一套用于柳树优良品种遗传鉴定的专用引物及其应用

摘要

本发明公开了一套用于柳树不同品种遗传鉴别的专用引物及其应用，该方法针对国家林业局已经授权的柳树优良品种，开发出了16对用于柳树不同品种鉴定的微卫星引物。利用本发明的柳树专用引物，进行柳树不同品种遗传鉴定，鉴定方法操作简单、高效，鉴定的准确率高，为柳树不同品种真实性鉴定提供了可靠技术手段。本发明将为柳树良种的使用提供重要的监督检验方法，其应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

本发明属于柳树品种鉴定技术领域，涉及一套基于柳树遗传物质，对柳树不同品种进行遗传鉴定的专用引物及其应用。

背景技术

柳树属于杨柳科(Salicaceae)植物，是柳属(Salix)和钻天柳属(Chosenia)的通称。柳树栽培历史悠久，在柳编、造林绿化和生物能源等方面都有广泛的应用。此外，柳树还具有以下优点：①柳树易成活，具有早期速生、适应范围广；②无性繁殖容易、木材利用价值较高；③对土壤肥力无破坏等特点。因此，柳树对于缓解木材供需矛盾、水土流失防护等方面发挥着非常重要的作用。优良品种的选育和推广用是速生、丰产的基础，在我国长期的栽培历史过程中，培育出了许多优良品种，目前已广泛投入到了生产中。生产上，为保持亲本的优良性状，一般采用扦插苗造林。因此，柳树产业发展中，建立准确可靠的不同优良品种遗传真实性鉴定技术，是一个急需解决的难题。

植物品种遗传真实性鉴定的关键是所依赖的技术手段。传统的柳树品种鉴定是基于形态特性，比如柳树树冠特性、叶片的形态、花的形态以及生长习性等。但柳树品种间在形态上的差异，特别是苗期的差异，往往并不显著。许多性状的差异一般到了成熟期才能表现出来。近些年，随着分子生物学技术的发展，利用分子标记指纹图谱直接反映基因组水平上的差异，成为当今有效、快捷的品种鉴定技术。并在许多植物新品种鉴别中得到了广泛应用。分子标记技术直接以植物DNA为分析对象，从根本上克服了环境的影响，同时也不受基因表达的限制，在DNA水平上进行品种真实性鉴定不仅可靠性高，而且大大提高了检测效率。分子标记指纹图谱技术主要有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism，限制片段长度多态性)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA，随机扩增多态性)、AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段长度多态性)、SSR(SimpleSequence Repeat，简单序列重复)、SNP(Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态性)等。

运用分子标记对植物品种进行真实性鉴定需要考虑以下因素：1.简便、快速，易于在实际检验工作中推广使用；2.标记针对待检物种有高度特异性，使检测结果不受内源和外源微生物或病原菌影响；3.标记扩增基因位点多态性高，可以利用较少的引物组合达到较高的检测精度。考虑上述要求，微卫星标记是目前不同标记类型中，用于植物品种真实性鉴定的最高效的分子标记。微卫星DNA也称简单重复序列，是基因组中变异最为迅速的序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。微卫星标记是基于PCR扩增为基础的标记，微卫星标记分析相对于基于分子杂交为基础的标记更为简便、快速。同时微卫星引物是由待检物种的基因组序列开发而来，具有极高的种属特异性，这样既使样品中含有不同的内源和外源微生物或病原菌污染，检测结果也不会受到干扰，这一优点是RAPD或AFLP等这类随机标记所不具备的。

柳树不同品种间同一位点的SSR重复次数存在差异，造成了个体间等位位点的长度多态性。根据微卫星序列两端的互补序列来设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于微卫星串联重复数目不同，通过扩增片段的电泳分离，可以获得不同微卫星位点的基因型以及基因型频率信息。

发明内容

发明目的：针对现有柳树品种真实性鉴别技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种用于柳树不同品种遗传鉴定的专用引物，为柳树品种保护、把好种苗质量关提供关键技术支撑。本发明的另一目的是提供一种上述专用引物的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一套用于柳树不同品种遗传鉴定的专用引物，其特征在于，各引物序列如下表所示：

柳树品种包括25个柳树优良品种，具体为：苏柳485，苏柳52-2，金丝垂柳J1011，金丝垂柳J1010，杞簸柳JW9-6，苏柳J795，苏柳J799，苏柳J172，簸杞柳JW8-26，花叶柳，银芽柳J1037，银芽柳J1050，银芽柳J1052，银芽柳J1055，银芽柳J887，苏柳932，渤海柳1号，渤海柳2号，渤海柳3号，渤海柳4号，盐103号，‘旱沙王’北沙柳，旱柳，沙柳，黄柳。

