单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，其包括(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行Protein A亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。本发明的方法采用了病毒灭活后深层过滤，同时对Protein A亲和层析和病毒灭活后的深层过滤工艺进行优化，通过Protein A亲和层析和病毒灭活后深层过滤两个纯化步骤就可将通过深层过滤收集的培养液上清中HCP的含量降至2.3ppm，经过进一步的阴和阳离子交换层析可将HCP的含量降至0.4ppm。

说明书

技术领域

本发明涉及单克隆抗体的纯化技术，更具体地说涉及单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法。

背景技术

现阶段单克隆抗体下游工艺平台一般主要包括发酵液澄清、捕获步骤、精纯步骤、病毒灭活与过滤、超滤浓缩。

随着CHO细胞大规模培养技术的发展，细胞的蛋白表达水平得到了很大的提高，但伴随培养过程中外源营养物质的大量添加和细胞密度的呈数量级的增加，所以细胞培养产物中的成分越来越复杂。宿主蛋白HCP(Host Cell Protein)就是其中一种复杂的污染物，宿主蛋白HCP的复杂性和异质性取决于表达系统、细胞株或者细胞培养条件。不同细胞株或者相同细胞株不同的上游细胞培养条件均会对宿主蛋白HCP污染物的种类和含量有较大影响。

宿主蛋白HCP污染物的清除在生物制药工艺开发中是需要非常关注的，其在药物开发中的危险性在于其可以引起免疫原反应，为了保证病人用药的安全性这些过程相关的杂质需要被清除到一个低的水平，无论是在小试还是在放大阶段都是需要特别注意的，建立有效的去除宿主蛋白HCP的下游工艺条件并且在每一步工艺后有效的监控宿主蛋白HCP的去除效率，最终使其含量符合标准也是非常必要的。对于单克隆抗体工艺平台中HCP的去除方法主要包括深层过滤和层析方法。

深层过滤：发酵液澄清深层过滤来完成培养液中的细胞和细胞碎片的去除。发酵料液的杂质主要包含完整细胞、死亡细胞产生的碎片、宿主蛋白HCP、DNA和可溶性小分子。深层过滤膜采用了疏松多空的纤维素骨架结构，并填充了硅藻土成分，进样端的表面孔径成漏斗状，这些结构摈弃了传统微滤表面截留结构易造成阻塞、过滤效率低的缺点，又具备了离心机所没有的截留小体积细胞碎片的优势，同时依靠硅藻土的吸附作用，能截留高达50％的DNA和15％的宿主蛋白HCP，这一点是其他处理方式所不具备的。

层析方法包括粗纯步骤中的Protein A亲和层析和精纯步骤中的离子层析(阴离子交换层析和阳离子交换层析)，Protein A亲和层析由于其对单克隆抗体和Fc融合蛋白吸附的特异性其他杂质较难与Protein A色谱相结合，可以清除很大比例的收获的细胞培养液中杂质。已有数据表明Protein A亲和色谱层析可以有效的去除大于90％的宿主蛋白HCP，大多数的宿主蛋白HCP污染物经Protein A亲和色谱时不与色谱结合而直接流穿。精纯步骤中的阴和阳离子交换层析可以去除其他仍然残留的微量杂质包括残留的工艺相关的杂质如：宿主蛋白HCP，DNA，内毒素，脱落蛋白A(leached Protein A)和培养基添加物，和产品相关杂质如：高分子量聚体(Aggregate)，低分子量碎片。通常单克隆抗体经过粗纯步骤后各种杂质含量均已降低，但为了用药安全，还需精纯步骤进一步将杂质含量去除到原液质量标准以下。

传统的单克隆抗体工艺平台中深层过滤、Protein A亲和层析、一步或者两步精纯层析等几种下游纯化工艺均需要对HCP进行有效去除的去除，才能逐步将HCP含量降至可接受标准之内，但是HCP的含量很难被降低到10ppm，尤其是1ppm以下。

