其中，自然界中花色素类化合物约有600多种；

这里以矢车菊-3-O-葡萄糖苷的毛细管电泳电化学发光检测方法为例进行说明，具体如下：

取100mg/L～200mg/L的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品母液250μL，并向其中添加2500μL醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)，经混合后得到溶液Ⅰ-A，用紫外分光光度计计进行波谱扫描，如图1所示，获得对照组图Ⅰ-A；

分别取五份浓度为100mg/L～200mg/L的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品母液，且每份的量均为250μL；先向这五份矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品母液中均添加2500μL醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)；再分别加入二甲胺、二乙胺、二丙胺、二丁胺、二戊胺各80μL，经振荡充分混匀后，静置3min，分别得到溶液Ⅰ-B-二甲胺，溶液Ⅰ-B-二乙胺、溶液Ⅰ-B-二丙胺、溶液Ⅰ-B-二丁胺、溶液Ⅰ-B-二戊胺；最后用紫外分光光度计分别进行波谱扫描，分别如图2、图3、图4、图5及图6所示，获得对照组图Ⅰ-B-二甲胺，图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺、图Ⅰ-B-二戊胺；

将获得的对照组图Ⅰ-B-二甲胺、图Ⅰ-B-二乙胺、图Ⅰ-B-二丙胺、图Ⅰ-B-二丁胺及图Ⅰ-B-二戊胺分别与对照组图Ⅰ-A与进行比较，根据吸收峰值的变化，判断是否发生了叔胺衍生化反应；将图2～图6分别与图1对比可知：吸收峰发生蓝移或者消失，且峰高趋向于扁平变化；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，经循环伏安法检测，待稳定后获得电化学发光基准图，即图Ⅱ-A；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/L>

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二乙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二乙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丙胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丙胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二丁胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二丁胺；

在毛细管电泳电化学发光检测池中加入联吡啶钌电化学发光液(5mmol/L的Ru(bpy)₃²⁺，50mmol/LpH7.8的硼酸盐缓冲液)300μL，再加入1μL经步骤1得到的溶液Ⅰ-B-二戊胺，经循环伏安法检测，待稳定后获得图Ⅱ-B-二戊胺；

步骤2.2、将经步骤2.1得到的图Ⅱ-B-二甲胺、图Ⅱ-B-二乙胺、图Ⅱ-B-二丙胺、图Ⅱ-B-二丁胺及图Ⅱ-B-二戊胺分别与图Ⅱ-A进行比较，确定出电化学发光信号最强的叔胺衍生化反应试剂，即二丙胺；

毛细管电泳电化学发光分析方法的实施具体如下：

矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品衍生化母液的制备具体如下：

在容器中依次加入84μL的醋酸盐缓冲液(0.4mol/L，pH 4.5)，10μL浓度为100mg/L～200mg/L矢车菊花青苷标准品母液及3μL的二丙胺，混合均匀后静置3min，之后再加入3μL的甲醛，使多余的二丙胺经反应后形成三丙胺，得到浓度为10mg/L～20mg/L矢车菊-3-O-葡萄糖苷衍生化母液；

对实验条件进行优化处理，方法具体如下：

以制备得到的浓度为10mg/L～20mg/L矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品衍生化母液为待检样品，进样缓冲液为硼酸盐缓冲液，进行毛细管电泳电化学发光实验条件优化，依次优化进样缓冲液浓度10mmol/L～200mmol/L，进样缓冲液pH 5.0～8.5，检测电位，分离电压、进样电压，进样时间，以完成实验条件优化处理；

获取线性范围、检测限、精密度、稳定性、加样相对回收率，具体如下：

在最佳检测条件下，测定系列不同浓度的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品衍生化母液浓度，并绘制标准曲线，经计算获得线性范围及检测限；

在线性范围内，随机选择固定浓度的矢车菊-3-O-葡萄糖苷标准品衍生化母液进行5～10次重复检测，得到其迁移时间、峰高、峰面积的相对标准偏差(RSD)，以验证该检测方法的精密度；每隔12小时，重复此过程，持续48小时，验证该方法的稳定性。

加样相对回收率：在已知矢车菊-3-O-葡萄糖苷浓度的样品里加该样品量的80％、100％、120％的对照品，然后测定结果各3次共9次，结果减去已知的量再除以加入量就是回收率；回收率试验至少需进行3次试验(n＝3)，或三组平行试验(n＝6)。

本发明一种黄酮类化合物的毛细管电泳电化学发光检测方法，具有检测限低、样品消耗少及分离效率高的优点。