一种应用所述的专用引物鉴定柳树品种的方法，以待鉴定柳树样品的DNA和已知品种的柳树DNA为对照模板，选取序列表中任一引物对，进行PCR扩增获得产物，对产物进行毛细管凝胶电泳；对比待检样品和已知品种的指纹图，若基因型不同，则排除待鉴定样品为已知品种；若基因型相同，可选用序列表中的其它引物对检测结果进行确定；根据多个引物的检测结果，查基因型频率表相应品种在相应引物位点上的基因型频率，计算出鉴定结果的准确率；其中，基因型频率如下所示：

所述的应用专用引物鉴定柳树品种的方法，PCR反应体系为：模板DNA40ng，0.01uLdUTPs，1.5mg BSA，上下游引物各10pmol，0.4uL Taq DNA聚合酶，1.5uL含20mM MgCl2的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应体积到15uL。

所述的应用专用引物鉴定柳树品种的方法，PCR反应条件为：94℃预变性4min45s；10个TouchDown循环：94℃变性30s，59℃到50℃退火30s，72℃延伸30s；然后进行25个常规PCR循环：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s；72℃延伸5min。

本发明用国家审定的25个柳树优良品种的DNA模板，在专用引物对引导下进行PCR扩增，采用ABI 3730和GeneMapper分析软件进行基因型分析，根据不同品种在不同引物位点获得的基因型及鉴别能力选择引物。对待测样本进行检验时利用高分辨率的毛细管电泳得到长度多态性条带，通过GeneMapper分析软件获得基因型区分是否为同一品种。

有益效果：与现有技术相比，本发明的突出优点开发了一套用于柳树不同品种遗传鉴定的专用引物，鉴定方法操作简单、快捷，鉴定的准确率高，检测结果可靠、稳定。本发明将为柳树优良品种的使用提供可靠的监督检验方法，应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1是引物W46-460对标准样品与待检测样品基因组DNA的毛细管电泳指纹图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。下述实例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用引物合成工作由上海捷瑞生物技术有限公司完成。

实施例1

微卫星引物是基于簸箕柳全基因组序列获得的大量微卫星序列开发而来，采用Primer Primer 5.0程序批量设计引物，GC含量在40％-60％之间，理论退火温度在50-65℃之间，产物预测长度在100-500bp之间，引物内不出现二级结构。以往的生物信息学分析发现微卫星可分为两大类：长度≥20bp的SSR为第一类，长度大于12bp但小于<20bp的为第二类(Temnykh et al.，2001)。与第二类SSR相比，第一类SSR具有更高的多态性。这一规律是Weber(1990)最早于人类的微卫星实验数据中发现，并已在很多生物体中得到证实。根据以上生物信息学结果，选取130对微卫星引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成。利用合成的引物和柳树DNA进行PCR扩增，用1％的琼脂糖凝胶电泳对这130对SSR引物进行初步筛选，选出的扩增产物清晰的引物对。

对这些选出的扩增产物清晰的引物对，进一步利用6个不同柳树品种DNA模板进行PCR扩增，对引物的多态性进行检测。首先利用ABI3730对扩增产物进行电泳检测，然后利用GeneMapper基因型分析软件对获得的电泳谱带进行基因型分析，对每一引物具有相同扩增谱带的品种进行基因型合并，统计获得的基因型数。根据引物扩增位点的多态性信息对引物的鉴别能力(Power ofDiscrimination)进行了估算：PD＝1-∑Gi²，式中Gi为该位点第i个基因型的频率。根据毛细管电泳谱带和引物扩增位点的PD指数，筛选出了16对电泳指纹清晰、基因型容易判定、鉴别能力高的引物，分别是：W-254-1，W-46-460，64-41，64-65，64-255，64-272，64-286，64-293，64-311，253-12，253-17，253-38，253-47，W-292-5，253-22，W-265-23，用于柳树不同品种遗传鉴定，具体引物如表1所示，对应引物的PD指数分别为：0.90，0.93，0.87，0.95，0.82，0.88，0.94，0.91，0.92，0.70，0.93，0.76，0.84，0.85，0.85，0.90。