发明内容

本发明为克服现有技术中存在的问题而提供一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法。

本发明一方面提供了一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，该方法包括以下步骤：

(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；

(2)对步骤(1)得到的滤出液进行Protein A亲和层析；

(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。

在本发明的另一个优选例中，所述细胞培养液是CHO细胞培养液。

在本发明的另一个优选例中，步骤(2)中Protein A亲和层析利用Protein ADiamond作为亲和层析的填料。

在本发明的另一个更优选例中，Protein A亲和层析所用的淋洗液为25mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH 7.4±0.2。在本发明的另一个更优选例中，Protein A亲和层析所用的洗脱液为100mM乙酸-乙酸钠pH 3.6±0.2。

在本发明的另一个优选例中，步骤(3)深层过滤使用X0HC深层过滤膜。

在本发明的另一个优选例中，病毒灭活为S/D病毒灭活。

在本发明的另一个更优选例中，S/D病毒灭活使用磷酸三丁酯(TnBP)作为助溶剂，使用聚山梨酯80作为表面活性剂。在本发明的另一个更优选例中，S/D病毒灭活中所用磷酸三丁酯的重量浓度为0.3％，所用聚山梨酯80的重量浓度为1％，在本发明的另一个更优选例中，S/D病毒灭活过程为将步骤(2)得到的样品的pH值调节至5.2±0.2，加入S/D至终浓度为0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室温孵育0.8-1.2小时。

在本发明的另一个优选例中，步骤(3)得到的样品中宿主蛋白的含量为2.3ppm。

在本发明的另一个优选例中，本发明的方法进一步包括依次用阴离子交换层析和阳离子交换层析处理步骤(3)所得的样品。

本发明再一方面提供了一种含有低含量宿主蛋白的单克隆抗体制品，所述单克隆抗体制品按照以下方法制备：

(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；

(2)对步骤(1)所得的滤出液进行Protein A亲和层析；

(3)对步骤(2)所得的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤；

(4)对步骤(3)所得的样品进行阴离子交换层析；

(5)对步骤(4)所得的样品进行阳离子交换层析；

(6)对步骤(5)所得的样品进行超滤浓缩。

在本发明的另一个优选例中，本发明提供的单克隆抗体制品中宿主蛋白不高于0.3ppm。在本发明的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.3ppm。在本发明的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.2ppm。在本发明的另一个优选例中，单克隆抗体制品中宿主蛋白为0.1ppm。

具体实施方式

针对现有技术中单克隆抗体下游纯化过程中宿主蛋白去除方面存在的缺陷，本发明人经过深入的研究，将病毒灭活后的样品用深层过滤处理，进一步优化了Protein A亲和层析的条件和病毒灭活后的深层过滤条件。使用本发明的方法，可有效地将单克隆抗体制品中的宿主蛋白去除。在此基础上完成了本发明。

因此本发明提供了一种单克隆抗体下游纯化过程中有效去除宿主蛋白的方法，该方法包括(1)深层过滤细胞培养液，收集滤出液；(2)对步骤(1)得到的滤出液进行ProteinA亲和层析；(3)对步骤(2)得到的样品进行病毒灭活，并对病毒灭活后的样品进行深层过滤，由此有效地去除包含单克隆抗体的样品中的宿主蛋白。

本发明的方法中，单克隆抗体没有特别的限制，其可以是任何类型的单克隆抗体，例如IgG、IgA、IgE、IgD、IgM等类型。

本发明的方法中，单克隆抗体是体外发酵生产的，使用的哺乳动物细胞包括但不局限与目前通过的各种杂交瘤细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。优选的是CHO细胞。

本发明的方法中，通过深层过滤细胞培养液收集滤出液过程中对深层过滤没有特别的要求，所用的深层过滤膜和过滤条件只要能够使得到的滤出液可用于下一步的Protein A亲和层析都是可以接受的。该步骤中所用深层过滤膜可以使用与病毒灭活后深层过滤步骤相同的过滤膜，也可以使用不相同的过滤膜。该步骤用于除去发酵料液的部分杂质，包含完整细胞、死亡细胞产生的碎片、宿主蛋白HCP、DNA和可溶性小分子。

本发明的方法中，Protein A亲和层析用于清除很大比例的细胞培养液中的杂质，尤其是宿主蛋白HCP，因为大多数的宿主蛋白HCP污染物经Protein A亲和色谱时不与色谱结合而直接流穿。作为本发明的优选方式，Protein A亲和层析使用Protein A Diamond(博格隆)作为柱填料，使用该填料时优选淋洗缓冲液25mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4±0.2。

本发明的方法中，病毒灭活可以采用本领域的常规技术，只要所述技术对单克隆抗体分子不构成破坏，并且不影响其后续处理。本发明针对重组抗血管内皮生长因子(VEGF)人源化单克隆抗体，优选的病毒灭活采用S/D(溶剂/去污剂)处理，更优选地使用助溶剂为0.3％磷酸三丁酯，表面活性剂为1％聚山梨酯80。

本发明的方法中，病毒灭活后再次引入深层过滤用于除去在灭活的过程中产生的一些不溶性杂质，降低溶液浊度，同时可以去除其他不溶性杂质例如：宿主蛋白HCP，聚体，脂类蛋白，DNA等。作为本发明的优选方式，病毒灭活后深层过滤选择深层过滤膜X0HC能够有效地去除上述杂质。

本发明的方法通过将深层过滤应用于病毒灭活后的样品的过滤，同时对ProteinA亲和层析和病毒灭活后的深层过滤工艺进行优化选择。深层过滤细胞培养液收集到的滤出液通过Protein A亲和层析和病毒灭活后深层过滤两个纯化步骤就可以将宿主蛋白HCP的含量降至2.3ppm。病毒灭活后深层过滤得到的样品经过进一步的阴离子交换层析和阳离子交换层析可将宿主蛋白HCP的含量降至0.4ppm，再经过进一步的超滤浓缩制备的单克隆抗体原液中宿主蛋白HCP的含量可降至0.3ppm。同时本发明的方法清除了对宿主蛋白HCP检测存在干扰的导致检测结果不成线性的某种特定HCP的品种，最终制备的单克隆抗体制品中宿主蛋白HCP检测结果呈线性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比按重量计算。

抗体

本发明实施例所用抗体是重组抗血管内皮生长因子(VEGF)人源化单克隆抗体，下文以GB222代替，在体外哺乳动物细胞中发酵表达而得到，动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，单克隆抗体为IgG1类型，其氨基酸序列与原研药阿瓦斯汀(Avastin)相同。

细胞培养

CHO细胞作为宿主细胞，常规的细胞培养工艺进行种子细胞培养，种子细胞培养4天，细胞密度达到3～8×10⁶cells/mL时，按1:4无菌接种到含有CD>TM>6cells/mL范围内，活率大于90％。初始培养参数，温度：37℃，转速：60rpm，pH：6.8～7.2，溶氧(pO₂)：50％。培养第5天，7天，9天和11天补加4.5％(V/V)的CD>TMC>TM流加培养基，当细胞培养至第8天时，将培养温度降低至32℃，其它培养条件不变，直至细胞培养14天结束。此时细胞密度10-20×10⁶个/毫升，细胞活力80-95％，表达量：0.6-1.2mg/ml。

收集细胞培养液上清

将深层过滤膜(D0HC(货号MD0HC10FS1，厂家：默克))连接于蠕动泵后(蠕动泵选择方面只要能符合流速需求即可)，用超纯水冲洗深层过滤膜，冲洗体积为10CV。然后深层过滤缓冲液25mM Tris-HCl+100mM NaCl，pH 7.4±0.2冲洗深层过滤膜，冲洗体积为1CV，冲洗流速为100–300LMH。过滤细胞培养液并立即开始收集滤出液，过滤流速为100–300LMH。上样结束后，用深层过滤缓冲液25mM Tris-HCl+100mM NaCl，pH 7.4±0.2顶洗过滤膜并收集滤出液，冲洗体积为2CV，过程中控制膜前压力不超过2bar。