表1 专用引物序列详情表

名称上游引物(5’-3’)下游引物(3’-5’)W254-1AACATTCTGCTTCTTCCTTTAACCTCCATTACCATCCATAW46-460AAGCAAGCAAAAGTCAAGAGAGTATGCCAAGCAAGAAGAAW64-41TCAGAGCCTGGTTCATAAACAAATGCCAGAGCTAAAW64-65GCATACTTGGGCGTTGATTGACTTGGGTTGGGTTTTW64-255GTCTGAACCCTCATCTATCTGGAATCCATAATACACW64-272TCACTTGCCGCCCTTCTTTGACGCCGCTGTAACCACW64-286AAAGAATACATTTTAGGTGGATTTCAAGGTTCAATCAAGTTAW64-293GCAAAAGCCAAAAGGAGAAACCAGCAGAGGAAAGTGW64-311AGAGCAAAGCACATTTCAATACATCTACTGCCACCCW253-12ATCAAATCACGCTAATCCAACAAGAAAGCAACATCGW253-17ATTGAATGGGCACTAACCGCACTTCCACCTACCTCCW253-38CCCACCAAAGCGTCTGTCCGAGTTGTTGGGCTGGATW253-47TTATTGCTGGAAAGGTTGTTCGTGTCTTTAGGGTCTW292-5AAAGAAGGCAAACAAAGCAAAACAGCGAAAGAAGCAAAW253-22GCCTCTGTTCCCATGACCTGAGGACTGGAGCGGATTW265-23TGGGAGGAGTGTCAGAAGCTCCATAACAACCAGCAA

利用筛选出的16对引物，对国家林业局授权的25个柳树优良品种进行基因型检测。具体方法如下：

DNA提取参照Porebski(1997)的方法，从新鲜幼嫩的柳树叶片中提取DNA。然后以此为模板，利用筛选得到的16对引物在ABI-9700热循环仪上进行PCR扩增。PCR的总反应体系为15uL，反应体系包括：模板DNA 40ng，0.01uL dUTPs(1mM)，1.5mg BSA，上下游引物各10pmol，0.4uL Taq DNA聚合酶，1.5uL含20mM MgCl₂的10×buffer，加灭菌去离子水补充反应体积到15uL；PCR反应条件为：94℃预变性4min>

用每一种基因型所含的个体数除以检测个体的总数，就可以得到每一个体的基因型在某一微卫星位点的基因型频率。如采用引物i，某一个体基因型在检测个体中的出现频率为G_fi，则采用16对引物，该个体与该个体用所有16个微卫星位点都扩增出相同指纹图的概率为：

式中G_fi为某一个体用第i引物所揭示的基因型频率。本专利检测的柳树不同品种用在相应位点的基因型频率见表2。表中每一品种与对应引物单元格内的数字为该品种在相应引物位点的基因型频率。

表2 25个柳树良种基因型在对应引物位点的基因型频率

表中，基因型频率中的1为W254-1，2为W46-460，3为W64-41，4为W64-65，5为W64-255，6为W64-272，7为W64-286，8为W64-293，9为W64-311，10为W253-12，11为W253-17，12为W253-38，13为W253-47，14为W292-5，15为W253-22，16为W265-23；概率是指不同品种在16个微卫星位点上都出现相同基因型的概率。

实施例2

利用实施例1筛选的引物，对国家林业局南方林木种苗检验中心提供的5个柳树样品(N1，N2，N3，N4，N5)进行检测，这5份材料中有一份样品为苏柳J795，检测前提供的样品均为匿名，要求利用本专利引物鉴定出哪份样品为苏柳J795，检测结果与国家林业局南方林木种苗检验中心对样品的原始记录进行比对，验证检测结果是否与实际情况相符。在实验过程中采用苏柳J795标准样品为PCR扩增对照。扩增反应体系及扩增条件同实施例2。

首先从表1中随机选择引物W46-460对样品进行了PCR扩增，扩增结束后，对扩增产物用毛细管电泳检测和GeneMapper进行与J795标准样品的指纹图进行比对，结果如图1。待检5个样品中只有N5与苏柳J795有相同基因型，其它几份样品均与苏柳J795的指纹图不同，因此其它4份样品为苏柳J795可能性均可排除。用其它15个引物对鉴定结果进行了确证。待检样品N5在其它15个微卫星位点与苏柳J795也具有相同的指纹图。根据表2苏柳J795在不同微卫星位点的基因型频率，随机样品在所有16个位点上出现相同基因型的概率为6.67953E-18，即在自然状态下非该品种无性繁殖出的个体和该品种具有相同基因型的可能性趋近于0。判定待检样品N5为国家审定的柳树良种苏柳J795。国家林业局南方林木种苗检验中心样品原始记录显示N5为苏柳J795，本方法的鉴定结果与实际情况完全相符，证实了本专利包含的引物应用于实际的柳树品种遗传鉴定中的可靠性，是柳树良种种苗监督检验的有力工具。