以下的实例工艺一为现有工艺，实例工艺二为本发明优化后的工艺。

实例工艺一：

粗纯工艺：Protein A亲和层析+低pH值病毒灭活

Protein A亲和层析填料为JWT 203(生产厂商：JSR)。深层过滤得到的上清液上样，流速为300cm/h，层析柱载量保证小于35mg/ml填料。上样完毕后切换至淋洗液25mMTris-HCl，50mM NaCl pH7.4以300cm/h流速冲洗层析柱5CV。之后进行洗脱操作，洗脱液为100mM乙酸-乙酸钠(pH 3.6±0.2,导电率0.9±0.2mS/cm)，流速为300cm/h。UV280进行检测，UV280读数升至0.5AU开始收集洗脱峰，再次降至0.5AU值时停止收集。样品于室温调节pH值至3.5-3.7，1-2小时进行低pH病毒灭活工序。

精纯和超滤工艺：阴离子交换层析、阳离子交换层析和超滤

精纯工艺包括阴离子交换层析和阳离子交换层析。粗纯后的样品经过精纯层析后制备原液。阴离子交换层析选取Capto Q填料(生产厂商：GE healthcare)。预平衡液(50mMTris-HCl+1M NaCl,pH 8.0)平衡层析柱2CV，之后用平衡液(50mM Tris-HCl,pH 8.0)平衡层析柱3CV，样品上样，流速为240cm/h。收集流穿UV280读数升至0.1AU开始收集洗脱峰。层析柱载量保证小于40mg/ml填料。上样完毕后切换至平衡液240cm/h流速冲洗层析柱3CV。UV280降至0.1AU停止收集。收集样品进入下一步阳离子交换层析，阳离子交换层析选取Fractogel EMD COO^-(M)(生产厂商：默克)。平衡液(50mM乙酸-乙酸钠,pH>

精纯后的样品经过超滤换液，步骤为：将型号为P3C030C05，孔径为30KD(生产厂家：默克)的超滤膜包清洗干净并用20mM磷酸钠pH6.0缓冲液冲洗至膜后端pH为6.0。将阳离子层析样品用蠕动泵泵入超滤膜进行超滤浓缩，控制进口端流速为300LMH，跨膜压力为0.3～0.7bar，初次浓缩至约20mg/ml，之后用20mM磷酸钠pH6.0缓冲液进行10倍等体积换液，结束后进行排空超滤膜回收蛋白，即为原液。各工段的样品取样检测蛋白浓度和HCP含量，见表1。

抗体浓度测定方法：

1.分光光度计比色皿冲洗干净，用超纯水作为对照，于280nm波长，进行调零；

2.用超纯水对样品进行稀释，稀释至浓度为0.1-1.0mg/mL，比色皿中加入稀释好的样品，测定在280nm的吸光值，并按照以下公式计算供试品浓度：

C＝A*N/K，

式中：C为样品浓度，

A为样品280nm的吸光值，

N为稀释倍数，

K为抗体消光系数1.66。

HCP含量测定方法：

1.依次加入约160μL/孔各梯度标准品(0-100ng/mL)和供试品于96孔低吸附板；

2.取100μL Anti-CHO:HRP于Anti-CHO coated microtiter strips；

3.用多道移液器将1微孔板中溶液转移至Anti-CHO coated microtiter strips，50μL/孔，并反复吸、吹打混匀5～10次，每个样均平行双复孔；

4.用封板膜或96孔板盖封住包被板，置于恒温孵育器或振荡器上，转速约200rpm，室温(24℃±4℃)培养2h±15min；

5.快速倒置甩去板内溶液，在干净吸水纸上倒扣停留5-10s，轻拍去残留溶液，用洗涤液，约400μL/孔，立即甩去板内洗液。重复该步骤共洗6次，最后一遍甩去板内洗液后倒扣静置30s，在干净吸水纸上轻拍去残留洗液。

6.每孔加入100μL TMB底物显色液，室温(24℃±4℃)静置30±5min；

7.每孔加入100μL终止溶液；

8.在450/650nm波长处读取吸光度值；

9.结果计算：用SoftMax Pro软件分析，以650nm作为参比波长，减去相应吸光度值，以标准品0点校零，按标准品浓度-吸光度平均值作标准曲线，用四参数拟合，根据标准曲线计算供试品浓度，样品CHO HCP浓度和残留量计算公式如下。

样品HCP浓度(ng/mL)＝供试品浓度×稀释倍数

表1:实例工艺一中各个纯化步骤之后蛋白浓度和HCP含量

上表1检测结果可以看出经过现有的粗纯工艺、精纯工艺和超滤换液得到的样品(Protein A亲和层析后样品、阴离子交换层析样品、阳离子交换层析样品、原液)的宿主蛋白(HCP)在检测过程中含量在不同的稀释倍数检测结果均出现差异，不呈线性(检测结果不呈线性时，较高的稀释倍数测定的HCP含量高于较低的稀释倍数，无法判定最终产品质量是否合格)，其中原液稀释5倍时的检测结果为368.0ppm，稀释10倍时的检测结果为622.8ppm，即在不同稀释倍数的检测结果存在差异，且经过下游层析后的原液样品宿主蛋白(HCP)的含量仍然较高，高于原液质量标准100ppm。因此不仅用药的安全性会存在风险，检测的非线性对样品检测的放行也带来一定的问题，需通过优化下游粗纯工艺即Protein A亲和层析、病毒灭活及过滤，将宿主蛋白(HCP)去除到尽可能低的范围，且检测结果呈现一致性。

在检测过程中，HCP中的某种特定HCP的品种(可能是非可溶的颗粒型)是导致检测结果不成线性的原因，病毒灭活过程中HCP等产生了一些不溶性杂质，使得蛋白溶液会出现不同程度的混浊现象(Shukla AA,Hubbard B,Tressel T,Guhan S,Low D,(2007)Downstream processing of monoclonal antibodies-Application ofplatform.Journal of chromatography.B,Analytical technologies in thebiomedical and life sciences；848(1):28-39)。

实例工艺二

小试工艺研究示例

粗纯工艺：Protein A亲和层析的优化、病毒灭活的优化和病毒灭活后深层过滤的优化

在大规模的抗体的生产中Protein A亲和层析方法是目前最为常用的。其具有极高的选择性，一步亲和层析就可以达到95％以上的纯度。本实验比较Protein A亲和层析不同填料(Protein A Diamond(博格隆(上海)生物技术有限公司产品，货号AA0133)和JWT203(JSR，货号0208GA)两种填料)对HCP的去除效果，层析柱为20ml，柱高为20cm。

实验方法：

Protein A亲和层析平衡液(25mM Tris-HCl，50mM NaCl pH7.4±0.2)平衡层析柱至出口PH不变，将样品上样载量为35mg/ml，流速为300cm/h，用相应的淋洗液淋洗层析柱5CV，之后进行洗脱液(100mM乙酸-乙酸钠pH 3.6±0.2)洗脱，当UV280吸收值大于0.5AU时开始收集洗脱峰，小于0.5AU时停止收集。洗脱完毕之后0.1M磷酸清洗3CV(保留时间16min)，之后清洗液(50mM NaOH)冲洗3CV，缓冲液平衡，超纯水冲洗2CV，保存液保持层析柱，存放于2-8℃。取样检测上样样品和洗脱收集样品的蛋白浓度和HCP含量，见表2。

表2：不同填料和淋洗液的Protein A亲和层析后样品中蛋白质浓度和HCP含量对比

表2比较了两种Protein A亲和层析填料对宿主蛋白HCP去除效果的差异，ProteinA Diamond上样宿主蛋白HCP含量578042.2ppm，洗脱宿主蛋白HCP含量1766.8ppm，可效去除327倍。JSR JWT 203填料宿主蛋白HCP含量由上样的672503ppm降至6629.7ppm，可效去除101倍。因此选择Protein A Diamond做为Protein A亲和层析工艺的填料。

Protein A Diamond填料相同时，淋洗液对洗脱样品中HCP含量的含量也有影响，淋洗液25mM Tris-HCl，50mM NaCl可有效去除372倍，淋洗液25mM Tris-HCl，500mM NaCl可有效去除219倍。淋洗液为25mM Tris-HCl，50m M NaCl的条件优于25mM Tris-HCl，500mMNaCl的条件，Protein A Diamond填料的淋洗液因此选择25mM Tris-HCl，50mM NaCl，pH7.4。

病毒灭活的优化

传统的病毒灭活和去除技术包含纳米膜过滤、低pH值孵育、巴氏消毒、S/D(溶剂/去污剂)处理、干热处理和辛酸盐处理等。哺乳动物细胞表达产物有潜在的病毒安全性风险，要求纯化工艺中有病毒清除的能力，在单抗下游工艺平台中多采用低pH值孵育进行病毒灭活，选择S/D(溶剂/去污剂)处理的方法进行病毒灭活案例较少。不管采用何种灭活方式，抗体分子在该灭活条件下必须保持稳定，否则将对药物的安全有效性产生不利影响。本实施例考察了GB222抗体分子在低pH值和S/D两种灭活条件下的稳定性。S/D为助溶剂/表面活性剂简称，本实施例中助溶剂为0.3％磷酸三丁酯，表面活性剂为1％聚山梨酯80。低pH值灭活稳定性的考察方法为将小试获得的蛋白A洗脱峰调节pH值3.0和3.3，室温放置，分别在1、2、4h取样，取样后立即滴加2M三羟基氨基甲烷调节pH值5.0左右，待检。另外，取一份蛋白A洗脱峰直接调节pH值至5.0左右作为0点对照，待检。S/D灭活稳定性的考察方法为将小试获得的蛋白A洗脱峰调节pH值至5.0左右，加入S/D并使其终浓度为0.3％磷酸三丁酯+1％聚山梨酯80，室温放置，分别在1、2、4h取样，取样后立即进行Protein A纯化以去除S/D，获得洗脱收集峰后立即调节pH值至5.0，待检。未进行S/D灭活的pH5.0的样品作为0点对照，待检。将上述所有稳定性考察获得的样品送检SEC-HPLC，结果见表3。结果显示抗体分子在低pH3.0和3.3条件下发生主峰(Main peak)向低分子量杂质(LMW)迁移，且灭活时间延长、pH越低，迁移的比例升越高，这表明抗体分子发生断裂产生片段化。而S/D灭活过程中，抗体SEC-HPLC纯度未发生明显变化，表明抗体分子稳定。综上所述，针对该抗体分子，宜采用S/D方式进行病毒灭活。

表3 GB222分子在不同灭活条件下的SEC-HPLC结果

抗体分子在常用的低pH值灭活过程中确实有稳定性不好的现象，例如产生聚合(聚合可以以聚体或颗粒物形式存在)，或产生碎片(抗体分子肽键断裂，形成低分子量杂质)。本实施例证明了GB222分子是不耐受低pH值的分子，S/D病毒灭活是替代低pH灭活的有效方式。

因此本发明针对GB222分子选择S/D病毒灭活，其过程为将蛋白A亲和层析收集峰的pH值调节至5.2±0.2，加入20×S/D至终浓度为终浓度为0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室温孵育1h。

病毒去除效果验证方法：蛋白A亲和层析收集的样品pH值调节至5.2±0.2，加入20×S/D至终浓度为终浓度为0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，向其中分别加入适量的指示病毒(异嗜鼠白血病病毒X-MuLV、病毒伪狂犬病毒PrV)病毒原液，充分混合，在20-25度孵育5分钟、15分钟、30分钟、60分钟分别取样检测病毒滴度。表4中数据可以看出采用S/D病毒灭活的方法可以达到对两种指示病毒的灭活效果高于4log₁₀以上的要求。将其病毒去除能力与低pH灭活去除能力做对比如下表格4：

表4.S/D病毒灭活能力Log₁₀

从表4可以看出采用S/D病毒灭活可以获得比低pH病毒灭活更好的病毒灭活能力。

病毒灭活后深层过滤的优化

病毒灭活的过程中蛋白的溶液环境的变化会导致蛋白溶液不同程度的混浊现象，原因是溶液中的蛋白产生了一些不溶性杂质，此时我们将再次引进深层过滤的方法，降低溶液浊度，同时可以去除不溶性杂质例如：HCP，聚体，脂类蛋白，DNA等。选择深层过滤膜X0HC(货号MX0HC23CL3，厂家：默克)和深层过滤膜A1HC(货号MA1HC23CL3，厂家：默克)进行深层过滤工艺开发，通过小试对比两种膜HCP的去除效果。

GB222病毒灭活后中间体1L，蛋白浓度：11.7g/L，宿主蛋白HCP含量1847.9ppm。选择膜面积为0.0023m²深层过滤膜X0HC和深层过滤膜A1HC两种进行实验。采用恒定流速实验即以恒定的流速使料液通过滤器，记录一定时间间隔的过滤器压降和滤液体积，当滤器的压降达到设定值时停止实验。本次实验考察深层滤器的过滤情况，在适当时间间隔记录压降，滤液体积。

实验方法如下：

1.将所需过滤器与管路连接，并在滤器上游连接压力表；

2.在容器中装入工艺中具有代表性的水、缓冲液；

3.利用泵将水打入管路，冲洗滤器以排除空气；

4.利用水或缓冲液校准泵流速，并设定实验流速。建议通量为100–300LMH。水洗10CV之后用冲膜缓冲液：50mM乙酸乙酸钠,pH 5.2冲洗1CV；

5.打入料液进行深层过滤，当料液通过滤器时开始实验；

6.待有料液流出时收集，当第一滴料液进入置于天平上的容器时开始计时；

7.当浊度贯穿或者达到压力上限时(15psi)，终止实验；

8.记录最终的压力并取样测定样品的蛋白浓度和宿主蛋白HCP含量；

9.通过蛋白浓度和过滤体积计算膜载量和得率。

表5使用A1HC和X0HC的病毒灭活后深层过滤后HCP含量对比

膜包载量(L/m²)*得率(％)**滤后HCP含量(ppm)深层过滤膜X0HC165.592.69.29深层过滤膜A1HC548.484.941.53

*：载量＝过滤体积/膜面积

**:得率＝(过滤后样品的体积*过滤后样品的浓度)/(过滤样品的体积*过滤样品的浓度)

表5中显示GB222病毒灭活后深层过滤膜A1HC和深层过滤膜X0HC载量、得率以及宿主蛋白HCP含量对比。依据结果可以看出，深层过滤膜A1HC和深层过滤膜X0HC去除宿主蛋白HCP相差较大，起始过滤样品中宿主蛋白HCP含量1847.9ppm，深层过滤膜X0HC滤后为9.29ppm，深层过滤膜A1HC滤后为41.53ppm。深层过滤对宿主蛋白具有非常好的去除效果，且由于之前的S/D病毒灭活使得部分种类HCP沉淀更加增强了去除效果。两个种类的深层过滤膜相比较由于宿主蛋白HCP杂质作为一项重要指标首先考虑，因此选择深层过滤膜X0HC作为病毒灭后的深层过滤膜。

粗纯工艺放大实验

依据小试工艺开发研究的工艺参数，对GB222分子的纯化进行放大实验。

上游细胞培养和收集细胞培养液上清操作方法如前所述。

粗纯工艺：Protein A亲和层析、病毒灭活和病毒灭活后深层过滤

Protein A亲和层析

选择Protein A Diamond(博格隆)作为亲和层析的填料，装柱体积为3.1L。层析柱平衡完毕后上样，载量小于35mg/ml，上样完毕后，淋洗液(25mM Tris-HCl，50mM NaClPH7.4±0.2电导率7.0±0.2)淋洗层析柱5CV，之后进行洗脱液(100mM乙酸乙酸钠pH 3.6±0.2)洗脱，当UV280吸收值大于0.5AU时开始收集洗脱峰，小于0.5AU时停止收集。洗脱完毕之后0.1M磷酸清洗3CV(保留时间16min)，重新平衡层析柱，平衡好后清洗液(50mM NaOH 1MNaCl)冲洗3CV，缓冲液平衡，超纯水冲洗2CV，保存液保持层析柱，存放于2-8度。

病毒灭活

Protein A亲和层析后的样品进行灭活，样品的pH值调节至5.2±0.2，加入20×S/D至终浓度为终浓度为0.3％TnBP+1％聚山梨酯80，室温孵育1h。

病毒灭活后深层过滤

病毒灭活后的样品用X0HC深层过滤膜进行深层过滤：使用前用超纯水冲洗10CV，缓冲液50mM乙酸乙酸钠，pH 5.2冲洗1CV深层过滤膜，冲洗完毕之后连接管道进行样品过滤，将样品打入深层过滤膜，流速为100-300LMH，过滤过程中检测端口压力，两个进口端压力均要求小于2bar，上样完毕后，用缓冲液50mM乙酸乙酸钠,pH 5.2冲洗1CV继续冲洗深层过滤膜2CV，并回收冲洗滤出液。

病毒灭活后深层过滤的样品经过后续精纯步骤和超滤浓缩步骤最终制备成单克隆抗体原液，精纯和超滤工艺完全同工艺一所述。该放大实验中的各个纯化步骤之后的样品中蛋白质浓度和HCP含量参见表6。

表6.放大实验各个纯化步骤之后的样品中CHO宿主蛋白检测结果数据

表6列出了经过粗纯工艺二放大实验HCP检测结果，通过表中数据可以看出经过优化后的工艺可以大大降低HCP的含量，经过以上工艺HCP含量可以从4～5×10⁵ppm降低至2.3ppm。HCP的含量降低后不同稀释倍数检查结果无明显差异，说明对HCP检测产生干扰的某种特定种类的HCP经过本发明方法的Protein>

综上所述，与现有单克隆抗体下游纯化过程相比本发明通过采用病毒灭活后深层过滤步骤，同时优化Protein A亲和层析和和病毒灭活后深层过滤大大地提高了HCP的除去效果。本发明的实施例方法针对GB222分子经过优化的粗纯工艺(Protein A亲和层析、病毒灭活和病毒灭活后深层过滤)能够非常强健、有效地去除GB222样品中的HCP，经过放大验证后HCP含量可以降低至2.3ppm，远低于100ppm内控指标说明本工艺的有效性。本发明的方法中病毒灭活后深层过滤得到的GB222样品经进一步的阴离子交换层析和阳离子交换层析后HCP含量可以降低至0.4ppm，最终超滤浓缩制得的单克隆抗体原液中HCP含量可以降低至0.3ppm，并且HCP含量检测结果呈线性。另外，本发明病毒灭活采用S/D方法对GB222样品进行灭活，通过病毒验证试验显示指示病毒的灭活效果高于4log₁₀以上的要求。

以上是根据本发明的优选生产形态通过实例对本发明进行了没有限制的描述，但是应当理解，在所附权利要求书定义的范围内，专家可以做变化和/或变型，而不脱离相关的保护范围。